《Journal of Food Composition and Analysis》：Analysis of volatile flavor characteristics and microbial community structure in different types of douchi using GC-IMS and high-throughput sequencing
编辑推荐：
采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）与高通量测序技术，对浏阳豆豉（LYDC）、潼川豆豉（TCDC）和铜仁豆豉（TRDC）3种代表性传统豆豉的挥发性风味特征及微生物群落结构进行比较分析。通过GC-IMS构建挥发性化合物指纹图谱，共 tentatively 鉴
采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）与高通量测序技术，对浏阳豆豉（LYDC）、潼川豆豉（TCDC）和铜仁豆豉（TRDC）3种代表性传统豆豉的挥发性风味特征及微生物群落结构进行比较分析。通过GC-IMS构建挥发性化合物指纹图谱，共 tentatively 鉴定出76种挥发性化合物，主要包括酯类、醇类、醛类、酮类、酸类和吡嗪类。主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA）结果表明，3种豆豉的挥发性风味轮廓可明显区分。LYDC中酯类和吡嗪类的相对峰体积贡献较高；TCDC中酮类、醇类和醛类的相对贡献较高；TRDC则以酸类为主，其相对峰体积贡献之和达63.84%。高通量测序结果显示，3种豆豉在细菌和真菌群落结构上存在差异。在属水平上，Bacillus为3种豆豉中最丰富的细菌属；Aspergillus在LYDC和TCDC中占主导地位，而Scytalidium为TRDC的优势真菌属。探索性Spearman相关分析揭示了优势微生物属与部分挥发性化合物之间的关联，为阐明豆豉风味形成机制及筛选功能发酵菌株提供了理论依据。
研究背景：豆豉是中国传统发酵豆制品，因发酵过程中优势微生物不同可分为曲霉型、毛霉型、细菌型及毛霉-细菌型等类型。四川潼川豆豉（TCDC）、湖南浏阳豆豉（LYDC）和贵州铜仁豆豉（TRDC）是3种具有代表性的传统品种，其原料和发酵工艺的差异可能赋予产品独特的风味特征。挥发性风味化合物是评价豆豉品质的关键感官指标，主要包括酯类、醇类、醛类、吡嗪类和酸类等，这些化合物通过不同的组合和比例赋予豆豉酱香、豆豉香、甜香和烟熏等特征风味。近年来，研究人员采用固相微萃取（SPME）、气相色谱-质谱/嗅闻（GC-MS/O）及全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC–ToF-MS）等技术对豆豉挥发性香气化合物进行了研究，但上述技术在区分某些异构体方面存在局限，且样品前处理过程较为复杂。气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）作为一种新型挥发性化合物检测技术，具有检测速度快、灵敏度高、样品前处理简单等优势，可直观展示不同样品间挥发性成分的差异。然而，仅分析风味化合物不足以阐明其形成机制，还需结合微生物群落研究。传统豆豉在自然发酵过程中形成复杂且动态演变的微生物群落结构，微生物组成的差异是导致不同类型豆豉风味差异的关键因素。因此，研究人员采用GC-IMS表征3种代表性传统豆豉的相对挥发性信号轮廓并构建风味指纹图谱，同时利用高通量测序分析细菌和真菌群落，并开展探索性相关分析以考察优势微生物属与特定挥发性信号之间的关联。与以往聚焦单一豆豉产品发酵阶段变化的研究不同，该研究对3种传统豆豉的挥发性特征和微生物群落结构进行横断面比较，为理解其风味分化及微生物-挥发性关联提供了新的见解。
