《Genetics Research》：A Single-Cell-Derived Proliferative Signature Is Associated With Progression-Free Survival During Immunotherapy and Sunitinib Treatment in Clear Cell Renal Cell Carcinoma
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背景：免疫检查点抑制剂（ICI）与血管内皮生长因子受体（VEGFR）靶向药物耐药限制了透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的持久疾病控制。研究人员考察了肿瘤细胞增殖转录程序与治疗反应及无进展生存期（PFS）的关系。方法：研究人员分析了抗PD-1治疗的ccRCC患者以
背景：免疫检查点抑制剂（ICI）与血管内皮生长因子受体（VEGFR）靶向药物耐药限制了透明细胞肾细胞癌（ccRCC）的持久疾病控制。研究人员考察了肿瘤细胞增殖转录程序与治疗反应及无进展生存期（PFS）的关系。方法：研究人员分析了抗PD-1治疗的ccRCC患者以非配对为主的基线与进展期单细胞转录组。一个固定的20基因特征（signature）接受了患者校正的伪批量（pseudobulk）与RNA推断拷贝数分析。治疗前评分在来自三项研究的四个免疫治疗或舒替尼治疗组的332例患者中评估，并采用既定增殖基准与时间依赖生存分析。结果：发现性比较纳入5例基线与6例进展患者。经患者校正后，全部20个基因（包括PLK1、UBE2C与CDC20）在增殖簇中保持较高表达，但其丰度差异未通过多重检验校正（BH校正q = 0.164）。评分与G2M密切跟踪（r = 0.915–0.980），在主要基准中未显示更优的PFS判别能力。包容性反应AUC在IMmotion150免疫治疗为0.519，IMmotion150舒替尼为0.569，E-MTAB-3267为0.693。在E-MTAB-3267中，年龄与性别校正的HR为每评分标准差1.54（95% CI 1.13–2.11）。IMmotion150免疫治疗关联随随访减弱；排除该非比例估计后，158例患者的合并HR为1.51（95% CI 1.24–1.83）。结论：单细胞与批量转录组分析将增殖基因表达程序与ccRCC免疫治疗及舒替尼治疗期间的不良PFS相联系。该特征提供了与治疗结局相关的增殖的紧凑转录读数，其与PFS的关系强于与客观反应的关系。
研究背景：透明细胞肾细胞癌（ccRCC）是肾细胞癌最主要的组织学类型，占肾癌死亡的大多数。免疫检查点抑制剂（ICI）与血管内皮生长因子受体（VEGFR）导向的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）改变了晚期疾病的治疗格局，但治疗反应差异显著，持久疾病控制难以从治疗前肿瘤图谱预测。转录组研究已将这种差异与多个相互作用的生物学程序相联系：IMmotion150将血管生成、T效应/干扰素-γ信号与髓系炎症与含阿替利珠单抗治疗及舒替尼治疗的结局相关联；IMmotion151识别出以血管生成、免疫、基质、代谢与细胞周期活性区分的分子亚群；Beuselinck等描述了与舒替尼反应及生存相关的ccRCC亚型。这些研究提示肿瘤增殖活性应与血管与免疫特征一并考虑，而非假定其识别对某一治疗的耐药。单细胞测序可将这些转录程序定位至单个细胞群体：Bi等识别了晚期RCC中血管生成信号与免疫逃逸程序不同的癌细胞状态，Krishna等将多区域免疫状态与治疗疗效相联系，HCRN研究将三级淋巴结构与耗竭的组织驻留T细胞与PD-1阻断反应相联系并提供基线与进展期单细胞图谱。增殖本身并非新预后概念：细胞周期进展评分与局限期ccRCC切除后转移相关。尚需确立的是在肿瘤细胞中定义的紧凑程序如何与晚期治疗疾病结局相关，以及是否在既定增殖指标之外增加信息。为此，研究人员在HCRN数据集中表征增殖簇，从原始簇筛选中保留固定20基因集，并在三项临床研究的四个治疗组中评估其基于秩的评分；采用患者校正表达分析与RNA推断拷贝数图谱检验单细胞证据，随后将评分与G2M及E2F特征比较，并评估客观反应、PFS及PFS关联随随访的变化。
