《Acta Neurologica Scandinavica》：Melatonin Attenuates Bax/Bcl-2 Pathway–Associated Apoptosis After Traumatic Brain Injury Through Enhanced Mitophagy
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背景：创伤性脑损伤（TBI）可导致永久性神经功能缺损，其中细胞凋亡对预后具有关键性影响。Bax/Bcl-2通路相关的线粒体凋亡是重要的内源性死亡级联反应。线粒体自噬（mitophagy）参与TBI病理过程；然而，褪黑素（Mel）能否通过线粒体自噬调控Bax/B
背景：创伤性脑损伤（TBI）可导致永久性神经功能缺损，其中细胞凋亡对预后具有关键性影响。Bax/Bcl-2通路相关的线粒体凋亡是重要的内源性死亡级联反应。线粒体自噬（mitophagy）参与TBI病理过程；然而，褪黑素（Mel）能否通过线粒体自噬调控Bax/Bcl-2通路相关凋亡尚不清楚。方法：分别采用氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理的HT22细胞和Feeney自由落体小鼠模型建立体外和体内TBI模型。通过蛋白质印迹法检测两种模型中LC3B、p62、COX IV和TOM20水平的变化以评估线粒体自噬。此外，体外采用透射电子显微镜（TEM）检查线粒体超微结构，体内采用免疫荧光评估LC3B/TOM20和TOM20/LAMP2共定位。同时，通过蛋白质印迹法检测Bax和Bcl-2表达。体外采用流式细胞术、体内采用TUNEL染色评估细胞凋亡。结果：TBI增强了线粒体自噬，升高了Bax/Bcl-2比值，并加重了细胞凋亡。使用环孢素A（CsA）药理学抑制线粒体自噬进一步上调Bax、下调Bcl-2，并加剧凋亡性细胞死亡。褪黑素处理在两种模型中均显著增强线粒体自噬，导致Bax/Bcl-2比值降低和凋亡减轻。值得注意的是，联合给予CsA可减弱褪黑素的抗凋亡效应，提示其保护作用至少部分通过增强线粒体自噬介导。结论：褪黑素至少部分通过增强线粒体自噬来减轻TBI诱导的细胞凋亡，进而抑制Bax/Bcl-2通路相关的线粒体凋亡。这些发现提示线粒体自噬-Bax/Bcl-2轴可能是一个有前景的治疗靶点，褪黑素作为TBI治疗的潜在候选药物值得进一步研究。
创伤性脑损伤（TBI）每年影响近6900万人，与高死亡率和长期残疾密切相关，亟需改善TBI预后的策略。褪黑素（Mel）是松果体分泌的激素，具有强大的抗氧化和抗炎特性。临床证据显示Mel可改善TBI患者的睡眠障碍；临床前研究表明Mel通过抑制铁死亡和内质网应激减轻TBI后神经功能缺损；值得注意的是，Mel通过抑制TBI后细胞凋亡发挥神经保护作用，例如通过上调K+-Cl?协同转运蛋白2（KCC2）。然而，Mel抗凋亡作用是否涉及其他通路仍不清楚。线粒体功能障碍参与TBI病理生理过程，受损线粒体释放促凋亡因子进入胞质，激活caspase级联反应并最终触发凋亡；及时清除受损线粒体可抑制凋亡。线粒体自噬是一种选择性自噬形式，通过自噬体-溶酶体降解清除受损或功能障碍的线粒体，对维持线粒体稳态至关重要。既往研究（包括研究人员所在团队的工作）已证实促进线粒体自噬可抑制TBI后神经炎症、氧化应激和神经元凋亡。Mel已被证明可通过增强线粒体自噬改善阿尔茨海默病小鼠模型的认知缺陷。然而，Mel是否通过线粒体自噬减少TBI诱导的凋亡尚不清楚。因此，研究人员建立了体内外TBI模型，以探究Mel是否通过线粒体自噬调控Bax/Bcl-2通路相关凋亡。