关键技术方法：研究人员以LYDC、TCDC和TRDC 3种市售豆豉为研究对象，每种豆豉从同一生产批次的3个独立零售包装中取样（n=3）。采用配备MXT-WAX毛细管柱的FlavourSpec? GC-IMS系统分析挥发性化合物，以C4–C9正构酮为外标计算保留指数（RI），通过VOCal软件结合NIST 2020和IMS数据库进行 tentatively 鉴定，并采用Reporter、Gallery Plot和Dynamic PCA插件进行光谱分析和主成分分析（PCA）。微生物群落分析方面，提取样品基因组DNA后，分别以338F/806R引物扩增细菌16S rRNA基因V3–V4区、以ITS1F/ITS2R引物扩增真菌ITS1区，在Illumina MiSeq平台（PE250）进行高通量测序，原始数据经QIIME2进行操作分类单元（OTU）聚类（97%相似度）、分类注释及α/β多样性分析。采用Spearman秩相关分析评估优势微生物属相对丰度与GC-IMS相对峰体积百分比之间的关联，P值经Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正。
研究结果：
3.1 基于GC-IMS的3种豆豉挥发性化合物分析
3.1.1 基于GC-IMS的3种豆豉挥发性化合物光谱分析：通过GC-IMS分析3种豆豉的挥发性有机化合物，三维光谱和二维俯视光谱结果显示3种豆豉在信号点的分布区域、数量和响应强度上存在明显差异，TRDC代表性光谱中可检测到的信号点数量多于LYDC和TCDC。以LYDC1为参考的差异光谱显示，TCDC和TRDC相对于LYDC存在多个红色和蓝色信号，表明其挥发性信号轮廓存在差异。指纹图谱分析表明，LYDC中信号强度较高的化合物主要包括丁酸乙酯、乙酸异丁酯、2-己醇、2-甲基丁酸乙酯、3-甲硫基丙醛、2,5-二甲基呋喃、乙酸乙酯、2-甲基吡嗪、2,6-二甲基吡嗪等，主要赋予 fruity、sweet 和 roasted 香气；TCDC中信号强度较高的化合物主要包括乙酸丁酯、乙醇、3-羟基-2-丁酮、苯甲醛等，构成其独特的醇香和奶香；TRDC中信号强度较高的化合物主要包括反-2-辛烯醛、反-2-庚烯醛、1-辛烯-3-醇、2,5-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、己醛等，其中己醛和1-辛烯-3-醇为典型大豆香气化合物。每种豆豉类型的3个独立包装样品在组内表现出大致相似的主要信号分布模式，而3种豆豉之间则呈现明显不同的挥发性指纹图谱。
3.1.2 基于GC-IMS的3种豆豉挥发性化合物鉴定及类别水平比较：通过匹配保留指数和离子迁移信息，共 tentatively 鉴定出76种挥发性化合物，包括酯类、醇类、醛类、酮类、吡嗪类、酸类和呋喃类等。类别水平相对峰体积贡献分析表明，LYDC的酯类相对峰体积贡献最高（25.00%），吡嗪类贡献略高（1.35%）；TCDC的酮类（14.93%）、醇类（9.71%）和醛类（11.44%）相对贡献较高；TRDC的酸类相对峰体积贡献最高（63.84%），其中3-甲基丁酸-D和2-甲基丙酸-D为主要贡献者。上述结果表明3种豆豉不仅挥发性成分组成不同，各挥发性信号的相对峰体积贡献也存在明显差异。
3.1.3 基于GC-IMS的3种豆豉挥发性化合物多元统计分析：主成分分析（PCA）结果显示，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）分别解释65.9%和27.7%的方差，累计达93.6%，3组样品在得分图上清晰分离，LY、TC和TR分布于不同区域。层次聚类分析热图进一步将LY、TC和TR样品组分为3个独立簇，与PCA结果一致；挥发性化合物可大致分为3个主要簇，Cluster I主要为富集于LYDC的酯类和吡嗪类化合物，Cluster II主要为在TCDC中响应较高的酮类和醇类信号，Cluster III主要为在TRDC中响应较高的酸类及部分醛类和醇类信号。
3.2 基于高通量测序的豆豉微生物群落结构与多样性分析
