基于双重qPCR与RPA-LFD技术同时检测生乳中牛分枝杆菌和副结核分枝杆菌的方法建立与评价

《Journal of Food Composition and Analysis》：Duplex qPCR and RPA-LFD for simultaneous detection of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in raw milk

本研究旨在开发并评估两种可同时检测生乳中牛分枝杆菌（M. bovis）和副结核分枝杆菌（MAP）的双重分子检测方法。研究人员针对牛分枝杆菌所属结核分枝杆菌复合群（MTBC）保守的rv3876基因和MAP特异性多拷贝插入序列IS900设计了引物和探针，分别建立了双重实时荧光定量PCR（duplex qPCR）和重组酶聚合酶等温扩增结合侧流层析试纸条（RPA-LFD）检测体系。两种检测方法均表现出100%的特异性，对质粒标准品的检测限（LOD）分别为101–103 copies/μL。在人工污染生乳样本中，经优化预处理后，双重qPCR对M. bovis和MAP的LOD分别为2.05×103 CFU/mL和2.55×104 CFU/mL，双重RPA-LFD的LOD分别为2.87×104 CFU/mL和6.36×104 CFU/mL。利用75份临床生乳样本进行验证，两种方法与复合参考标准的总符合率为94.7%（71/75），其中对M. bovis的诊断灵敏度为80%（4/5），对MAP的诊断灵敏度为90%（27/30），特异度均为100%（40/40）。研究表明，双重qPCR适用于实验室精准检测，而双重RPA-LFD作为一种快速（30 min）、低设备需求的现场筛查工具，两者互为补充，共同为乳制品安全监测以及区分由MAP感染引起的牛结核病（bTB）假阳性反应提供了实用解决方案。

研究背景与意义

牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）是一种已确认的人兽共患病原体，而副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis，MAP）则被认为是克罗恩病的可疑致病原。这两种病原体均可污染生乳及其制品，给乳业造成重大经济损失并带来公共卫生风险。此外，MAP感染会诱导细胞免疫应答，与M. bovis抗原发生交叉反应，导致牛结核病（bovine tuberculosis，bTB）皮内变态反应试验和γ-干扰素释放试验出现假阳性，进而引发不必要的扑杀并干扰bTB根除计划。现有的检测方法如细菌培养耗时过长（数周至数月），免疫学方法存在交叉反应，常规单靶标PCR无法在同一反应中区分两种病原体。因此，亟需开发一种能够直接从生乳中同时鉴别M. bovis和MAP的检测方法，兼具保障乳品安全和辅助bTB诊断的双重价值。

研究方法概述

研究人员针对MTBC保守的rv3876基因和MAP特异性多拷贝插入序列IS900设计引物和探针，建立了双重实时荧光定量PCR（duplex qPCR）和重组酶聚合酶等温扩增结合侧流层析试纸条（RPA-LFD）两种检测体系。在方法优化阶段，通过棋盘滴定法确定了qPCR的最佳引物和探针浓度，通过温度和时间梯度实验确定了RPA-LFD的最佳反应条件（37°C，30 min）。在模拟样本测试中，研究人员比较了五种DNA提取方法（煮沸法、EDTA-Triton X-100裂解法、NaOH裂解法、PBS裂解法和NaOH-Tris-HCl中和法），最终确定qPCR采用煮沸法预处理，RPA-LFD采用EDTA-Triton X-100法预处理。临床验证使用了来自新疆农垦科学院畜牧兽医研究所和中国石河子市的75份已知感染状态的生乳样本（包括5份M. bovis单阳性、30份MAP单阳性和40份双阴性样本）。

研究结果

3.1 特异性引物验证与质粒标准品构建

通过琼脂糖凝胶电泳确认，qPCR扩增产物长度分别为93 bp（rv3876）和128 bp（IS900），RPA-LFD扩增产物长度分别为316 bp和241 bp，条带单一清晰无非特异性扩增。成功构建了pMD19-T-rv3876和pMD19-T-IS900重组质粒标准品并经测序验证。

