《Protein Science》：The Scm FCS finger binds the Pcl Tudor domain to link canonical PRC1 and PRC2.1 in Drosophila
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经典多梳抑制复合物1（PRC1）此前在基于交联的亲和纯化实验中被报道可选择性地与多梳抑制复合物2.1（PRC2.1）结合，但该相互作用的分子基础尚未阐明。本研究建立了一种基于冷冻研磨果蝇胚胎的亲和纯化策略，可在无需化学交联的条件下回收完整的经典PRC1及完整的
经典多梳抑制复合物1（PRC1）此前在基于交联的亲和纯化实验中被报道可选择性地与多梳抑制复合物2.1（PRC2.1）结合，但该相互作用的分子基础尚未阐明。本研究建立了一种基于冷冻研磨果蝇胚胎的亲和纯化策略，可在无需化学交联的条件下回收完整的经典PRC1及完整的PRC2.1复合物。研究人员利用AlphaFold3系统建模经典PRC1与PRC2.1各亚基间的相互作用，鉴定出经典PRC1辅助亚基Sex comb on midleg（Scm）的FCS指与PRC2.1辅助亚基Polycomblike（Pcl）的非典型Tudor结构域之间存在唯一的高置信度界面。重组Scm FCS指与Pcl Tudor结构域在体外形成稳定复合物，经尺寸排阻色谱和天然质谱证实。结构指导的突变验证了预测界面：任一相互作用伴侣的点突变均可消除复合物形成，而互补电荷逆转突变则可恢复结合。这些发现确定Scm–Pcl相互作用为果蝇中经典PRC1与PRC2.1选择性结合的分子基础，并揭示这两个复合物之间的通讯由这些辅助亚基之间的直接相互作用所介导。
研究背景方面，在果蝇中，多梳组（PcG）蛋白复合物组装于多梳响应元件（PREs）上，建立并维持相关靶基因的转录抑制。PREs在胚胎和幼虫中数百个靶基因处被序列特异性DNA结合Pho阻遏复合物（PhoRC）、经典PRC1、PRC2.1及多梳抑制去泛素化酶复合物（PR-DUB）共同占据。尽管已提出若干序列特异性DNA结合蛋白参与将多梳复合物招募至PREs，但分子机制对Pho（PhoRC的序列特异性DNA结合亚基，为哺乳动物YY1在果蝇中的直系同源物）了解最为清楚。在PhoRC中，Pho将染色质蛋白Sfmbt招募至PRE DNA。遗传学、生物化学和结构研究已确定Sfmbt结合经典PRC1辅助亚基Scm，后者又通过有序SAM结构域相互作用与PRC1核心亚基Polyhomeotic（Ph）结合，为将经典PRC1锚定至结合PRE的PhoRC提供了分子基础。与此模型一致，PRE报告基因中Pho结合位点的突变可消除PhoRC结合及经典PRC1占据。重要的是，相同Pho结合位点的突变也显著降低PRC2占据及H3K27me3结构域形成。同样，在pho突变动物中，多梳靶基因处的H3K27me3沉积受损。总之，这些发现表明PhoRC协调经典PRC1和PRC2.1在PREs处的招募或稳定结合。然而，这些研究虽确立了PhoRC招募经典PRC1的分子基础，却未能解释PRC2.1如何与结合PRE的PhoRC或经典PRC1发生物理连接。随后基于交联的亲和纯化实验鉴定出果蝇胚胎中经典PRC1与PRC2.1之间的选择性结合，并提示Scm为连接两个复合物的因子。独立遗传学证据也支持Scm与PRC2之间的功能联系：在果蝇雌性生殖系 nurse cell 分化过程中，Scm为多梳靶基因处高效的PRC2依赖性H3K27me3结构域形成所必需。总之，这些发现提示Scm参与经典PRC1与PRC2.1之间的物理结合，但该相互作用的分子基础仍未阐明。因此，研究人员开展本研究，旨在建立可在天然条件下分离完整经典PRC1与完整PRC2.1复合物的亲和纯化策略，并鉴定介导二者选择性结合的分子基础。