3.2.1 基于MiSeq测序的豆豉微生物α多样性分析：经质量控制共获得614,861条高质量细菌16S rRNA基因序列，平均长度428 bp，以97%相似度阈值聚类获得2296个细菌OTU；OTU水平Venn分析显示3种豆豉共有1218个OTU，仅44个OTU为3种豆豉共有。细菌Coverage指数均大于0.99，表明测序深度充足；细菌丰富度指数（ACE和Chao）均值呈TC > LY > TR趋势，Shannon指数均值呈TC > TR > LY趋势，但经FDR校正后5项细菌α多样性指数在3种豆豉间均无显著差异（校正q > 0.05）。真菌ITS区域测序共获得910,474条高质量序列，平均长度223 bp，聚类获得445个真菌OTU；Venn分析涉及258个OTU。真菌Coverage指数接近1，真菌Chao丰富度指数均值呈LY > TR > TC趋势，Shannon指数均值呈LY > TC > TR趋势，但经FDR校正后4项真菌α多样性指数在3种豆豉间均无显著差异（校正q > 0.05）。LYDC3的细菌Shannon指数（0.284）明显低于LYDC1（2.592）和LYDC2（2.007），与Bacillus在LY3中的显著优势（相对丰度97.86%）一致，反映批内异质性。
3.2.2 豆豉微生物菌群稀释曲线和多样性曲线分析：Shannon和Sobs稀释曲线显示，随着测序深度增加，Shannon曲线斜率持续减小并最终趋于平直，表明细菌群落多样性指数逐渐达到饱和；Sobs曲线呈非线性增长并随测序深度增加逐渐放缓。真菌Shannon稀释曲线随测序深度增加逐渐趋于平缓，Sobs曲线虽也呈现先快速上升后逐渐减速的模式，但平缓程度不及Shannon曲线，提示真菌群落中可能存在少量低丰度物种。总体而言，本研究的测序深度基本满足细菌和真菌群落多样性分析的要求。
3.2.3 豆豉微生物菌群物种组成分析：细菌OTU Venn分析显示，TC特有602个OTU（49.43%），TR特有92个OTU（7.55%），LY特有266个OTU（21.84%），3种豆豉共有44个OTU（3.61%）。真菌OTU Venn分析显示，TC特有42个OTU（16.28%），LY特有97个OTU（37.60%），TR特有71个OTU（27.52%），3种豆豉共有8个OTU（3.10%）。在门水平上，优势细菌门包括Firmicutes、Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes和Cyanobacteria，其中Firmicutes在3种豆豉中均占主导地位（除TC1样品中Proteobacteria比例相对较高外）。在属水平上，共检测到30余个细菌属，其中Bacillus、Weissella和Acinetobacter为最丰富的3个属；Bacillus在LYDC、TCDC和TRDC中均为最丰富的细菌属，但其相对丰度在个体样品间存在差异，Weissella在LY2中为优势属（56.67%），Bacillus在LY3中占细菌群落的97.86%。真菌门水平上，Ascomycota在3种豆豉中均占主导地位，在TC和LY中分别占96.73%和90.72%，在TR中占80.80%；Basidiomycota在TR中占17.38%，为3种豆豉中最高。真菌属水平上共包含30个主要属，其中Aspergillus在TC和LY中占比最高，在LY中超过半数；Scytalidium为TR的优势真菌属，占54.04%。
3.2.4 豆豉微生物菌群比较分析：属水平热图聚类分析显示，Bacillus相对丰度最高；TR豆豉样品上下区域属水平相对丰度具有较大相似性；TC平行样品中TC2和TC3高度相似，TC1与另两个样品存在一定差异；LY平行样品间差异显著。属水平PCA分析显示，TC样品与LY和TR样品分离，LY和TR样品位置相对接近；TC豆豉平行样品间变异较大，TR豆豉平行样品间变异小于LY豆豉，LY豆豉变异小于TC豆豉。真菌属水平热图聚类分析显示，3种豆豉中高相对丰度的优势属主要包括Aspergillus、Scytalidium和Pichia；TCDC和LYDC中Aspergillus相对丰度最高，Pichia也占显著比例；TRDC中Scytalidium相对丰度最高，为核心优势属。真菌属水平PCA分析显示，PC1和PC2贡献率分别为24.91%和17.14%，累计解释42.05%的群落变异，TRDC在PCA图上相对远离LYDC和TCDC。