3.2 反应条件优化

双重qPCR的最优引物浓度为0.5 μM，探针浓度为250 nM，在此条件下rv3876和IS900的扩增效率分别为99.5%和99.2%。双重RPA-LFD的最优反应温度为37°C，最优反应时间为30 min，此时试纸条检测线信号最强且最稳定。

3.3 单重检测方法的特异性和灵敏度

单重qPCR和单重RPA-LFD均表现出100%的特异性，仅对目标病原体产生信号，与MAP、大肠杆菌等其他常见乳源性细菌无交叉反应。单重qPCR对rv3876质粒标准品的检测限（LOD）为1.35×10³ copies/μL，对IS900质粒标准品的LOD为1.29×10³ copies/μL。单重RPA-LFD对rv3876和IS900质粒标准品的LOD分别为2.1×10¹ copies/μL和1.68×10² copies/μL。

3.4 单重检测方法在人工污染生乳中的表现

在人工污染生乳中，经优化预处理后，单重qPCR对M. bovis和MAP的LOD分别为2.05×10³ CFU/mL和2.55×10⁴ CFU/mL；单重RPA-LFD的LOD分别为2.87×10⁴ CFU/mL和6.36×10⁴ CFU/mL。所有非目标菌株均未产生假阳性信号。

3.5 双重检测方法的建立

将两个单重体系合并为双重qPCR和双重RPA-LFD。双重qPCR通过FAM通道检测rv3876、VIC通道检测IS900，两通道间无交叉干扰。双重RPA-LFD的试纸条设有两条检测线（T1线用于M. bovis，T2线用于MAP）。双重qPCR对两种质粒标准品的LOD分别为1.35×10³ copies/μL和1.29×10³ copies/μL，双重RPA-LFD的LOD分别为2.1×10¹ copies/μL和1.68×10² copies/μL，均与相应单重方法一致。

3.6 双重检测方法在人工污染生乳中的表现

在人工污染生乳基质中，双重qPCR的LOD为M. bovis 2.05×10³ CFU/mL和MAP 2.55×10⁴ CFU/mL；双重RPA-LFD的LOD为M. bovis 2.87×10⁴ CFU/mL和MAP 6.36×10⁴ CFU/mL。两种方法在生乳基质中均保持100%的特异性，无交叉反应。

3.7 双重检测方法在临床样本中的诊断性能评估

利用75份临床生乳样本进行盲法验证，双重qPCR和双重RPA-LFD的结果完全一致。对M. bovis的诊断灵敏度为80%（4/5，95%置信区间CI: 28.4%–99.5%），对MAP的诊断灵敏度为90%（27/30，95% CI: 73.5%–97.9%），对两种病原体的诊断特异度均为100%（40/40，95% CI: 91.2%–100%）。总体符合率为94.7%（71/75）。3份MAP假阴性和1份M. bovis假阴性样本的细菌载量均低于两种方法的检测限。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究建立的双重qPCR和RPA-LFD方法克服了传统方法的局限性。与耗时的细菌培养和存在交叉反应的免疫学方法相比，双重qPCR提高了通量和准确性，适用于实验室检测；而RPA-LFD具备等温扩增（37°C）、快速（30 min）、低设备需求和可视化判读等优点，符合世界卫生组织（WHO）的ASSURED标准，适合农场或资源有限地区的现场筛查。选择rv3876和IS900作为靶标保证了高特异性：IS900是MAP特有的多拷贝插入序列，rv3876位于MTBC特异性RD1区域，两者均不与常见乳源性细菌发生交叉反应。该方法的核心应用价值在于解决MAP感染对bTB诊断的干扰——由于MAP与M. bovis抗原交叉反应导致的皮试和γ-干扰素释放试验假阳性问题，本研究的DNA直接检测策略可有效避免免疫交叉反应，不仅用于乳品安全监测，还可作为辅助工具区分真正的M. bovis感染与MAP引起的假阳性。

研究结论：研究人员成功开发了用于同时检测生乳中M. bovis和MAP的有效双重qPCR和RPA-LFD方法。双重qPCR适用于实验室检测，而双重RPA-LFD提供了一种快速、低设备需求的现场筛查工具。两者相辅相成，共同构成强化乳品安全监测和协助bTB根除计划中鉴别诊断的互补策略。