《Journal of Advanced Research》：ACOD1–itaconate axis activation attenuates coagulopathy and improves neurological outcomes after traumatic brain injury by suppressing neutrophil extracellular trap formation
创伤性脑损伤（TBI）后凝血功能障碍与低氧血症相关，并导致患者死亡率升高。多组学分析揭示中性粒细胞胞外诱捕器（NETs）驱动TBI后凝血功能紊乱。ACOD1–衣康酸轴是TBI后NETosis的关键内源性抑制通路。低氧抑制ACOD1–衣康酸通路，加剧NET形成。外源性衣康酸可减轻凝血功能障碍并改善神经功能结局。
创伤性脑损伤（TBI）是全球最常见的致命性神经系统急症，幸存者常遗留长期残疾，降低生活质量并给照护者和医疗系统带来沉重负担。TBI触发的病理过程超出原发性机械损伤范畴，还包括神经炎症、氧化应激、血脑屏障（BBB）破坏、代谢失调、凝血功能障碍和兴奋性毒性等广泛的继发性损伤。约三分之二的TBI患者入院时存在不同程度的凝血异常，包括出血时间延长、进行性出血以及血栓形成前的高凝状态。关键在于，这种低凝与高凝状态并存显著增加了TBI后死亡和不良结局的风险。新兴证据支持炎症诱导的凝血激活（“免疫血栓形成”）作为连接凝血功能障碍与TBI的基本致病机制。因此，阐明TBI后凝血功能障碍的机制对于提高生存率和神经功能恢复至关重要。
TBI后凝血功能障碍的潜在机制包括免疫炎症反应、血小板功能障碍、内源性凝血与抗凝因子失衡以及内皮细胞活化。越来越多证据表明免疫系统与凝血系统之间存在复杂的调控互作。中性粒细胞是最早浸润损伤脑组织的免疫细胞之一，桥接外周与中枢免疫反应，是免疫血栓形成的关键驱动因素。早期浸润的中性粒细胞形成中性粒细胞胞外诱捕器（NETs），这是一种由DNA和蛋白质组成的网状结构，通过NETosis过程包裹病原体。过度NETosis与内皮损伤、血栓形成和凝血功能障碍相关。在其他形式的脑损伤（如脑出血和缺血性卒中）中，NETs的存在与不良结局密切相关，提示过度NETosis可能促进TBI后继发性损伤。事实上，NETs被广泛认为是TBI后病理的关键驱动因素。近期研究进一步表明，TBI急性期中性粒细胞凋亡延迟增强NET形成，这些NETs通过磷脂酰丝氨酸和组织因子结合凝血因子促进凝血，导致高凝状态。这些发现强调了NETs在TBI相关凝血功能障碍中的核心作用，并提示NETs作为潜在治疗靶点。然而，调控NETosis的上游机制，特别是关键调控代谢通路，仍很大程度上未被探索。
近期进展凸显了细胞代谢重编程在调控免疫细胞功能中的关键作用。鉴于NETosis是一个与代谢通路密切相关的耗能过程，代谢检查点可能调控TBI后过度NET形成。因此，本研究利用患者数据库、TBI小鼠模型和细胞培养系统，探究靶向免疫代谢通路是否调控TBI诱导的NETosis和凝血功能障碍，旨在揭示新的调控机制并确定TBI相关凝血功能障碍和继发性脑损伤的潜在治疗策略。
患者数据来自重症监护医学信息数据库IV（MIMIC-IV，版本3.1），包含2008至2019年间贝斯以色列女执事医疗中心（美国马萨诸塞州波士顿）ICU收治的190,000余名成年患者的去标识化临床数据。所有患者身份通过唯一随机标识符保护，马萨诸塞理工学院机构审查委员会授予伦理豁免。首次因TBI入住ICU的所有患者被视为候选对象。排除标准包括：（1）<18岁；（2）ICU停留时间超过24小时；（3）严重肝病、肾病或恶性肿瘤；（4）缺乏凝血相关参数记录，包括国际标准化比值和部分凝血活酶时间。凝血功能障碍定义为部分凝血活酶时间>42秒和/或国际标准化比值>1.2。根据这些标准，纳入队列的TBI患者分为创伤性凝血功能障碍组和非创伤性凝血功能障碍组。
SPF级雄性C57BL/6小鼠（25±3 g）购自上海斯莱克实验动物公司。TBI建模实验仅使用雄性小鼠以排除动情周期对神经元存活和行为的影响。ACOD1敲除（KO）小鼠购自杰克逊实验室（RRID: IMSR_JAX:029340）并在本机构繁育。所有小鼠单独饲养于SPF级动物实验室，温度（24–25°C）、湿度（55%）和光周期（12小时明/12小时暗）受控，自由获取食物和水。所有动物实验按照ARRIVE指南设计、实施和报告。样本量根据预实验数据和3R原则确定。小鼠使用随机数生成器随机分配至实验组。所有手术操作和结局评估由对分组不知情的研究人员进行。所有努力尽量减少痛苦，包括手术过程中使用麻醉，并按照机构指南实施人道终点。
实验性TBI通过控制性皮层撞击诱导。简言之，小鼠在开颅前使用3%异氟烷麻醉。随后使用2-mm撞击器（Brain and Spinal Cord Impactor, 68099H, RWD Life Science）以5 m/s速度、3.0 mm深度、100 ms停留时间直接撞击大脑皮层。撞击目标为前囟后2.5 mm、中线右侧2.5 mm。假手术组小鼠接受开颅但不行撞击操作。控制性皮层撞击在无菌条件下进行。麻醉使用3%异氟烷（与氧气混合）诱导和维持。手术和恢复期间使用加热垫维持体温37±0.5°C。术后小鼠置于温暖恢复笼中，每日监测疼痛、痛苦或感染迹象。为避免对炎症反应的混杂影响，术后不使用镇痛药。人道终点包括无法进食或饮水以及体重减轻超过基线体重的20%；研究期间无小鼠达到这些标准。既往研究报道炎症通常在TBI后72小时达峰，研究人员发现TBI后24至72小时凝血功能障碍严重程度无显著差异。因此，除非另有说明，小鼠在TBI后72小时检查以尽量减少动物使用。