研究人员开展的研究与结论：这是一项回顾性研究，整合以非配对为主的单细胞发现系列与来自三项临床研究的四个治疗前转录组分析组。HCRN单细胞数据集用于表征在抗PD-1进展时采集样本中观察丰度较高的候选肿瘤细胞群体并定义其基因；所得基因集在分析临床队列反应或PFS前冻结。IMmotion150含阿替利珠单抗组与CheckMate 009构成ICI评估系列，IMmotion150舒替尼组与E-MTAB-3267构成VEGFR导向TKI系列；未估计特征系数或基因权重，未选择结局优化评分截断值。结论为：单细胞与批量转录组分析将增殖基因表达程序与ccRCC免疫治疗及舒替尼治疗期间的不良PFS相联系；该特征提供与治疗结局相关的增殖的紧凑转录读数，其与PFS的关系强于与客观反应的关系。重要意义在于将单细胞定义的肿瘤细胞群体与紧凑增殖活性度量相联系，并把其PFS关联置于既定细胞周期生物学框架内。
关键技术方法：单细胞数据处理采用Seurat（Read10X、NormalizeData、FindVariableFeatures、主成分分析）与Harmony以样本身份为分组变量校正技术变异，Louvain聚类与UMAP降维；谱系注释采用四套标记面板（候选肿瘤、免疫、内皮、成纤维细胞）计算平均对数归一化表达；RNA推断拷贝数采用inferCNV（以样本内 annotated 免疫细胞为参考、保留校准细胞、mean-expression cut-off 0.1、101基因平滑窗、SD倍数1.5去噪、无隐马尔可夫模型）；患者水平簇丰度筛选采用单侧Wilcoxon秩和检验与Benjamini–Hochberg校正；固定特征与患者校正表达分析采用Seurat Wilcoxon检验（FindMarkers）与edgeR（filterByExpr、TMM归一化、稳健离散度估计、拟似然模型，含患者与状态项）；功能富集采用fgsea对50个Hallmark集分析；批量转录组预处理中E-MTAB-3267原始Affymetrix Human Gene 1.0 ST CEL文件经oligo与Biobase读取、背景校正、分位数归一化与RMA汇总；基于秩的评分按样本内平均百分位秩计算；生存分析采用Cox模型、Schoenfeld残差检验比例风险、时间ROC（timeROC 0.4.1）与逆删失概率加权（IPCW）；合并分析采用逆方差加权固定效应与DerSimonian–Laird估计及患者自助法。样本队列来源：HCRN单细胞数据来自Dryad（doi:10.5061/dryad.dv41ns28r），IMmotion150与CheckMate 009来自iAtlas协调的cBioPortal资源（rcc_iatlas_immotion150_2018与ccrcc_iatlas_choueiri_2016），E-MTAB-3267来自ArrayExpress/BioStudies。
