《Cancer Reports》：Gene Expression Profiling and Clinical Validation Reveal CEBPB for Early Diagnosis of Esophageal Squamous Cell Carcinoma
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背景：食管鳞状细胞癌（ESCC）占亚洲食管癌病例的90%以上，早期阶段缺乏可靠的生物标志物且症状不明显，导致诊断延迟和预后不良。目的：本研究旨在筛选并验证早期ESCC的潜在诊断生物标志物，并探索其在肿瘤免疫微环境中的调控作用。方法与结果：本研究采用加权基因共表
背景：食管鳞状细胞癌（ESCC）占亚洲食管癌病例的90%以上，早期阶段缺乏可靠的生物标志物且症状不明显，导致诊断延迟和预后不良。目的：本研究旨在筛选并验证早期ESCC的潜在诊断生物标志物，并探索其在肿瘤免疫微环境中的调控作用。方法与结果：本研究采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）识别了1,204个与T1期肿瘤强相关的基因。差异分析显示448个上调差异表达基因（DEGs），主要富集于免疫和肿瘤相关通路。通过交叉分析，构建了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络并识别出7个关键基因。外部数据集验证和受试者工作特征（ROC）曲线分析显示两个关键基因（CEBPB和CXCL8）具有良好的诊断效能（AUC > 0.8）。尽管CXCL8在GSE53625转录组数据集中显示出更优的诊断性能，但研究人员基于组织样本中一致的免疫荧光验证结果优先选择CEBPB。Western blotting、免疫组织化学和免疫荧光在三对临床样本中初步验证了CEBPB的表达特征；在CEBPB作为潜在生物标志物应用于临床之前，需要更大规模的独立队列验证。免疫细胞浸润分析揭示ESCC组织中巨噬细胞群体发生显著变化。在ESCC中鉴定出五种不同的细胞类型，CEBPB在所有细胞类型中均有表达。组织干细胞和上皮细胞显示出强的细胞间通讯，而TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)广泛表达。结论：本研究突出CEBPB作为ESCC的潜在生物标志物，揭示其通过调节免疫微环境在肿瘤进展和转移中的作用，为ESCC的及时识别和精准管理提供了见解。
**研究背景与意义**
食管癌（ESCA）是2020年全球第六大死亡原因，其中食管鳞状细胞癌（ESCC）在中国占所有食管癌病例的80%以上。由于早期ESCC缺乏体重减轻、吞咽困难等明显症状，原位癌的检测常被延迟，增加了疾病进展为浸润性癌的可能性。ESCC患者5年生存率约为15%–20%，然而及时识别可将生存率显著提高至85%。目前早期ESCC的诊断主要依赖内镜联合活检，但胃肠道黏膜细微变化的准确识别常面临挑战，传统血清肿瘤标志物对ESCC的诊断精度相对有限。尽管组学技术的发展推动了游离DNA标志物、代谢物、唾液细胞外microRNA、血清长链非编码RNA（lncRNAs）、自身抗体及人工智能方法等新型生物标志物的研究，但这些策略受限于对先进技术平台的依赖、方法学不一致性或高成本等因素，难以在临床环境中广泛实施。因此，开发灵敏、特异、可靠且经济的诊断方法以满足ESCC早期检测和治疗的需求迫在眉睫。本研究聚焦于早期ESCC（EEC，定义为肿瘤侵犯局限于黏膜或黏膜下层的T1期ESCC）进展过程中的转录组变异分析，旨在发现早期ESCC识别的候选生物标志物，并进一步表征候选生物标志物如何参与重塑免疫微环境，为肿瘤微环境（TME）靶向抗肿瘤治疗的合理选择提供依据。