部分TBI模型小鼠在TBI建模后30分钟、1天和2天经尾静脉注射抗Ly6G抗体（BioXcell, BP0075-1, 10 mg/kg）或DNase I（New England Biolabs, M0303L, 10 mg/kg）（TBI+L和TBI+D组），而假手术组和TBI组在相同时间点经相同途径接受等体积生理盐水。另一组小鼠在TBI后10分钟腹腔注射4-辛基衣康酸（4-OI）（MedChemExpress, HY-112675, 50 mg/kg）（TBI+4-OI组）。4-OI给药方案基于预实验结果和既往研究确定。本研究经福建医科大学实验动物伦理委员会批准（批准号IACUC FJMU 2023-Y-0052；2023年3月3日），按照《实验动物护理和使用指南》（第8版，国家研究委员会，2011）进行。
对假手术组和模型组小鼠TBI后1天和3天进行蛋白质组学分析。颈椎脱臼后，收集损伤侧（或假手术组对应侧）脑组织样本，用冰冷磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗去除血液，液氮研磨，与裂解缓冲液混合，超声破碎。裂解液在4°C下12,000×g离心10分钟，BCA法测定上清总蛋白浓度。各组等量蛋白用20% TCA沉淀，4,500×g离心5分钟。蛋白沉淀用丙酮洗涤，胰蛋白酶过夜消化，与终浓度5 mM二硫苏糖醇在56°C混合30分钟，然后加入终浓度11 mM碘乙酰胺在室温暗处烷基化15分钟。最后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。肽段溶于流动相A，使用Nano Elute超高效液相色谱系统分离。质谱数据以平行积累-连续碎裂模式采集。
单细胞cDNA文库由CapitalBio Technology（北京）使用单细胞3′文库和Gel Bead Kit V3.1（10x Genomics, 1000121）及Chromium Single Cell G Chip Kit（10x Genomics, 1000120）构建。首先使用Countstar细胞活力分析仪测量细胞直径和活力，然后按照制造商方案将细胞悬液加载到Chromium单细胞控制器（10x Genomics）上。捕获的细胞被裂解，释放的RNA在单个GEM中条形码标记。为确保分子稳定性，RNA条形码标记后进行cDNA合成。使用S1000TM Touch Thermal Cycler（Bio-Rad）进行逆转录，条件为：53°C 45分钟，85°C 5分钟，然后4°C保持。使用Agilent 4200 TapeStation系统评估产物cDNA质量。文库使用Illumina Novaseq6000测序仪以双端150 bp（PE150）策略测序。细胞类型标记基因使用SingleR注释。细胞类型间的差异表达基因（DEGs）使用presto包（v1.0.0）鉴定，并使用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析注释。数据集中的细胞间通讯使用CellChat包（v1.6.1）检查。
使用RNA Simple Total RNA Kit（天根生化科技，DP419）从皮层脑组织提取总RNA并逆转录为cDNA。使用S1000 Thermal Cycler（Bio-Rad）通过PCR测量靶基因表达水平。相对基因表达水平以GAPDH归一化，使用2–ΔΔCt法计算。引物序列见表S2。
首先使用BCA试剂盒（碧云天，P0012）测定脑组织和bEnd.3细胞提取的蛋白浓度。等量蛋白（每泳道25 μg）经SDS-PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯膜，与以下一抗孵育：抗Ly6G（Thermo Fisher Scientific, MA5-51254）、抗citH3（Abcam, ab281584）和抗ACOD1（Abcam, ab222411）。用含0.1% Tween 20的PBS（PBST）洗涤三次后，膜与辣根过氧化物酶偶联IgG（Thermo Fisher Scientific, 31466）孵育。使用ECL Western Blotting Detection Kit（Millipore, WBKLS0500）可视化免疫标记。使用UN-Scan-It6.1软件（Silk Scientific Inc.）从凝胶图像测量目标条带密度（灰度值）。表达水平以GAPDH（Thermo Fisher Scientific, MA5-35235）和actin（Thermo Fisher Scientific, MA5-32479）归一化。
甲醛固定标本石蜡包埋，切成4-μm厚切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，微波柠檬酸缓冲液加热抗原修复。切片与抗纤维蛋白-α（Abcam, ab92572）在26°C孵育2小时，洗涤后与二抗（Abcam, ab97080）在26°C孵育30分钟。阴性对照不加一抗。细胞核用二氨基联苯胺（索莱宝，北京，中国）复染，苏木素（索莱宝，北京，中国）再染色。纤维蛋白-α表达水平由免疫反应评分（IRS）基于阳性细胞比例和染色强度评定。阳性细胞比例评分：0（无阳性细胞）、1（≤10%阳性细胞）、2（10%–50%阳性细胞）、3（≥50%–80%阳性细胞）、4（>80%阳性细胞）；染色强度评分：0（无颜色反应）、1（弱）、2（中）、3（强）。IRS评分为阳性细胞比例评分与染色强度评分的乘积（范围0–12）。染色切片由两名未参与实验且对治疗历史不知情的10年以上经验病理学家审阅和评分。分歧通过病理学家讨论解决。除免疫组化染色外，使用商业酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测量血浆D-二聚体和纤维蛋白原水平以评估全身凝血功能。