研究人员建立了基于冷冻研磨果蝇胚胎继而低盐提取和亲和纯化的策略。由于染色质在提取前被机械破碎，该流程设计用于回收不仅可溶性多梳复合物，还包括与破碎染色质相关的复合物，从而提高保留高级多梳组装体的可能性。研究人员利用表达Protein A标签Ph的转基因品系，在天然条件下从冷冻研磨果蝇胚胎中亲和纯化相关蛋白。除完整的经典PRC1及其辅助亚基Scm外，纯化还回收了PhoRC亚基Sfmbt、PRC2.1亚基Pcl、E(z)、Su(z)12和Esc以及O-GlcNAc转移酶Sxc/Ogt。天然条件下PRC2.1与经典PRC1的共分离，结合此前交联亲和纯化实验中提出的Scm连接两个复合物的作用，促使研究人员探究该相互作用的分子基础。研究人员利用AlphaFold3系统建模经典PRC1与PRC2.1亚基间相互作用。在所有组合中，AlphaFold3仅鉴定出PRC1辅助亚基Scm的FCS指与PRC2.1辅助亚基Pcl的Tudor结构域之间存在单一高置信度相互作用，而未预测到Scm与PRC2核心亚基之间或Pcl与PRC1核心亚基之间的相互作用。AlphaFold3模型预测Scm FCS指结构域（ScmFCS，Scm[Gly55-Ser135]）与Pcl Tudor结构域（PclTudor，Pcl[Pro347-Leu399]）形成广泛界面，涉及疏水和静电相互作用。界面以Scm Tyr75、Leu77、Pro78和Ile92与Pcl Phe358、Phe366、Leu368和Leu399形成的疏水核心为中心，两侧为Scm Arg96与Pcl Asp356和Asp384之间以及Scm Glu89与Pcl Arg397之间的静电相互作用。为确定ScmFCS与PclTudor是否直接相互作用，研究人员分别表达并纯化了两个结构域。将纯化的ScmFCS（Scm55-135）与PclTudor（Pcl339-404）混合后形成稳定复合物，在尺寸排阻色谱中洗脱为单一峰，其表观分子量高于任一单独结构域。洗脱组分的SDS-PAGE分析显示两蛋白以约1:1比例共洗脱。在线缓冲液交换天然质谱（OBE-native MS）证实形成1:1化学计量的ScmFCS–PclTudor复合物，未检测到更高阶寡聚体。为实验检验AlphaFold3模型，研究人员针对静电界面在Scm和Pcl中引入互补电荷逆转突变。Scm Arg96替换为天冬氨酸（ScmFCS-R96D）可消除与野生型PclTudor的复合物形成，经尺寸排阻色谱结合SDS-PAGE及OBE-native MS分析证实。同样，Pcl Asp384替换为精氨酸（PclTudor-D384R）在两种实验中均阻止与野生型ScmFCS的复合物形成。因此，任一相互作用伴侣的电荷逆转均破坏ScmFCS–PclTudor复合物形成，与AlphaFold3预测界面一致。为确定预测的静电相互作用是否可重建，研究人员将ScmFCS-R96D与PclTudor-D384R混合。互补电荷逆转突变恢复了复合物形成，产生稳定的ScmFCS-R96D–PclTudor-D384R复合物，在尺寸排阻色谱中共洗脱，并经OBE-native MS确认为1:1复合物。互补电荷逆转突变挽救复合物形成为AlphaFold3模型提供了强有力的实验验证，并证明预测的Scm Arg96–Pcl Asp384静电相互作用是Scm–Pcl界面的关键决定因素。总之，这些发现为先前观察到的经典PRC1与PRC2.1之间的选择性结合提供了分子基础，并确定直接的Scm–Pcl结合为两个复合物之间的物理连接。
研究方法方面，研究人员主要采用以下关键技术方法：冷冻研磨果蝇胚胎结合低盐提取的天然亲和纯化策略（使用NTAP标签Ph转基因果蝇胚胎，2–16小时龄，并以Oregon-R野生型胚胎为对照）；液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）及差异蛋白丰度分析（DIA-PASEF模式，Spectronaut和proDA分析）；AlphaFold3系统建模蛋白–蛋白相互作用；重组蛋白表达与纯化（大肠杆菌表达ScmFCS、ScmFCS-R96D、PclTudor、PclTudor-D384R）；分析型尺寸排阻色谱（SEC）；在线缓冲液交换天然质谱（OBE-native MS，Orbitrap Exploris 480，UniDec去卷积分析）。
