《Journal of Food Protection》：Rapid Colony Identification of
Listeria monocytogenes and Other
Listeria Species by PCR
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传统食品中单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的确认需经过增菌、选择性平板分离及生化鉴定，菌落确认通常耗时3–5天。研究人员建立并验证了一种多重PCR（multiplex PCR）方法，用于从选择性及非选择性琼脂上直接对菌落进行属水平及
传统食品中单增李斯特菌（Listeria monocytogenes）的确认需经过增菌、选择性平板分离及生化鉴定，菌落确认通常耗时3–5天。研究人员建立并验证了一种多重PCR（multiplex PCR）方法，用于从选择性及非选择性琼脂上直接对菌落进行属水平及单增李斯特菌特异性鉴定。该检测体系靶向三个标志物：hlyA（152 bp，单增李斯特菌特异）、prs（370 bp，李斯特菌属特异）及16S rRNA（107 bp，内参扩增对照）。利用226株分离株（117株单增李斯特菌、44株其他李斯特菌、65株非李斯特菌）进行验证，结果显示100%包容性与100%排他性；在Oxford、Agar Listeria（AL）、RAPID'L.mono（RLM）、PALCAM等多种培养基上结果一致，并以全基因组测序（whole-genome sequencing, WGS）确认菌种。相较基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）需专用仪器，该PCR将周转时间缩短至4小时内，符合ISO 16140-6及加拿大卫生部确认试验指南。补充评估中新描述的李斯特菌种及溶血性无害李斯特菌（L. innocua）出现非典型扩增，提示方法在更广适用范围中的潜在局限。
研究背景方面，单增李斯特菌是重要的食源性病原体，可在即食食品、乳制品及生鲜农产品中引发严重侵袭性李斯特菌病，对免疫低下人群、孕妇及老年人致病与致死风险高。现行常规确认流程依赖增菌、选择性显色平板分离，再经溶血、动力、碳水化合物利用等表型与生化试验，菌落分离后仍需3–5天完成属种确认；非典型菌株易导致模棱两可结果，延误公共卫生与产业响应。已有分子检测多面向增菌液或食品基质，少有针对分离菌落、且跨多种标准化选择性培养基的直接确认方法。MALDI-TOF MS虽快速，但受参考数据库与仪器可及性限制。因此，研究人员开展本研究，旨在验证一套可嵌入常规培养流程、直接用于菌落确认的多重PCR体系。
研究人员设计靶向hlyA、prs与细菌通用16S rRNA内参的三重PCR，以单菌落快速裂解产物为模板，经琼脂糖凝胶电泳判读：hlyA与prs及内参均阳性判为单增李斯特菌；仅prs与内参阳性判为其他李斯特菌属；靶标皆阴、内参阳性为非李斯特菌；内参失败则结果不确定需复测。经两家实验室独立验证，该体系在Oxford、AL、RLM、PALCAM平板上均给出清晰条带模式，整体从单菌落到报告可在4小时内完成，且不需要实时荧光PCR或质谱类高端设备，便于资源有限实验室部署。
主要关键技术方法上，研究人员构建了由117株单增李斯特菌（含11血清型、34个序列型，来源于食品、环境及临床）、44株其他李斯特菌属、65株非李斯特菌组成的多样性分离株队列，所有菌株先以胰蛋白酶大豆琼脂（tryptic soy agar, TSA）恢复纯培养再转接选择性培养基；以WGS作为菌种判定参考标准，辅以常规生化（MFHPB-30）、VITEK 2、API Listeria及MALDI-TOF MS比对；核酸采用单菌落热裂解直扩模板，三重PCR含内参控制，结果以凝胶电泳判读并与基因组数据一致性评价。
研究结果如下。
遗传多样性特征：研究人员通过核心基因组系统发育、多位点序列分型（multilocus sequence typing, MLST）与计算机血清型分析，证实验证面板覆盖单增李斯特菌多个进化谱系、11个血清型及属内多物种，具备系统发育广度。
单增李斯特菌包容性：117株在四种选择性培养基上均呈现hlyA、prs与内参三带模式，无假阴性、假阳性或持续不确定结果；个别菌株在生化、API、VITEK 2或MALDI-TOF上出现不一致，但PCR与WGS一致。
其他李斯特菌属检测：44株非单增李斯特菌仅扩增prs与内参、不扩hlyA，符合属水平判定；历史命名错误菌株经WGS纠偏，PCR始终给出正确属级结果。
非李斯特菌排他性：65株非目标菌在任何培养基下均不扩hlyA与prs，仅内参阳性；即便肠球菌、葡萄球菌等少数可在选择性平板生长，PCR仍准确排除。
总体性能：226株总队列中，PCR与WGS完全吻合，包容性100%、排他性100%；而表型、商业化鉴定与蛋白谱方法在选择性培养基来源菌落上出现混合鉴定、错鉴或无鉴定。
讨论部分总结：研究人员指出，该常规多重PCR以保守基因靶标替代易变表型，在选择性培养基所致形态与生化漂移下仍保持稳定；相比生化与商用系统，可减少非典型株判读歧义。方法定位为菌落确认而非替代增菌分离，可融入ISO、加拿大与美国常规流程。补充评估提醒，新种与溶血性无害李斯特菌可能出现prs缺失或hlyA交叉阳性，须结合WGS等其他证据解释非典型谱。
结论部分翻译：所验证的多重PCR（multiplex PCR）方法为培养分离后单增李斯特菌及其他李斯特菌属的快速、可靠且可及确认提供了实用路径。该方法在226株多样分离株中与全基因组测序（WGS）完全一致，可自Oxford、AL、RLM、PALCAM等多种选择与显色培养基直接确认菌落，避免商用系统在非典型分离株上的歧义，兼顾分析性能、周转速度与设备可及性，可纳入标准化食品微生物学工作流。
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