甲醛固定标本石蜡包埋，切成4-μm厚切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇复水，加热抗原修复，与抗Ly6G（Thermo Fisher Scientific, MA5-51254）、抗citH3（Abcam, ab281584）、抗TM（Thermo Fisher Scientific, PA5-120883）、抗TSP-1（Thermo Fisher Scientific, PA1-29196）、抗CD31（Thermo Fisher Scientific, MA5-37858）和抗纤维蛋白-α（Abcam, ab92572）在4°C孵育过夜。随后切片与二抗（Thermo Fisher Scientific, A-21071, A27034）孵育，DAPI（Sigma-Aldrich, #D9542）复染。使用荧光显微镜（Leica, Wetzlar, Germany）捕获代表性图像。
使用ELISA试剂盒测量血浆NETs（JONLNBIO, JL47089）、血浆D-二聚体（JONLNBIO, JL20160）、血浆纤维蛋白原（JONLNBIO, JL20600）、内皮细胞血管内皮钙黏蛋白（VE-cadherin）（MLBIO, ML037274）和血管性血友病因子（VWF）（JONLNBIO, JL20631）。使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific）在450 nm测量光密度。
使用结晶紫染色法评估中性粒细胞黏附能力。在指定条件下处理后，小心吸去细胞培养上清，每孔加入50 μL 100%甲醇室温固定10分钟。去除固定液后，每孔加入50 μL结晶紫染色液（C0121，碧云天）孵育5分钟。染色后，自来水轻轻冲洗去除未结合染料，室温过夜风干。次日，每孔加入100 μL 100%甲醇提取细胞内结晶紫。使用酶标仪（Thermo Fisher Scientific）在570 nm测量每孔光密度（OD）。
从损伤（同侧）侧提取脑组织，使用湿干重法评估脑水肿严重程度。去除组织表面多余水分后立即测量同侧半球湿重。切除的半球置于100°C烤箱24小时后重新称重。水肿计算公式为（湿重?干重）/湿重×100%。使用伊文思蓝试验（Sigma-Aldrich, 314-13-6）评估BBB通透性。经颈静脉注射伊文思蓝（2%，4 mL/kg），2小时后处死动物。取出大脑，称重，用三氯乙酸匀浆，离心。使用分光光度计（UV-1800 ENG 240 V；Shimadzu Corporation）在620 nm测量各样本吸光度。根据标准曲线评估伊文思蓝含量，以μg/g脑组织表示。
通过一系列运动和反射测试评估神经功能损害，得出改良神经功能严重程度评分（mNSS），范围0–18，评分越低表示神经功能损害越轻。mNSS评估在损伤后3天由对分组不知情的研究人员进行。
进行旷场试验评估小鼠TBI后运动活性、探索行为和焦虑样反应。装置为50 cm×50 cm×40 cm方形场地，分为16个等大方格。中央四个方格定义为中央区，其余12个方格为外周区。测试前，小鼠适应测试房间以减少应激反应。正式测试时，每只小鼠自由探索5分钟，自动视频跟踪系统记录整个场地总距离、中央区距离和进入中央区次数。
使用商业分离试剂盒（索莱宝，P8550）按照制造商说明从小鼠骨髓分离中性粒细胞。简言之，处死小鼠，无菌收集股骨和胫骨。修剪骨骼两端暴露骨髓腔，用含10%胎牛血清（FBS）的培养基冲洗收获骨髓细胞。制备2×10?至1×10?细胞/mL单细胞悬液，小心层叠到离心管中由试剂A和试剂C预建立的梯度上。室温1,000×g离心20分钟，收集含中性粒细胞的下层。细胞用PBS洗涤，250×g离心10分钟，重悬于培养基用于后续实验。
从野生型（WT）和ACOD1 KO小鼠分离原代中性粒细胞，重悬于RPMI-1640培养基（Thermo Fisher Scientific, 12633020）中1–2×10?细胞/mL，37°C 5% CO?培养。通过qPCR和western blotting验证ACOD1敲除效率。然后裂解细胞，ELISA测量衣康酸浓度。为诱导NET形成，中性粒细胞用100 nM佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）（MedChemExpress, HY-18739）刺激3小时。低氧实验：细胞在低氧条件（1% O?）37°C培养3小时。衣康酸处理实验：在低氧暴露或PMA刺激前5分钟向培养基加入125 μM 4-OI，然后在相应干预条件下孵育3小时。PMA和低氧干预时间点的选择基于预实验结果。选择3小时作为最早测量时间点，基于预观察到的强PMA诱导NET形成和同时明显的低氧诱导ACOD1表达抑制。该时间点也确保联合干预（低氧+PMA）与单独干预（PMA或低氧）持续时间相同。小鼠脑内皮细胞系bEnd.3（Abiowell, AW-CCM025）维持在完全Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM, Abiowell, AW-MC006）中，由DMEM基础培养基加NaHCO?（1.5 g/L）补充10% FBS和1%青霉素/链霉素，在37°C 5% CO?和95%空气的湿润气氛中培养。为研究中性粒细胞与内皮细胞间的相互作用，bEnd.3细胞与分离的中性粒细胞在含白细胞介素（IL）-1β（25 pg/ml, NovoProtein, C042）的相同DMEM中共培养24小时。NETs通过400 nM PMA刺激小鼠原代中性粒细胞3小时生成，并按先前描述分离。