研究人员开展了以下研究：体外采用小鼠海马神经元HT22细胞，通过氧糖剥夺/复氧（OGD/R）构建TBI模型（无血清无糖DMEM、95% N2/5% CO2缺氧6 h后恢复正常培养条件复氧）；体内采用雄性C57BL/6J小鼠（8–10周龄，20–25 g），建立改良Feeney自由落体模型（右脑bregma后2 mm、中线旁2 mm处行4 mm开颅，保持硬脑膜完整，20 g砝码从20 cm高度坠落至暴露的硬脑膜）。32只动物随机分为4组（每组n = 8），TBI组中6只小鼠被排除（4只24 h内死亡，2只无法进食饮水），并以6只接受相同处理的额外小鼠替换，最终每组分析动物数保持8只。术后24 h处死所有小鼠，每组4只用于蛋白质印迹法，其余用于免疫荧光和TUNEL染色；由于部分切片存在组织损伤、染色失败或共定位信号不清，每组3只切片质量合格的小鼠纳入最终免疫荧光和TUNEL分析。Mel（50 μmol/L）或CsA（5 μmol/L）于氧糖剥夺后立即加入培养基；体内Mel（10 mg/kg）于TBI后15 min腹腔注射，并于TBI后1、6、12 h追加注射；CsA（20 mg/kg）于TBI后15 min和12 h腹腔注射。实验设计包括：预实验评估CsA、DMSO和Mel的内在毒性；Part 1设Ctrl、TBI、TBI+CsA三组HT22细胞，检测线粒体自噬相关蛋白、Bax、Bcl-2表达、线粒体超微结构、细胞活力、LDH释放和凋亡率，以检验抑制线粒体自噬对TBI后Bax/Bcl-2通路相关凋亡的影响；Part 2设Ctrl、TBI、TBI+Mel、TBI+Mel+CsA四组HT22细胞，进行相同分析，以确定Mel是否通过线粒体自噬减轻TBI诱导的Bax/Bcl-2通路相关凋亡；Part 3将小鼠随机分为Ctrl、TBI、TBI+Mel、TBI+Mel+CsA四组，通过蛋白质印迹法评估线粒体自噬相关蛋白和Bax/Bcl-2比值，免疫荧光检测LC3B与TOM20（自噬体-线粒体关联）及TOM20与LAMP2（线粒体-溶酶体融合）共定位，TUNEL染色定量凋亡细胞比例，以在体内验证Mel增强线粒体自噬进而减轻TBI诱导的Bax/Bcl-2相关凋亡。研究得出结论：线粒体自噬有助于减轻TBI后细胞死亡；Mel至少部分通过增强线粒体自噬减轻线粒体介导的凋亡并降低Bax/Bcl-2比值；CsA不仅加重TBI诱导的损伤，还部分逆转Mel的神经保护作用，表明线粒体自噬至少部分参与介导Mel的药理作用。这些结果提示线粒体自噬与Bax/Bcl-2通路相关凋亡之间存在调控联系，可能为TBI治疗的进一步临床前研究提供有前景的基础。该研究的重要意义在于进一步支持Mel在TBI中的神经保护作用，并为线粒体自噬与TBI后凋亡信号调控之间的机制联系提供证据，提示线粒体自噬-Bax/Bcl-2轴可能是有前景的治疗靶点。
主要关键技术方法：研究采用HT22细胞OGD/R体外TBI模型和改良Feeney自由落体小鼠TBI模型（动物来源为徐州医科大学动物中心），以CsA作为线粒体自噬药理学抑制工具；通过蛋白质印迹法检测LC3B、p62、TOM20、COX IV、Bax、Bcl-2及GAPDH（以GAPDH归一化，ImageJ定量）；采用透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构和线粒体自噬体形成；采用免疫荧光双标检测LC3B/TOM20和TOM20/LAMP2共定位；采用Annexin V-APC/7-AAD流式细胞术和TUNEL染色评估凋亡；采用CCK-8法和LDH释放实验评估细胞活力与细胞膜完整性；统计分析采用SPSS 22.0，连续数据以mean ± SD表示，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Tukey's或Games-Howell's事后检验，双侧p < 0.05为差异有统计学意义。