**关键技术方法**
研究人员采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）基于TCGA-ESCC队列（79例ESCC）识别与肿瘤分期相关的基因模块；利用Limma包鉴定差异表达基因（DEGs）；通过STRING数据库和Cytoscape软件构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，并使用MCODE和CytoHubba插件筛选核心基因；采用受试者工作特征（ROC）曲线评估诊断效能；利用CIBERSORT算法和TIMER2.0进行免疫浸润分析；通过单细胞转录组分析（GSE196756）解析细胞亚群和细胞间通讯；并使用Western blotting、免疫组织化学、免疫荧光和qRT-PCR在临床样本（哈尔滨医科大学附属第二医院伦理批准，3对ESCC及配对正常组织）和细胞系中进行实验验证。研究所用数据来源于TCGA、GTEx和GEO数据库（GSE17351、GSE44021、GSE77861、GSE53625、GSE196756）。
**研究结果**
**WGCNA探索与EEC相关的潜在生物标志物**：通过WGCNA分析（软阈值β=6），构建了无标度网络（R2=0.9），识别出与T1期肿瘤相关性最高的绿色模块，该模块包含1,204个基因，且基因显著性（GS）与模块成员度（MM）呈显著正相关（cor=0.5，p=3.7e-77）。
**ESCC中DEGs的鉴定**：分析ESCC与健康食管组织的基因表达，发现448个上调DEGs和887个下调DEGs。研究聚焦于上调DEGs进行后续筛选，因为升高的基因表达更适于基于抗体的免疫组织化学检测。
**功能富集分析与关键基因检测**：GO分析显示上调DEGs显著富集于细胞外基质（ECM）组织和结构相关生物学过程；KEGG分析显示显著富集于免疫反应和致癌通路。将448个上调DEGs与1,204个关键模块基因交叉分析，识别出37个重叠基因。通过MCODE插件获得聚类模块（评分：3.143，8个节点和11条边），CytoHubba-MCC插件识别出前10个核心基因，两种方法共同筛选出7个关键基因。对这7个关键基因的GO富集分析显示其分子功能主要与RNA聚合酶II核心启动子序列特异性DNA结合相关；KEGG富集分析显示显著富集于TNF信号通路和IL-17信号通路。
**关键基因的外部数据集验证**：整合GSE17351、GSE44021和GSE77861数据集（共18例ESCC和18例对照）进行批次校正后验证，肿瘤组中CXCL8、SOCS3、CEBPB和SPRR2G表达显著上调。利用GSE53625数据集评估基因与肿瘤分期的关系，发现CEBPB和CXCL8在肿瘤组织和T1期肿瘤中均显著上调。ROC曲线分析显示，在TCGA-GTEx数据集中CEBPB和CXCL8的AUC分别为0.997和0.949；在整合数据集中CEBPB的AUC为0.931，CXCL8的AUC为0.920；在GSE53625数据集中CEBPB和CXCL8的AUC分别为0.849和0.910。因此，EEC的关键基因被确定为CEBPB和CXCL8。
**ESCC免疫景观分析**：GSEA显示关键基因显著富集于肿瘤和免疫相关通路。CIBERSORT算法评估TCGA-GTEx队列中22种免疫细胞的浸润比例，结果显示ESCC组织中巨噬细胞分布发生显著改变，M0和M1巨噬细胞比例在ESCC组织中显著高于健康组织，而健康组织中M2巨噬细胞丰度更高。TIMER2.0分析显示CEBPB和CXCL8表达水平与M0和M1巨噬细胞浸润呈强正相关（Cor=0.308，Cor=0.310；Cor=0.374，Cor=0.536），与M2巨噬细胞浸润呈负相关（Cor=?0.409，Cor=?0.374）。
**关键基因表达的实验验证**：基于3对ESCC及配对健康组织的初步实验验证显示，白光胃镜下食管左侧壁和前壁呈现粗糙质地，伴有轻微隆起的白色斑块；共聚焦微内镜显示鳞状上皮排列极性丧失，毛细血管环紊乱扭曲。H&E染色显示EEC组黏膜鳞状上皮严重异型增生，核增大、深染、极性破坏、排列不规则。Western blotting显示EEC患者中CEBPB和CXCL8表达显著上调（n=3对样本，CEBPB p=0.0004，CXCL8 p=0.0002）。