细胞沉淀在液氮中冷冻1分钟然后解冻。三次冻融循环后，样品在冰水浴中超声10分钟。取120 μL裂解液与480 μL含1.25×内标的甲醇混合，涡旋，冰水浴超声15分钟，?40°C孵育1小时。4°C 12,000 rpm离心15分钟（离心机：Thermo Fisher Scientific，美国）后，收集70 μL上清用于LC-MS/MS分析。色谱分离在配备Atlantis Premier BEH Z-HILIC柱（1.7 μm, 2.1×150 mm, Waters，美国）的超高效液相色谱系统（Agilent 1290 Infinity II, Agilent，美国）上进行。流动相A为含10 mmol/L乙酸铵的10%乙腈水溶液，流动相B为含10 mmol/L乙酸铵的10%水乙腈溶液。自动进样器温度6°C，进样体积1 μL。质谱分析在三重四极杆质谱仪（SCIEX Triple Quad 6500+, AB Sciex，美国）上以负电喷雾电离模式和多反应监测（MRM）进行。离子源参数：帘气35 psi，离子喷雾电压?4500 V，温度400°C，离子源气1 50 psi，离子源气2 50 psi。数据采集和分析使用Analyst 1.7.32（SCIEX，美国）和BioBud v2.0.3（BIOTREE，中国）软件。最终浓度以总蛋白含量归一化，表示为nmol/g蛋白。
使用DNA染料SYTOX检测中性粒细胞胞外NET积累。简言之，中性粒细胞用4%多聚甲醛（PFA）固定，PBS洗涤，与0.25 μM SYTOX（Thermo Fisher Scientific, S7020）加DAPI（Sigma-Aldrich, #D9542）在37°C 5% CO?气氛中孵育30分钟，荧光显微镜（Leica, Wetzlar）检查。
各组中性粒细胞接种到预涂多聚-L-赖氨酸的盖玻片上，用2.5%戊二醛的0.1 M磷酸缓冲液4°C固定2小时。PBS洗涤后，细胞在含1%四氧化锇和1%单宁酸的溶液中室温后固定1小时。随后梯度乙醇系列（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%，各10分钟）脱水，使用六甲基二硅氮烷临界点干燥。干燥样品使用离子溅射镀膜机（Hitachi）溅射涂覆5 nm碳层。使用Hitachi SU8010场发射扫描电子显微镜在5 kV加速电压和8 mm工作距离下成像。
使用核磁共振（NMR）光谱进行非靶向代谢组学分析。假手术组、TBI-1天和TBI-3天小鼠同侧半球脑组织在液氮中速冻并保存于?80°C。简言之，组织样本转移到管中（含1.4 mm陶瓷球；MP Biomedicals LLC, Santa Ana, CA, USA）以获取代谢物，然后每管加入400 μL冰甲醇和200 μL Milli-Q H?O，使用Precellys 24匀浆器匀浆。4°C 13,000 rpm离心45分钟后，收集上清并蒸发（Eppendorf Concentrator Plus, Hamburg, Germany）获得干燥代谢物沉淀。NMR实验时，样品重新溶解于500 μL NMR缓冲液（0.08 M Na?HPO?, 5 mM TSP, 0.04% NaN?的D?O溶液，pH 7.4）。使用Bruker Avance III HD 600-MHz NMR光谱仪配备TXI探头进行1H NMR代谢谱分析。为采集水抑制的1H 1D NMR谱，使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列（cpmgpr1d, 512次扫描，F1 73,728点，光谱宽度12019.230 Hz，1024次瞬变，弛豫延迟4秒）。化学位移参考内部3-(三甲基硅基)丙酸-2,2,3,3-d4钠盐（TSP）信号。NMR光谱数据按先前描述处理。简言之，数据在Bruker Topspin 4.0.2版本中使用自由感应衰减（FID）的一维指数窗乘法、傅里叶变换和相位校正处理。NMR数据导入Matlab2014a。TSP用作化学位移参考内标（设为0 ppm）；水、TSP和甲醇信号周围区域被排除。光谱通过搜索约500种代谢物数据库鉴定差异代谢物。代谢物鉴定和注释数据库主要来自人类代谢组数据库。对每种定量代谢物，选择无干扰信号的特征峰。定义限制峰范围起点和终点，通过求和各点值积分峰面积。
在各实验终点，小鼠用3%异氟烷吸入麻醉（诱导后维持1.5–2%）。确认无疼痛反射后，使用预肝素化（100 IU/mL）1 mL注射器经心脏穿刺收集约0.5–0.8 mL血液。抽血后立即将针头插入橡胶塞防止空气暴露。样品在10分钟内使用GEM Premier 3000血气分析仪（YUYANBIO）及相应一次性 cartridge 分析。每次使用前，仪器按制造商说明进行两点校准和质量控制测试。
使用定制LSCI系统（武汉SIM Opto-technology Co.）在体测量微血管血流。小鼠用1.5%异氟烷吸入麻醉，固定于立体定位架，切开头皮暴露颅骨。激光波长785 nm，曝光时间10 ms。成像区域包括开颅前（基线）、开颅后5分钟以及损伤后1天和3天皮层损伤灶周围微血管区域。LSCI用于观察开颅前后及损伤后（1天和3天）撞击灶周围毛细血管区域相对血流值。模型诱导前记录局部脑血流作为基线值。