研究结果：（1）单细胞图谱与RNA-CNV分析表征候选肿瘤区室：ccRCC图谱含14个样本、13例患者的62,344个质控后细胞，其中7533个候选肿瘤细胞及不同免疫、内皮、成纤维与混合群体；患者水平标记汇总区分肾上皮表达与留出免疫群体；11个独立样本（5基线、6进展）贡献7188个候选细胞进入主要比较；全基因组排序RNA-CNV图谱与组水平负荷在样本间变异；3583个候选细胞（49.8%）超过样本内留出免疫阈值，包括863个簇4细胞中的293个（34.0%）；CNV限制后仅2个基线与6个进展样本保留至少50个细胞，受限丰度比较未满足每组5例要求。（2）簇4丰度差异经多重检验校正后不显著：13簇筛选中无簇达到BH校正q<0.05；簇4基线中位丰度0%、进展7.53%（单侧p=0.017；BH q=0.164），双侧分析p=0.034、BH q=0.148；其正的中位差在全部11次留一患者分析中保留；簇4含8例患者的863个细胞，最大样本贡献356个细胞（41.25%）；唯一双时间点患者基线344个候选细胞中3个、进展1404个中56个属簇4，该配对单独保留未用于估计纵向扩增。（3）患者校正表达分析支持固定20基因程序：5例进展患者在每状态20细胞主要阈值下贡献两种状态，得10个伪批量文库与15,199个检验基因；原特征全部20个基因在簇4表达更高，患者校正log2倍数变化4.71–6.39，全基因组最大BH q=0.00174；五细胞敏感性分析纳入8例患者（2基线、6进展），全部20个基因保持正向效应；个体患者对比显示该程序分布于患者间；全部100个基因×患者剔除对比在主要留一患者分析中保持正向，八患者敏感性分析160个对比同样保持正向；限制于CNV支持细胞后剩4例患者，全部20个基因在簇4仍更高，log2倍数变化4.98–6.77，全基因组q<0.001。（4）特征密切跟踪既定增殖评分：固定基因集与G2M检查点及E2F靶程序重叠；四个临床组中与G2M的Pearson相关0.915–0.980，与E2F为0.906–0.969；从比较集移除重叠基因后相关仍强（0.874–0.970）；全部评分对满足预设共线性标准；在相同174例IMmotion150 ICI患者的主要比较中，6个月IPCW PFS AUC对20基因评分为0.653、对G2M为0.664，配对差?0.011（95% CI ?0.028至0.006；p=0.217）；与G2M及E2F的次要6与12个月比较亦不精确，无一确立紧凑评分的优势；CheckMate 009各固定时点仅3个观察对照，未满足时间依赖AUC估计最低要求。（5）全转录组排序识别以增殖为主的状态：50个Hallmark通路分析将E2F、G2M与有丝分裂纺锤体活性列为完整患者校正排序中最强正向富集；E2F靶NES 3.84（BH q=1.10×10??3）、G2M检查点NES 3.75（q=5.17×10??2）、有丝分裂纺锤体NES 3.04（q=5.17×10?2?）；主要排序含全部15,199个表达过滤基因，五细胞敏感性排序含14,056个基因并保留强增殖通路富集；上皮–间充质转化未达校正阈值（NES=1.31；q=0.080）；固定基因贡献于这些增殖通路的前沿，患者水平表达汇总将20基因程序定位至簇4，支持一致的细胞周期程序而非独特的非增殖耐药机制。（6）评分对单基因缺失技术稳定：全部20个基因在各临床组均有代表，从存档表达矩阵重算复现全部332个原始评分至数值精度；逐基因剔除在80个队列×基因比较中与完整评分相关0.9966–0.9999；每水平与队列200次随机剔除中，剔除10个基因时中位相关仍为0.988–0.994，中位平均绝对评分差0.0061–0.0220，E-MTAB-3267偏差较大；固定基因间冗余因此较精确评分值更保留患者相对排序。（7）包容性ICI反应判别弱于早期PFS判别：IMmotion150 ICI包容性反应人群165例（48 CR/PR、117 SD/PD）；合并中位评分以下反应率22/82（26.8%）、以上26/83（31.3%），两个治疗臂内均无高评分不良排序；包容性AUC 0.519（95% CI 0.427–0.613；双侧p=0.702），探索性100例CR/PR对PD比较为0.641（95% CI 0.533–0.748）；包容性臂特异AUC阿替利珠单抗单药0.541、联合贝伐珠单抗0.504，区间均跨0.5；PFS判别6个月优于12个月：全部174例ICI患者6个月IPCW AUC 0.653（95% CI 0.567–0.739）、12个月0.589（95% CI 0.500–0.679）；分别有14与19例患者在6与12个月时点前删失，未归类为观察病例或对照但贡献于删失分布估计。