qRT-PCR和Western blotting分析显示ESCC细胞系Eca109中两基因在mRNA和蛋白水平均较正常食管上皮细胞系Het-1A显著上调（p<0.05）。免疫组织化学显示EEC组恶性肿瘤浸润至黏膜下层，异型癌细胞核和细胞质呈强染色，CEBPB和CXCL8在EEC组与HC组间表达水平显著差异（p<0.05）。免疫荧光分析显示CEBPB在EEC患者中广泛表达于细胞质，与Western blotting和免疫组织化学趋势一致。然而，CXCL8在石蜡切片中未能产生可解释的免疫荧光信号，限制了对CXCL8在单细胞水平的进一步蛋白定位分析。
**ESCC单细胞分析**：单细胞转录组分析质量控制后确定20个聚类为最优，t-SNE聚类分析揭示11个不同细胞簇，进而区分出5种细胞亚型：T细胞、B细胞、上皮细胞、单核细胞和组织干细胞。CEBPB在所有细胞亚型中均有表达。细胞通讯分析显示所有细胞亚型间均存在细胞通讯，其中上皮细胞和组织干细胞与其他细胞表现出强的细胞间通讯。TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)在所有细胞中广泛表达。
**讨论与结论**
讨论部分指出，TNM系统主要用于ESCC的临床分期，但当前影像技术在区分淋巴结转移和T分期方面准确性有限，成功率仅约50%。生物标志物与临床病理参数相结合对促进EEC的内镜诊断至关重要。本研究通过WGCNA和互补分析方法识别了ESCC中CEBPB的上调并验证了其良好的诊断性能。值得注意的是，CXCL8在GSE53625队列中mRNA水平的AUC（0.910）高于CEBPB（0.849），但CXCL8的强转录组诊断性能未在患者组织标本的蛋白水平完全重现，免疫组织化学仅显示EEC组织中CXCL8蛋白丰度轻微增加，且未能获得可靠的免疫荧光信号；相比之下，CEBPB的差异表达通过免疫组织化学和免疫荧光两种方法均得到验证。因此，CEBPB被选为标题和摘要中强调的核心分子。肿瘤微环境对癌症进展和治疗反应至关重要，肿瘤相关巨噬细胞是TME的主要组成部分。大多数既往研究在晚期ESCC中观察到丰富的M2型肿瘤相关巨噬细胞，通过免疫抑制和ECM重塑促进肿瘤进展；然而本研究基于TCGA-GTEx队列的CIBERSORT结果显示早期T1期ESCC中M0和M1巨噬细胞富集，而正常食管黏膜中M2巨噬细胞更多，这一差异源于所研究的疾病阶段不同。早期癌前病变触发以未分化M0和抗肿瘤M1巨噬细胞为主的急性抗肿瘤炎症，无大规模M2极化。功能分析显示CEBPB显著富集于ECM及其相关结构以及"ECM-受体相互作用"通路。研究提取的细胞通讯信息揭示TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2)在所有细胞亚型中普遍存在，但该观察仅反映转录组细胞间通讯，当前测序数据无法确认TGF-β信号对CEBPB相关通路的直接调控作用。CEBPB蛋白具有碱性亮氨酸拉链模式，作为转录因子在控制细胞生长和发育及肿瘤形成中具有关键功能。基于已发表文献，CEBPB/TGF-β/Snail/EMT调控通路被总结于图6。本研究通过多组学数据和临床样本仅证明CEBPB在早期ESCC中高表达并具有诊断价值，但TGF-β信号通路与CEBPB之间的因果关系需要进一步功能验证。潜在生物标志物CEBPB在辅助ESCC及时诊断和个性化治疗方面显示出前景。研究的局限性包括公共数据库的限制和人类食管组织中实验验证较少，未来研究需要扩大样本多样性、纳入标准化检测方法并进行临床验证。此外，单细胞转录组分析仅表征了广泛的细胞谱系以映射CEBPB在早期ESCC中的一般表达，未进一步对单核细胞和上皮祖细胞亚群进行亚聚类分析。
研究结论翻译：本研究突出CEBPB作为ESCC的潜在生物标志物，揭示其通过调节免疫微环境在肿瘤进展和转移中的作用，为ESCC的及时识别和精准管理提供了见解。CEBPB在及时检测和识别ESCC方面的显著有效性表明其作为促进癌症筛查和诊断的宝贵资产的潜力。此外，CEBPB可能在ESCC进展和播散的早期阶段调节免疫微环境中发挥重要的调控作用。