MIMIC-IV数据库连续变量若正态分布以均值±标准差表示，非正态分布以中位数（四分位距）表示。正态分布连续变量用独立样本Student's t检验比较，非正态分布变量用Mann-Whitney U检验比较。分类变量以频率（百分比）汇总，酌情使用卡方检验或Fisher精确检验比较。构建Kaplan–Meier生存曲线评估凝血功能障碍与TBI后7天和30天全因死亡率的关联，组间差异用log-rank检验评估。进行中介分析检验凝血功能障碍与TBI患者死亡率的关系是否由肺泡-动脉氧梯度（A-aDO?）中介。除非另有说明，所有细胞培养和动物模型实验进行三次以上，以均值±标准差表示。两组比较用Student's t检验，多组用单因素或双因素方差分析加Tukey事后检验。所有统计检验使用R（版本4.2.1；R Foundation, Vienna, Austria）进行，P值<0.05认为有统计学意义。
结果
3.1. TBI后凝血功能障碍与缺血-低氧相关并增加死亡率
从MIMIC-IV数据库共纳入1290例符合预设纳入和排除标准的TBI患者，分为创伤诱导凝血功能障碍组（n=323）和无凝血功能障碍组（n=967）。两组基线特征见表S3。凝血功能障碍组二氧化碳分压（pCO?）显著高于无凝血功能障碍组（均P<0.05）（表S4）。此外，尽管组间动脉氧分压（pO?）无显著差异（P=0.65），凝血功能障碍患者入住ICU时需要更高的吸入氧分数（FiO?）（P=0.01）（表S4），表明存在更严重的潜在低氧状态。与此一致，凝血功能障碍组肺泡-动脉氧梯度（A-aDO?）显著升高（表S4），反映肺气体交换效率受损，这解释了需要更高FiO?维持相当pO?水平的原因。此外，凝血功能障碍组7天和30天死亡率显著高于无凝血功能障碍组（分别为17.96% vs. 7.14%和27.24% vs. 12.62%）（图1A–B），Kaplan–Meier分析证实创伤诱导凝血功能障碍组在整个观察期死亡风险更高（P<0.001）（图1C–D）。为检验凝血功能障碍相关的更高死亡风险是否由呼吸气体交换效率缺陷所致，研究人员进行中介分析，揭示A-aDO?确实部分中介了凝血功能障碍对死亡率的影响（图1E–F）。A-aDO?升高通常提示通气/灌注（V/Q）失配、肺内分流或弥散缺陷，在TBI中可表现为急性呼吸窘迫综合征或继发于全身炎症反应综合征的神经源性肺水肿。这一发现至关重要，因为它将凝血功能障碍与TBI后低氧联系起来，表明凝血功能障碍是加剧低氧并导致不良临床结局的关键因素。
3.2. 多组学分析提示过度NETosis参与TBI后免疫-凝血失调
为探究凝血功能障碍与TBI联系的病理机制，研究人员鉴定并功能注释了假手术对照与TBI模型小鼠损伤后24和72小时差异表达蛋白。时间序列聚类揭示蛋白表达动态变化，鉴定出TBI后表达显著增加的两个不同簇；簇1主要富集于补体和凝血级联通路，簇5与免疫反应相关的细胞活化密切关联（图2A）。这些凝血功能改变通过免疫组化染色进一步验证，显示微血栓标志物纤维蛋白-α在同侧皮层TBI后24小时较假手术组显著增加（P<0.05），72小时仍升高（P<0.05）（图S4A）。此外，与假手术组相比，TBI-24小时和TBI-72小时组血浆凝血标志物D-二聚体浓度升高（P<0.05）而纤维蛋白原水平降低（P<0.05）（图S4B），表明凝血系统激活和随之的纤维蛋白原消耗导致凝血功能障碍。这种凝血功能障碍还与TBI后24和72小时损伤灶周围脑微循环不足相关，如LSCI所示（P<0.05）（图S4D）。这种微循环障碍进一步加剧脑组织低氧，表现为较假手术对照PO?降低（P<0.05）和PaCO?升高（P<0.05）（图S4C），与TBI患者观察到的病理特征平行。值得注意的是，蛋白-蛋白网络分析揭示“补体和凝血级联通路”簇（簇1）与“免疫反应相关细胞活化”簇（簇5）差异表达蛋白之间存在多个相互作用点（图2B）。因此，研究人员从损伤区域和相应假手术对照皮层分离单细胞RNA样本，进行RNA测序以在细胞和分子水平检查这些相互作用。标记基因表达水平评估揭示TBI后多种免疫细胞类型浸润，包括小胶质细胞、星形胶质细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞、B细胞和T细胞。其中，中性粒细胞浸润最显著（图2C和表S5），单中性粒细胞样本差异表达基因的KEGG富集分析揭示补体和凝血级联以及NET形成相关因子显著富集（图2D），提示过度NETosis可能是TBI后凝血功能障碍的关键驱动因素。进一步qPCR揭示损伤脑组织中促炎细胞因子IL-1β和参与中性粒细胞募集的趋化因子CXCL1、CXCL2和CCL2表达水平升高（图2E）。这些因子可能共同促进外周中性粒细胞募集和活化。随后western blotting和免疫荧光共染色也证明TBI组脑组织NET标志物citH3表达较假手术组增加（图2F–G），与TBI后大量局部中性粒细胞浸润和NETosis一致。
3.3. 中性粒细胞驱动的促血栓内皮表型转化加剧创伤诱导凝血功能障碍