（8）ICI PFS关联随随访变化：中位分割生存曲线示高评分IMmotion150 ICI组PFS事件较早（log-rank p=0.217）；臂校正常数效应HR每SD 1.29（95% CI 1.05–1.58；p=0.0135），但评分特异PH检验显著（p=0.0022），时间交互经似然比检验支持（p=0.0017）；臂校正时间依赖模型中HR在3个月为1.47（95% CI 1.18–1.82）、6个月1.11（95% CI 0.89–1.40）、12个月0.85（95% CI 0.61–1.19）；Schoenfeld系数诊断显示随访中相应下降；CheckMate 009含16例纳武利尤单抗治疗患者与13个PFS事件，中位分割log-rank p=0.348，连续评分显示不良关联，未校正HR每SD 1.91（95% CI 1.04–3.51；p=0.036），年龄校正2.15（95% CI 1.07–4.29；p=0.031），宽区间反映小队列精度有限。（9）舒替尼队列显示不良PFS关联与反应定义敏感性：包容性反应AUC在82例IMmotion150舒替尼患者为0.569（95% CI 0.434–0.704）、43例E-MTAB-3267患者为0.693（95% CI 0.520–0.844），探索性极端组AUC分别为0.681与0.947；中位分割log-rank p在IMmotion150舒替尼为0.190、E-MTAB-3267为0.080；连续评分HR在IMmotion150舒替尼为1.45（89例、55事件；95% CI 1.10–1.91；p=0.0079）、E-MTAB-3267为1.49（53例、39事件；95% CI 1.10–2.01；p=0.0105）；E-MTAB-3267年龄与性别校正HR 1.54（95% CI 1.13–2.11；p=0.0070），评分特异PH p=0.233；逐一剔除E-MTAB-3267五个PD病例保留包容性与极端组AUC差异；极端组估计基于5例PD与19例PR，精度仍有限；反应类别图将10个模糊临床获益注释保留为单独组，未归入CR、PR、SD或PD。（10）PH兼容合并保留不良PFS关联：排除时间变化的IMmotion150 ICI估计后剩三个独立研究组，158例患者与107个PFS事件；未校正逆方差合并HR每SD 1.51（95% CI 1.24–1.83；p=3.16×10??）；这些组评分特异PH检验p值均高于0.05；估计研究间方差为零，固定效应与DerSimonian–Laird汇总相同；遗留四组混合校正估计1.40（95% CI 1.22–1.61），统一未校正四组估计1.39（95% CI 1.21–1.60）；PH兼容集内逐一剔除一个来源研究产生合并HR 1.47–1.56，三个区间均高于1；研究内独立重抽样患者得合并HR中位1.53、95%百分位区间1.22–1.95（1000次重复），较宽重抽样区间保留不良方向同时反映可用患者样本不确定性。