研究结果方面，2.1 冷冻研磨胚胎中多梳复合物的亲和纯化在天然条件下保留高级多梳组装体：研究人员开发了基于冷冻研磨果蝇胚胎继而低盐提取和亲和纯化的策略，通过质谱分析比较NTAP-Ph亲和纯化与野生型Oregon-R胚胎 mock 对照纯化，鉴定出经典PRC1完整复合物及其辅助亚基Scm、PhoRC亚基Sfmbt、PRC2.1亚基Pcl、E(z)、Su(z)12和Esc以及O-GlcNAc转移酶Sxc/Ogt，表明该天然纯化策略可回收高级多梳组装体。2.2 AlphaFold3鉴定Scm FCS指–Pcl Tudor界面为经典PRC1与PRC2.1之间唯一高置信度预测相互作用：通过AlphaFold3系统建模经典PRC1与PRC2.1各亚基间所有组合，仅鉴定出Scm FCS指与Pcl Tudor结构域之间的单一高置信度相互作用，未预测到Scm与PRC2核心亚基或Pcl与PRC1核心亚基间相互作用；模型预测ScmFCS（Scm[Gly55-Ser135]）与PclTudor（Pcl[Pro347-Leu399]）形成广泛界面，涉及疏水核心和两侧静电相互作用。2.3 ScmFCS–PclTudor相互作用的体外重建与生化验证：通过分别纯化两结构域并进行混合，尺寸排阻色谱显示形成稳定复合物并共洗脱（约1:1），OBE-native MS证实1:1化学计量且无更高阶寡聚体；ScmFCS-R96D或PclTudor-D384R单突变均消除复合物形成；ScmFCS-R96D与PclTudor-D384R互补电荷逆转突变恢复复合物形成并经两种方法证实为1:1复合物，为AlphaFold3模型提供强有力实验验证，并确定Scm Arg96–Pcl Asp384静电相互作用为Scm–Pcl界面关键决定因素，从而为经典PRC1与PRC2.1选择性结合提供分子基础并确定直接Scm–Pcl结合为两复合物间物理连接。
讨论部分总结：本研究提供两方面进展。第一，研究人员开发了基于冷冻研磨和低盐提取的天然亲和纯化策略，可从果蝇胚胎中回收高级多梳组装体。第二，研究人员鉴定并生化验证了Scm FCS指与Pcl Tudor结构域之间的直接相互作用，作为果蝇中经典PRC1与PRC2.1选择性结合的分子基础。这些发现为此前在基于交联的亲和纯化研究中观察到的经典PRC1与PRC2.1选择性结合提供了分子解释。在技术方面，天然纯化策略不仅回收了经典PRC1及共结合的PhoRC和PRC2.1，还共分离了O-GlcNAc转移酶Sxc/Ogt；Sxc/Ogt对Ph的O-GlcNAc修饰为阻止Ph聚集所必需，尽管研究人员未进一步研究Sxc/Ogt与Ph的相互作用，但Ph纯化中回收该修饰酶提示天然纯化策略可能保留常规生化纯化中通常被破坏的瞬时酶–底物相互作用。在生物学意义方面，经典PRC1与PRC2.1之间的物理结合由辅助亚基Scm和Pcl而非两个复合物的保守核心亚基介导；结合先前结构研究，本研究确立Scm为连接PRE相关多梳复合物组装体中经典PRC1与PRC2.1的中心相互作用枢纽：Scm通过SAM–SAM相互作用与PhoRC亚基Sfmbt锚定于结合PRE的PhoRC，同时Scm SAM结构域的EH表面与Polyhomeotic的SAM结构域结合，从而将经典PRC1连接至结合PRE的PhoRC；本研究鉴定Scm N端FCS指为第二个相互作用界面，结合Pcl的Tudor结构域，从而提供经典PRC1与PRC2.1之间的物理连接。这些相互作用为PREs处不同多梳蛋白复合物的组装提供了分子框架，并为将PRC2.1招募至这些顺式调控元件提供了机制。值得注意的是，Scm和Pcl在进化过程中均已显著分化；哺乳动物SCMH1和SCML2保留保守的MBT和SAM结构域但缺乏N端FCS指，而哺乳动物PCL蛋白含通过芳香笼识别H3K36me3的经典Tudor结构域，果蝇Pcl的Tudor结构域则为非典型且缺乏甲基赖氨酸结合活性；因此本研究描述的Scm–Pcl相互作用在哺乳动物中不太可能进化保守，经典PRC1与PRC2.1之间的物理偶联似乎在进化过程中显著分化，若在脊椎动物中存在，可能由不同分子机制介导。在一项本手稿完成后发表的独立研究中，Lyons等（2026）也鉴定了Scm FCS指与Pcl Tudor结构域之间的直接相互作用，并研究了其在PRC2.1招募至多梳体和体内多梳抑制中的作用；本研究提供的生化重建和天然质谱分析确立了Scm FCS指–Pcl Tudor结构域复合物的1:1化学计量，且单个电荷逆转突变破坏复合物形成及互补电荷逆转突变恢复复合物形成，为预测的Scm–Pcl界面提供了直接实验验证；因此两项研究为Scm–Pcl相互作用提供了互补的生化和功能证据。
研究结论部分翻译：这些发现确定Scm–Pcl相互作用为果蝇中经典PRC1与PRC2.1选择性结合的分子基础，并揭示这些复合物之间的通讯由这些辅助亚基之间的直接相互作用所介导。