为更直接支持失调NETosis对TBI后凝血功能障碍的贡献，研究人员用抗Ly6G抗体耗竭中性粒细胞或用DNase I降解NETs治疗模型和假手术小鼠。Western blotting显示，与溶剂处理的TBI模型小鼠相比，TBI+抗Ly6G和TBI+DNase I组小鼠同侧脑组织中性粒细胞标志物Ly6G和NET标志物citH3表达水平显著降低（P<0.05）（图3A）。DNase I处理后Ly6G和citH3同时降低可能反映既有NETs的直接降解和NET清除继发的中性粒细胞浸润减少，与图3C–D观察到的趋化因子表达降低一致。此外，ELISA显示血浆NET标志物浓度显著降低，与western blotting一致（图3B），支持TBI+抗Ly6G和TBI+DNase I作为TBI干预模型。进一步qPCR分析显示TBI+抗Ly6G和TBI+DNase I组小鼠脑组织CXCL1、CXCL2和IL-1β表达水平较TBI组降低（P<0.05）（图3C–D）。此外，与TBI组相比，TBI+抗Ly6G和TBI+DNase I组血清D-二聚体浓度显著降低、纤维蛋白原显著增加（P<0.05）（图3E），与凝血功能障碍减轻一致，同时CD31和纤维蛋白免疫荧光共染色提示中性粒细胞耗竭和NET降解均减少（CD31?/Fibrin?）内皮微血栓形成（图3F–G）。凝血功能改善伴随低氧缓解，表现为PO?升高和PCO?降低（图3H）、大脑皮层血流增强（图S5A-B）、脑水肿减轻（图3I）和神经功能改善（图3J，图S5C-F）。TBI后凝血功能障碍可能部分源于内皮细胞活化失调。为评估内皮细胞活化的潜在贡献，研究人员注释了TBI模型和假手术小鼠非免疫细胞间差异表达基因（图4A），然后进行细胞间通讯分析（图4B）。细胞间通讯分析鉴定IL-1和CXCL信号作为TBI后中性粒细胞与内皮细胞间串扰的关键通路（图4C-D）。中性粒细胞高表达CXC趋化因子受体CXCR1和CXCR2，结合多种CXC配体，包括内皮细胞释放的CXCL家族成员。此外，IL-1已被证明激活脑内皮细胞，导致黏附分子如ICAM-1、VCAM-1和P-选择素以及各种趋化因子上调，从而促进中性粒细胞黏附和浸润。细胞培养实验显示，使用PMA诱导分离小鼠中性粒细胞NET形成（图4E）引起IL-1β mRNA表达 concurrent 增加（图4F），而用IL-1β或NETs处理bEnd.3小鼠内皮细胞较溶剂处理显著上调CXCL1和CXCL2 mRNA表达水平（图4G）。此外，ELISA结果显示IL-1β和NET刺激均显著增加培养内皮细胞上清中可溶性VE-cadherin和vWF释放，表明内皮功能障碍和向促凝表型转变（图4H）。进一步免疫荧光共染色证明暴露于IL-1β或NETs促使内皮细胞向促凝表型转变，特征为TM染色强度降低和TSP-1染色强度增强（图4I）。这些结果提示内皮细胞活化促进TBI后凝血功能障碍，与研究人员先前发现内皮细胞活化标志物TSP-1表达升高与TBI严重程度增加和不良临床结局相关一致。总之，这些发现提示TBI诱导致病循环，中性粒细胞在NET形成过程中释放IL-1β激活内皮细胞，内皮细胞反过来释放CXCL1/2，募集更多中性粒细胞并加速NETosis。该循环最终驱动NETs诱导内皮细胞促凝表型转变。值得注意的是，NETs含有多种蛋白酶，如中性粒细胞弹性蛋白酶（NE），可能蛋白酶切割TSP-1产生具有增强血小板活化特性的片段。通过该途径，NET可能独立于转录调控诱导内皮活化和功能障碍。
3.4. 低氧抑制ACOD1-衣康酸轴驱动NETosis
研究人员随后检查调控NETosis的上游机制。新兴证据提示这种调控可能涉及代谢通路改变，因此研究人员筛选了TBI后各细胞类型中糖酵解和TCA循环相关酶表达水平变化。值得注意的是，负责在炎症巨噬细胞中产生抗炎代谢物衣康酸的酶ACOD1在中性粒细胞中表达高于其他炎症细胞（图5A和图S6A-B），qPCR进一步显示ACOD1表达在TBI后前12小时内逐渐增加然后下降（图5B）。此外，TBI后分离的中性粒细胞ACOD1 mRNA水平先升高后降低（图S6D），而衣康酸水平逐渐下降（图S6E）。炎症刺激和脑微循环障碍导致的低氧是TBI后继发性脑损伤的主要病理机制。既往研究已确立炎症刺激导致免疫细胞中ACOD1保护性上调；然而，低氧对ACOD1表达的影响仍不清楚。鉴于TBI后中性粒细胞HIF-1α mRNA和蛋白水平逐渐增加（图S6C和S7），研究人员从 na?ve 小鼠分离原代中性粒细胞并暴露于不同持续时间低氧以模拟TBI后低氧环境对中性粒细胞ACOD1-衣康酸轴的影响。结果显示，随着低氧时间增加，中性粒细胞HIF-1α mRNA水平逐渐升高（图S6F），而ACOD1 mRNA水平逐渐降低，伴随衣康酸水平逐渐下降（图S6G–H）。此外，用促炎激活剂PMA刺激培养中性粒细胞增加ACOD1表达，而同时低氧抑制ACOD1表达，低氧反应占主导（图5C）。这一发现提示虽然炎症信号最初诱导ACOD1表达作为保护机制，但TBI后低氧环境使该机制失效。低氧抑制该保护机制可能解释临床上观察到的低氧介导的TBI后死亡率增加。低氧可能使内源性ACOD1-衣康酸轴通路对NETosis的负反馈控制失效，从而导致炎症和NETosis失控。与此一致，细胞内衣康酸水平呈相似趋势，PMA应答增加而低氧下显著降低（图5D）。此外，ELISA显示PMA刺激和低氧均增加分离中性粒细胞上清NET释放，而外源性衣康酸处理显著减少NETosis（图5E）。SYTOX Green染色中性粒细胞培养也显示NET释放减少（图5F）。此外，为验证观察到的NET形成减少确实是4-OI处理的结果，研究人员还评估了中性粒细胞黏附。结果显示4-OI处理不影响中性粒细胞黏附能力（图S8）。为进一步研究ACOD1在NETosis中的调控作用，研究人员检查了ACOD1 KO小鼠中性粒细胞的NET表达/释放（图5G）。KO小鼠分离的原代中性粒细胞中未检测到ACOD1 mRNA表达和细胞内衣康酸（图5H-I），证实原代中性粒细胞ACOD1成功敲除。令人惊讶的是，电镜和ELISA结果显示基线条件下WT和ACOD1 KO组NET水平无差异。然而，PMA刺激使ACOD1 KO中性粒细胞NET产生较同样处理的WT中性粒细胞增强（图5J–K）。或者，外源性补充衣康酸减少PMA刺激后ACOD1 KO中性粒细胞的NETosis（图5J–K）。这些结果强烈提示ACOD1-衣康酸轴参与抑制TBI后NETosis的内源性保护机制，但该保护在TBI后期被低氧条件抵消。