讨论部分总结：在ccRCC肿瘤细胞中识别的增殖转录程序与含ICI治疗及舒替尼治疗期间的不良PFS相关；患者校正表达分析支持20基因程序，其批量肿瘤评分密切跟踪既定增殖指标；临床发现对PFS较客观反应更一致；这些观察将定义的单细胞群体与紧凑增殖活性度量相联系，并把其PFS关联置于既定细胞周期生物学内。既往单细胞研究将该发现置于更广的ccRCC生物学视野：Bi等描述血管生成与免疫抑制程序不同的癌细胞群体并将其特征与生存相联系；Krishna等强调空间异质免疫群体包括组织驻留T细胞与肿瘤相关巨噬细胞与治疗反应相关；HCRN源研究将三级淋巴结构与较低丰度耗竭组织驻留T细胞与PD-1阻断反应相联系；本分析聚焦不同区室——循环候选肿瘤细胞，补充源研究所述免疫背景。向G2M检查点、E2F靶与有丝分裂纺锤体活性的汇聚赋予特征清晰生物学解释；协调的细胞周期转录可产生含不同基因但测量大致相同过程的预后特征；此处与G2M及E2F的相关在移除共享基因后仍强，删除单个特征基因对患者排序影响小，支持共同增殖程序而非独立耐药通路；未优于G2M在此背景下具信息性：20基因集价值主要在于将该程序追溯至单细胞群体，而非建立更好临床预测器。增殖相关风险亦在手术治疗肾癌中研究：Askeland等发现31基因细胞周期进展评分与明显局限期ccRCC切除后晚期转移进展相关；Rini等开发并独立验证16基因检测用于I–III期疾病肾切除后复发，提供超越临床与病理因素的预后信息；那些研究针对术后复发或转移，而本分析涉及晚期疾病全身治疗后的PFS；基因、计算、患者人群与终点差异妨碍预测性能直接比较，但生物学联系相关：增殖相关表达可伴随手术与全身治疗情境下的不良疾病进程。治疗背景对解释该关联重要：IMmotion150将不同免疫与血管生成程序与各治疗臂结局相联系，Beuselinck分类将不同肿瘤亚型与舒替尼反应相联系；IMmotion151中阿替利珠单抗联合贝伐珠单抗在高T效应和/或细胞周期转录亚群中显示优于舒替尼的获益；该相对治疗比较不等同于此处检验的治疗内关联；ICI与舒替尼治疗组均见不良PFS关联更符合一般增殖相关风险信号而非选择某一治疗的标志物；证明差异治疗获益需在适当设计的比较数据集中检验治疗×评分交互。进展时机增添另一维度：IMmotion150中评分PFS关联早期最强并随随访减弱，6与12个月判别估计显示相似模式；比例风险不成立时单一常数HR可掩盖此类变化；因此通过时间变化估计解释该队列并将其常数效应估计排除于主要合并分析；早期进展可能反映高增殖肿瘤更大生长负荷，但仍在风险患者构成变化亦可能贡献，现有治疗前图谱无法区分两种解释；连续评分与中位分割分析回答不同问题：在中位数分割连续测量损失信息，但不消除非显著log-rank比较所示不确定性。患者水平重复对单细胞组分尤重要：将数千细胞视为独立生物学重复可产生误导性差异表达证据；患者区组伪批量模型与留一患者分析显示所选表达程序不限于单个患者细胞，其方向在RNA-CNV支持子集中持续；这些检查加强发现数据内程序表征，但非基因选择独立重复；相反，簇丰度差异未通过多重检验校正、RNA推断CNV支持不完整、主要伪批量比较仅含进展样本；以非配对为主采样因此描述患者间差异而非证明个体肿瘤内治疗诱导扩增。基于秩的计算允许同一固定基因集应用于现有RNA测序与微阵列图谱而无需拟合结局依赖权重；单样本秩评分已发展以减少对背景样本数量与组成依赖；遵循此一般原则，自定义计算取20基因平均百分位秩；强基因剔除相关表明患者相对排序冗余，而观察绝对评分差异仍与测量可重复性相关；任何未来检测需解决基因覆盖、预处理与平台特异评分分布；建立共同临床截断值随后需分析验证与超出此处队列中位数的外部校准。反应与PFS应保持不同临床结局：RECIST区分客观肿瘤缩小与SD及PD；缺乏客观反应本身不确立治疗耐药；纳入稳定疾病显著降低反应判别，尤其在E-MTAB-3267极端组分析仅含5例PD；该对比提示评分捕获二元缩小终点未完全代表的疾病进程方面；小验证样本与不完整IMDC或MSKCC风险信息限制该解释外推；在当代临床注释队列中评估应优先于标准风险评估的增量价值，而配对肿瘤采样可确定增殖群体是否在治疗中变化。
研究结论翻译：一个固定20基因特征在ccRCC单细胞数据中定位了一个增殖程序，并与ICI及舒替尼治疗队列中的PFS相关。与既定增殖评分的强一致性及弱的包容性ICI反应判别支持将其解释为与不良结局相关的紧凑增殖读数。