研究结果：（1）CsA和Mel在HT22细胞中缺乏内在细胞毒性：通过CCK-8和LDH释放实验在Ctrl、Ctrl+DMSO、Ctrl+CsA、Ctrl+Mel四种条件下评估，各组间无显著差异（p > 0.05），表明CsA（5 μmol/L）、DMSO（溶剂）或Mel（50 μmol/L）单独不影响正常条件下HT22细胞活力或膜完整性，为后续机制实验提供基础。（2）CsA在体外减弱TBI诱导的线粒体自噬：通过蛋白质印迹法检测发现，与Ctrl组相比，TBI导致LC3B-II/I比值大幅升高、p62、TOM20和COX IV水平降低，表明线粒体自噬激活；CsA处理部分逆转这些变化，LC3B-II/I比值降低而p62、TOM20和COX IV水平较TBI组升高，提示CsA减弱HT22细胞中TBI诱导的线粒体自噬。（3）CsA在体外减少TBI后线粒体自噬体形成：通过TEM检查线粒体超微结构，TBI诱导线粒体自噬体形成，TBI组线粒体自噬体数量显著多于Ctrl组；CsA处理较TBI组显著减少线粒体自噬体数量，提供CsA抑制HT22细胞中TBI诱导线粒体自噬的超微结构证据。（4）CsA在体外加剧TBI诱导的细胞损伤：CCK-8实验显示TBI较Ctrl组降低细胞活力，CsA处理较TBI组进一步显著降低细胞活力；LDH释放（细胞膜损伤指标）在TBI后显著增加，CsA处理进一步升高LDH水平，表明CsA减弱线粒体自噬加剧HT22细胞中TBI诱导的细胞损伤。（5）CsA在体外诱导TBI后Bax/Bcl-2平衡偏移：蛋白质印迹法显示TBI较Ctrl组显著升高Bax表达、降低Bcl-2表达，导致Bax/Bcl-2比值升高；CsA处理较TBI组进一步上调Bax、下调Bcl-2并升高Bax/Bcl-2比值，提示CsA抑制线粒体自噬使TBI后Bax/Bcl-2平衡向促凋亡方向偏移。（6）CsA在体外加剧TBI诱导的凋亡：Annexin V-APC/7-AAD流式细胞术显示TBI较Ctrl组大幅提高总凋亡率（包括早期和晚期凋亡细胞）；CsA处理较TBI组显著增加凋亡，表明CsA介导的线粒体自噬抑制加剧HT22细胞中TBI诱导的凋亡。（7）Mel在体外促进TBI诱导的线粒体自噬且该效应被CsA减弱：蛋白质印迹法显示TBI较Ctrl组显著升高LC3B-II/I比值、降低p62、TOM20和COX IV水平，表明线粒体自噬激活；Mel处理显著增强这些改变；与TBI+Mel组相比，CsA共处理抑制Mel的效应，表现为LC3B-II/I比值降低、p62、TOM20和COX IV水平升高，提示CsA抑制HT22细胞中TBI后Mel促进的线粒体自噬。（8）Mel在体外促进TBI后线粒体自噬体形成且该效应被CsA减弱：TEM显示TBI诱导线粒体自噬体形成，Mel处理组线粒体自噬体数量显著多于TBI组；CsA共处理显著减少Mel诱导的线粒体自噬体形成增加，提供Mel促进HT22细胞中TBI诱导线粒体自噬的超微结构证据，而CsA抑制该过程。（9）Mel在体外减轻TBI诱导的细胞损伤且该效应被CsA削弱：CCK-8显示TBI较Ctrl组显著降低细胞活力，Mel处理较TBI组显著改善细胞活力；CsA共处理较TBI+Mel组显著降低细胞活力。LDH释放在TBI后显著增加，Mel处理较TBI组显著降低LDH释放；与TBI+Mel组相比，CsA共处理部分逆转该效应并增强LDH释放，表明Mel减轻TBI诱导的细胞损伤而CsA削弱该保护作用。（10）Mel在体外调控TBI后Bax和Bcl-2表达且该效应被CsA减弱：TBI显著升高Bax表达、降低Bcl-2表达，导致Bax/Bcl-2比值升高；Mel处理显著逆转这些改变，表现为Bax下调、Bcl-2上调及Bax/Bcl-2比值降低；与TBI+Mel组相比，CsA共处理部分逆转Mel的效应，导致Bax上调、Bcl-2下调及Bax/Bcl-2比值升高，提示CsA部分逆转Mel对TBI后Bax和Bcl-2水平的影响。