3.5. 外源性衣康酸补充改善TBI诱导的神经炎症、凝血功能障碍、脑微循环障碍和神经功能缺陷
基于这些体外结果，研究人员评估了外源性衣康酸补充对TBI后代谢和继发性脑损伤的影响。TBI后脑组织关键糖酵解和TCA循环代谢酶表达水平改变，大多数在TBI后1天相对高表达但3天下降（图6A）。这些酶表达变化反映在TBI后代谢物谱变化中（图6B），TBI-1天组葡萄糖和乳酸水平显著升高，TBI-3天组仍相对较高。相反，与假手术组相比，TBI-1天和TBI-3天组衣康酸水平降低，这可能归因于TBI后低氧导致向无氧糖酵解转变，进而抑制TCA循环。这些发现为早期外源性衣康酸补充作为TBI后潜在治疗策略提供了依据。外源性给予衣康酸类似物4-OI显著降低TBI后血浆NETs水平（P<0.05）和脑CXCL2、IL-1β（P<0.05）（图6C-D），与衣康酸诱导抑制TBI触发的中性粒细胞趋化和NETosis一致。免疫组化结果也显示4-OI降低TBI后脑微血栓标志物纤维蛋白-α表达（P<0.05）（图6H）。此外，血清凝血相关因子ELISA测量证明外源性衣康酸改善TBI后凝血功能（图6I）。另外，激光散斑对比成像和血气分析显示衣康酸补充显著改善皮层脑血流（图6J–K）并缓解低氧（图6L）。最后，研究人员证实外源性衣康酸修复BBB损伤，表现为全身注射后伊文思蓝浸润脑实质减少（图6E），改善脑水肿，表现为脑湿重:干重比（图6F），并改善神经功能，如mNSS评分评估（图6G）。此外，旷场试验显示TBI小鼠较假手术小鼠总移动距离显著减少，中央区移动距离减少和进入中央区次数减少，表明运动功能障碍和焦虑样行为增加。4-OI治疗显著改善这些参数，证明其改善TBI诱导的运动和情绪行为异常（图S9）。总之，这些结果提示外源性衣康酸可通过抑制神经炎症和改善凝血及微循环功能障碍减轻TBI后继发性神经损伤。为进一步验证衣康酸的治疗效果依赖于中性粒细胞，研究人员给中性粒细胞耗竭小鼠施用衣康酸。与TBI+Anti-Ly6G组相比，TBI+Anti-Ly6G+4-OI组在NETs（图S10A）、IL-1β（图S10B）、微血栓（图S10C–D）或凝血功能（图S10E）水平上无显著差异。此外，尽管TBI+Anti-Ly6G+4-OI组较TBI+Anti-Ly6G组显示更低的伊文思蓝外渗和脑含水量（图S10F–G，P<0.05），但两组神经功能无显著差异（图S10H）。这些发现提示衣康酸的治疗效果至少部分依赖于中性粒细胞介导的机制。
讨论
TBI后凝血功能障碍与微循环障碍和低氧相关，最终导致更严重的继发性神经变性和更差的临床结局。这种TBI后凝血功能障碍源于涉及局部炎症激活、中性粒细胞浸润、代谢重编程和内皮细胞向促炎促凝表型转化的复杂致病过程。本研究表明ACOD1-衣康酸轴通过抑制中性粒细胞胞外诱捕器形成防止TBI后恶化。关键发现是ACOD1衍生的代谢物衣康酸作为NETosis的关键内源性抑制剂，补充衣康酸改善小鼠TBI后凝血功能障碍、脑微循环障碍并最终改善神经功能损害。这些发现扩展了当前对TBI后免疫代谢串扰的理解。TBI后继发性损伤级联涉及炎症、凝血功能障碍和低氧相互维持和强化的恶性循环，共同加剧神经变性。本研究证实伴有创伤诱导凝血功能障碍的TBI患者死亡率更高，且部分由脑低氧中介。TBI急性期，损伤脑组织触发局部和全身炎症及高凝状态，导致消耗性凝血病和纤溶亢进。这种失衡促进微血管血栓形成和脑低灌注，最终加剧继发性缺血-低氧损伤。由此产生的低氧环境进一步破坏血脑屏障完整性，使更多促凝物质和炎症介质进入神经实质，反过来加重凝血障碍。本研究不仅重申凝血功能障碍和低氧对TBI预后的关键临床影响，更重要的是通过ACOD1-衣康酸轴这一免疫代谢枢纽将这三个看似独立的病理通路联系起来，为概念化继发性脑损伤提供新框架。TBI后BBB破坏使中性粒细胞快速浸润损伤脑组织并形成NETs，这些由DNA、组蛋白和各种功能蛋白组成的结构通过结合血小板、凝血因子和红细胞作为血栓形成支架。研究人员发现NETosis和随后的凝血功能障碍由IL-1和CXCL信号通路介导的中性粒细胞-内皮细胞串扰驱动。一方面，PMA诱导的NETosis伴随IL-1β表达显著上调，研究已证实IL-1β可下调内皮细胞表面TM，导致促凝表型转换。此外，IL-1β本身进一步诱导NET释放，从而促进内皮损伤。另一方面，活化的内皮细胞释放CXCL信号，进一步驱动中性粒细胞募集和NET释放。值得注意的是，NETs内含的蛋白酶如中性粒细胞弹性蛋白酶可直接切割TSP-1产生具有增强促血小板活性的C端片段，进一步放大内皮细胞的促血栓效应。该效应加剧弥漫性微血栓形成和继发性脑低灌注，进而加重TBI后低氧环境，而低氧又可进一步诱导内皮功能障碍，从而形成恶性循环。该病理过程也解释了为何NET降解改善TBI后凝血功能和神经预后。然而，当前NET靶向治疗（如DNase I和PAD4抑制剂）存在显著局限性，如缺乏特异性、半衰期短、溶解性差和潜在毒性。因此，NETs的内源性抑制剂可能是TBI治疗更可行的策略。创伤性脑损伤诱导脑内和全身代谢功能障碍，表现为应激性高血糖和脑葡萄糖摄取减少，共同加剧能量失衡导致不良预后。