3.3 豆豉微生物群落与风味化合物的关系：Spearman相关分析显示，在细菌分析中，Acinetobacter与2,5-二甲基吡嗪呈负相关（ρ = ?0.93），与乙酸呈正相关（ρ = 0.95），Pseudomonas与2,5-二甲基吡嗪呈负相关（ρ = ?0.93），上述关联经FDR校正后仍显著（q < 0.05）；Bacillus与2,5-二甲基吡嗪呈正相关（ρ = 0.60），但经FDR校正后不显著；Weissella与多种酯类化合物呈正相关，但均未达FDR校正显著水平。在真菌分析中，Aspergillus与1-戊烯-3-醇呈显著负相关（ρ = ?0.98，q < 0.05），其他真菌属-挥发性化合物关联经FDR校正后均不显著。上述发现为微生物属-挥发性化合物共变异提供了初步证据，但由于每种豆豉仅代表单一生产批次，观察到的关联应解释为探索性关联而非直接因果证据。
讨论部分总结：该研究综合GC-IMS挥发性风味化合物分析与高通量测序技术，系统研究了豆豉微生物群落结构及其与风味形成的潜在关系。研究指出，3种豆豉具有不同的微生物群落组成和挥发性风味轮廓，Spearman相关分析对优势细菌和真菌属与特定挥发性化合物之间的潜在关系进行了定量评估，但观察到的关联未能一致支持Bacillus和Weissella对特定吡嗪类、酯类和酸类形成的预期贡献。鉴于每种豆豉仅代表单一生产批次，上述发现应解释为探索性关联而非直接代谢贡献的证据。此外，细菌群落分析基于338F/806R引物对16S rRNA基因V3–V4区的扩增，存在一定方法学局限：引物-模板错配和不同细菌类群间扩增效率差异可能引入检测偏倚；V3–V4区有限的序列信息可能无法可靠区分近缘细菌种（包括部分Bacillus成员）；16S rRNA基因拷贝数在细菌类群间的变异可能进一步影响基于序列的相对丰度估计。因此，观察到的Bacillus优势应解释为相对扩增子序列丰度而非绝对细菌细胞丰度。未来研究纳入独立发酵批次、全长16S rRNA基因测序或鸟枪法宏基因组学、定量PCR及可控接种实验，将有助于提高分类分辨率并阐明特定微生物在豆豉风味形成中的作用。
研究结论翻译：本研究利用GC-IMS技术结合高通量测序，系统分析了不同产地发酵豆豉中挥发性风味化合物的组成及微生物群落结构。结果表明，3种豆豉样品中共检测到76种挥发性化合物，主要包括酯类、醇类、醛类、酮类、酸类和吡嗪类。3种豆豉的挥发性化合物相对GC-IMS峰体积轮廓存在明显差异。LYDC的酯类类别水平相对贡献较高，吡嗪类贡献略高；TCDC的酮类、醇类和醛类贡献相对较高；TRDC则以酸类为主，其相对峰体积贡献之和为63.84%。在已鉴定的挥发性信号中，3-甲基丁酸-D在TRDC中的相对峰体积百分比尤其高（25.29%）。这些挥发性信号轮廓差异为理解3种豆豉的独特特征提供了化学基础。高通量测序结果共获得614,861条细菌序列和910,474条真菌序列，样品间微生物群落结构存在显著差异。在属水平上，Bacillus为3种豆豉中最丰富的细菌属，但其相对丰度在样品间存在差异；Weissella在LYDC中也相对丰富，尤其在LY2样品中。真菌群落中，Aspergillus在LYDC和TCDC中占主导地位，而Scytalidium为TRDC的优势属。探索性Spearman相关分析进一步识别了优势细菌和真菌属与特定挥发性化合物之间的关联，提示微生物群落变异与3种豆豉风味分化之间可能存在潜在关系。然而，这些观察性关联并未建立特定微生物类群与挥发性化合物形成之间的直接因果关系。未来需开展涉及独立发酵批次、时间分辨采样和可控发酵实验的研究，以阐明微生物群落对豆豉风味形成的功能贡献。