（11）Mel在体外抑制TBI诱导的凋亡且该效应被CsA减弱：TBI较Ctrl组大幅提高总凋亡率，Mel处理较TBI组显著降低凋亡率；与TBI+Mel组相比，CsA共处理减弱Mel的抗凋亡活性导致凋亡率升高，提示CsA减弱Mel对HT22细胞中TBI诱导凋亡的抑制作用。（12）Mel在体内促进TBI后线粒体自噬且该效应被CsA减弱：蛋白质印迹法检测脑组织中线粒体自噬相关蛋白，与Ctrl组相比TBI显著升高LC3B-II/I比值、降低p62、TOM20和COX IV水平，表明线粒体自噬激活；Mel处理较TBI组进一步强化这些改变；CsA共处理较TBI+Mel组抑制Mel的效应，导致LC3B-II/I比值降低、p62、TOM20和COX IV水平升高，提示Mel在体内促进TBI后线粒体自噬且该效应被CsA抑制，与体外结果一致。（13）Mel在体内增强TBI后线粒体自噬体-溶酶体共定位且该效应被CsA减弱：免疫荧光检测脑组织中LC3B与TOM20及TOM20与LAMP2共定位，TBI诱导LC3B与TOM20共定位，表明线粒体被自噬体隔离；Mel处理较TBI组显著增强LC3B/TOM20共定位，CsA共处理大幅降低该增加，TBI+Mel组LC3B/TOM20共定位积分光密度（IOD）显著高于TBI组而CsA抑制该效应。同样，反映自噬体-溶酶体融合的TOM20/LAMP2共定位在TBI后增加，表明线粒体向溶酶体递送增强，Mel处理进一步增强该共定位而CsA共处理抑制该效应，定量分析证实这些观察，提示Mel在体内增强TBI后线粒体自噬（表现为LC3B/TOM20和TOM20/LAMP2共定位增加）且CsA抑制该效应。（14）Mel在体内调控TBI后小鼠皮层Bax和Bcl-2表达且该效应被CsA减弱：TBI显著上调Bax、下调Bcl-2，导致Bax/Bcl-2比值升高；Mel处理显著逆转这些改变，表现为Bcl-2升高和Bax降低；与TBI+Mel组相比，CsA共处理部分逆转Mel对Bax和Bcl-2表达的影响，导致Bax上调、Bcl-2下调及Bax/Bcl-2比值升高，与体外数据一致，提示Mel调控TBI后小鼠脑组织中Bax和Bcl-2表达且该效应被CsA减弱。（15）Mel在体内抑制TBI后小鼠皮层凋亡且该效应被CsA减弱：TBI较Ctrl组显著增加小鼠皮层TUNEL阳性细胞比例，Mel处理较TBI组大幅降低TUNEL阳性细胞比例；CsA共处理减弱Mel的抗凋亡效应，导致TUNEL阳性细胞比例高于TBI+Mel组，与体外结果一致，提示Mel减少TBI后小鼠皮层凋亡且该效应被CsA减弱。
讨论部分总结：研究人员在TBI细胞和动物模型中证明，Mel至少部分通过增强线粒体自噬减轻Bax/Bcl-2通路相关凋亡，这些发现进一步支持Mel在TBI中的神经保护作用，并为线粒体自噬与TBI后凋亡信号调控之间的机制联系提供证据。大量研究证实神经元凋亡是TBI病理发展和预后的关键因素，凋亡调控机制复杂涉及多种通路，其中Bax/Bcl-2轴是 pivotal 级联；促凋亡蛋白Bax响应死亡信号发生结构变化，从胞质转位至线粒体外膜，增加膜通透性，释放促凋亡因子进入胞质从而启动凋亡；抗凋亡蛋白Bcl-2则通过隔离BH3-only蛋白或经其BH1-3结构域直接结合Bax，阻断Bax活化和转位，维持线粒体外膜完整性；细胞对凋亡刺激的敏感性由Bcl-2与Bax之间的动态平衡决定；在经典线粒体凋亡级联中，Bax/Bcl-2比值升高促进Caspase-3激活，执行凋亡终末阶段。本研究中TBI导致细胞死亡增加、Bax表达升高、Bcl-2表达下调及Bax/Bcl-2比值升高，表明Bax/Bcl-2通路相关凋亡参与TBI后病理过程。