在这些条件下，免疫细胞也显示显著代谢重编程，活化免疫细胞转向糖酵解主导的“Warburg样效应”以支持炎症功能。值得注意的是，细胞代谢过程也直接影响NETs形成，因为NETosis依赖中性粒细胞表面葡萄糖转运体1（GLUT1）介导的葡萄糖摄取和糖酵解通路其他关键分子（如乳酸和甘油醛-3-磷酸脱氢酶）。作为关键免疫代谢调节因子，衣康酸通过抑制琥珀酸脱氢酶（SDH）发挥抗炎作用，从而减少琥珀酸积累和下游炎症因子释放。本研究揭示TBI后NETosis与葡萄糖代谢密切关联，并鉴定ACOD1为该过程的潜在调控因子。ACOD1活性还涉及巨噬细胞表型极化、氧化应激和炎症小体活化。虽然小胶质细胞特异性ACOD1 KO被报道加剧TBI相关炎症和神经变性，但其在中性粒细胞中的功能，特别是在TBI背景下，仍未充分探索。衣康酸是三羧酸（TCA）循环的关键中间体，由ACOD1[也称免疫反应性IRG1]生成，在炎症期间大量积累，包括创伤后中性粒细胞。ACOD1不仅通过促进中性粒细胞反向迁移缓解局部炎症，还通过激活Nrf2/HO-1/HIF-1α通路增强抗铁死亡能力并抑制NET形成，这些效应由衣康酸介导。本研究发现TBI早期炎症信号短暂上调中性粒细胞ACOD1-衣康酸轴，可能是内源性保护反应。然而，随着损伤进展，脑内持续低氧微环境抑制该代谢轴，从而促进NETs异常形成并加剧继发性损伤。值得注意的是，外源性补充衣康酸衍生物4-辛基衣康酸（4-OI）有效逆转这种代谢失调并显著抑制TBI后NET生成和低氧，凸显衣康酸补充作为TBI治疗策略的潜力。本研究描述的ACOD1-衣康酸轴对NETosis的调控作用与其他近期研究高度一致，提示衣康酸可直接调控NETosis关键酶。在脓毒症模型中，ACOD1/衣康酸通过E3泛素连接酶UBR5的烷基化修饰促进PAD4泛素化和降解，从而抑制NETosis发挥保护作用。该发现提供了解释衣康酸如何调控NETosis的新表观遗传机制，也为本研究中ACOD1缺失时NETosis增强提供了分子基础。值得注意的是，一项研究证实衣康酸通过下调缺氧诱导因子-1α直接抑制小鼠中性粒细胞NETosis。该机制恰好解释了研究人员在TBI后低氧微环境中观察到的现象。衣康酸还可通过调节巨噬细胞-中性粒细胞通讯间接抑制NETosis。近期也有报道4-OI靶向巨噬细胞ARID3A抑制THBS1/CD47信号通路，从而减少心脏移植后心肌缺血-再灌注损伤模型中的NETosis。该发现提示在涉及多种免疫细胞的复杂病理过程如TBI中，衣康酸可能通过调节细胞间相互作用发挥更广泛的保护效应。此外，既往研究表明衣康酸抑制NET形成从而减少IL-1β释放，该效应可能与抑制NLRP3炎症小体活化有关。该发现与本研究结果一致。鉴于NETs和IL-1β在诱导内皮细胞促凝表型中的关键作用，这为衣康酸改善TBI后凝血功能障碍的机制提供了合理解释。这些发现不仅强化了衣康酸作为NETosis内源性抑制剂的核心作用，也为开发基于衣康酸的TBI治疗策略提供了坚实理论基础和多个潜在干预靶点。尽管耗竭中性粒细胞或抑制其募集可保护脑损伤，但临床抑制中性粒细胞功能携带严重医院获得性感染和免疫失调的重大风险。同样，早期抑制NETosis可能改善TBI后继发性脑损伤，但也增加后期感染风险。因此，衣康酸的治疗应用需要进一步研究确定最佳干预时间窗。NETosis的空间特异性调控，如使用靶向递送系统将效应定位到颅内或损伤部位，同时保留全身中性粒细胞和免疫器官的抗菌能力，代表了局部精准治疗的有前景的未来方向。本研究存在若干局限性。第一，体外低氧和PMA处理不能完全再现TBI复杂的多因素病理生理环境，还涉及机械剪切应力、损伤相关分子模式、兴奋性毒性和异质性炎症信号。因此，从这些还原模型得出的机制发现需要使用更生理相关的刺激或共培养系统进一步验证。第二，亲电性衣康酸衍生物4-OI可能作用于多种其他细胞类型，包括脑内皮细胞、神经元、星形胶质细胞和其他免疫细胞。因此，未来使用中性粒细胞靶向递送策略或互补细胞类型特异性方法的研究需要更精确地定义4-OI的中性粒细胞依赖性效应。第三，研究人员不能明确将全局ACOD1敲除的保护效应归因于抑制中性粒细胞来源的ACOD1（相对于小胶质细胞、星形胶质细胞或其他来源的ACOD1）。尽管使用全局KO小鼠分离原代中性粒细胞的体外实验证实了细胞内在作用，但未来采用中性粒细胞特异性ACOD1条件性敲除小鼠的研究对于建立体内因果关系至关重要。第四，虽然在培养中性粒细胞中测量了衣康酸水平和ACOD1转录及蛋白表达，但未对TBI后分选中性粒细胞群体进行综合代谢组学分析。这种无偏代谢筛查可能揭示TCA循环、糖酵解和脂质代谢的更广泛重编程共同调控NETosis。第五，尽管进行了先验效力分析，但由于动物福利3R原则的限制，某些实验样本量仍相对较小（如每组n=3）。最后，由于回顾性公共数据库分析的固有局限性，本研究无法直接研究TBI患者血浆ACOD1和NET水平与凝血功能的相关性，也无法研究与继发性脑损伤进展或临床结局的关联。尽管既往研究已证明NET特异性生物标志物在伴有凝血功能障碍的TBI患者中较不伴有者显著升高，但仍需要更大队列的前瞻性多中心研究和系统生物标志物分析来验证这些发现并精确界定最佳目标患者群体（如创伤诱导凝血功能障碍患者）和治疗时间窗。
结论
总之，本研究鉴定ACOD1-衣康酸轴是通过抑制NETosis对抗TBI后免疫代谢失调和继发性损伤的关键内源性保护通路。低氧条件下该保护性代谢反应的丧失为过度NETosis创造了许可环境，从而驱动凝血功能障碍和继发性脑损伤。这些发现不仅增进了对TBI免疫代谢串扰的理解，而且确立ACOD1-衣康酸通路作为新型有前景的治疗靶点。