值得注意的是，Bax/Bcl-2通路相关内源性凋亡与线粒体自噬密切相关，例如在糖尿病视网膜病变中激活线粒体自噬通过上调Bcl-2和下调Bax逆转视网膜色素上皮细胞凋亡；在铜暴露肝细胞中PINK1/Parkin介导的线粒体自噬通过降低Bax/Bcl-2比值负调控凋亡性细胞死亡。本研究提示线粒体自噬可能通过Bax/Bcl-2相关通路保护免受TBI诱导的凋亡并作为代偿性保护反应，因为体外TBI模型中抑制线粒体自噬增加Bax表达、降低Bcl-2表达并增强凋亡。有研究提出线粒体损伤可通过释放过量活性氧（ROS）激活Bax从而触发凋亡，而线粒体自噬有效降低ROS水平并抑制凋亡；此外Saita等证明在线粒体自噬过程中Bcl-2和抗凋亡蛋白FKBP38从线粒体转位至内质网，从而逃避自噬降解；这些发现为线粒体自噬降低Bax/Bcl-2比值提供机制解释：通过限制ROS介导的Bax激活和通过保护Bcl-2免于自噬降解。Mel是神经内分泌激素，已被证明对多种神经系统疾病具有保护作用，如帕金森病、蛛网膜下腔出血和脑缺血事件；值得注意的是Lin等发现Mel通过促进线粒体自噬减轻TBI后神经炎症，尽管其研究聚焦线粒体自噬的抗炎效应，本研究结果延伸了该研究方向，表明线粒体自噬还通过Bax/Bcl-2通路调控凋亡信号。本研究中Mel处理上调LC3B-II表达而p62、TOM20和COX IV水平下调，这些数据连同TEM和免疫荧光双标提示Mel在TBI后刺激线粒体自噬；Mel还减轻凋亡并降低Bax/Bcl-2比值；此外CsA共处理减弱Mel的抗凋亡和保护效应；总之这些结果提示Mel至少部分通过增强线粒体自噬发挥抗凋亡神经保护作用。进一步考虑是本研究中未直接检测Caspase-3、Caspase-9和细胞色素c，然而TUNEL和Annexin V实验捕获凋亡终末执行阶段，且Bax/Bcl-2/Caspase-3轴在TBI模型中已被充分记录；Liu等报道损伤皮层神经元中Bax/Bcl-2比值、Caspase-3和凋亡平行达峰；同样circMETTL9被证明通过线粒体介导的Bax/Bcl-2/Caspase-3信号在TBI后诱导凋亡；这些发现支持Bax/Bcl-2比值变化与下游caspase介导凋亡之间的联系，未来需要直接检测Caspase-3、Caspase-9和细胞色素c的研究。
局限性：本研究存在若干局限性。第一，尽管CsA常被用作抑制线粒体自噬的药理学工具，它同时也抑制亲环素D（CypD）和线粒体通透性转换孔（mPTP），因此CsA的部分效应可能反映mPTP抑制而非单纯线粒体自噬抑制，未来需要采用遗传学方法确认线粒体自噬的具体贡献。第二，线粒体自噬在细胞培养中通过蛋白质印迹法结合TEM评估，在小鼠TBI模型中通过蛋白质印迹法结合免疫荧光共定位评估，研究人员认识到这些方法捕获的是线粒体自噬相关标志物的稳态变化而非直接测量动态线粒体自噬通量，未来需要纳入溶酶体抑制剂的研究以严格评估TBI中的线粒体自噬通量。第三，体内实验聚焦分子和组织学终点，未包括功能性神经学评估如mNSS、运动功能测试或脑水肿和梗死体积评估，未来需要纳入这些功能终点以更全面评估Mel在TBI中的神经保护作用。第四，TUNEL阳性细胞未与神经元标志物共染，体内实验中的凋亡不能确定归因于神经元，未来需要TUNEL与NeuN共染的研究。
研究结论翻译：总之，本研究提示线粒体自噬有助于减轻TBI后细胞死亡。Mel至少部分通过增强线粒体自噬减轻线粒体介导的凋亡并降低Bax/Bcl-2比值。值得注意的是，CsA处理不仅加剧TBI诱导的损伤，还部分逆转Mel的神经保护效应，表明线粒体自噬至少部分参与介导Mel的药理作用。这些结果提示线粒体自噬与Bax/Bcl-2通路相关凋亡之间存在调控联系，并可能为TBI治疗的进一步临床前研究提供有前景的基础。
