基于Sso7d支架的KRASG12D蛋白结合子设计与外源性蛋白质降解策略

《Protein Science》：A designer protein binder of KRAS enables exogenous protein degradation

　　

靶向蛋白质降解已成为调控细胞内蛋白质的一种强大策略，尤其适用于那些缺乏传统小分子结合口袋的蛋白质。虽然基于蛋白质的降解剂将这一方法扩展至不可成药靶点，但它们通常需要在靶细胞中进行胞内表达，从而限制了其作为外源性研究工具的实用性。在本研究中，研究人员对源自Sso7d的KRASG12D结合子R11.1.6进行了工程改造，使其成为一种可化学偶联、可外源性递送的降解剂支架。研究人员证明，一种C端精氨酸到半胱氨酸的变体可以良好的产量和纯度进行生产，并与von Hippel–Lindau（VHL）E3连接酶配体进行偶联，尽管其对KRASG12D的亲和力相较于亲本R11降低了约10倍。为了减少可用于潜在泛素化的赖氨酸数量，研究人员生成了两种赖氨酸减少的变体——一种是完全无赖氨酸的变体（R11ΔLys），另一种是仅保留参与KRAS结合的三个赖氨酸的“赖氨酸精简”变体（R11Lite），并证明了这两种变体均保持了对野生型KRAS和KRASG12D的纳摩尔级亲和力。通过将R11–VHL与α-芳基-α-重氮酰胺试剂进行酯化处理，使得该嵌合偶联物能够用于细胞处理，并在HPAF-II细胞中导致了依赖于VHL配体的pan-RAS水平降低，这一点通过与过量游离VHL配体的竞争实验得到了证实。研究人员的实验结果确立了R11变体作为一种易处理的蛋白质工程支架，可用于开发化学偶联的生物降解剂，并为基于Sso7d支架设计赖氨酸减少的结合子提供了设计原理。

一、研究背景与科学问题

靶向蛋白质降解（targeted protein degradation, TPD）通过利用泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system, UPS）控制细胞内蛋白质水平，已成为一种强有力的策略。异源双功能分子如蛋白水解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras, PROTACs）能以催化方式招募E3泛素连接酶至目标蛋白（protein of interest, POI），诱导多聚泛素化和蛋白酶体降解。然而，小分子PROTACs对于转录因子、支架蛋白及缺乏深小分子结合口袋的蛋白质等“不可成药”靶点仍面临挑战。基于蛋白质的降解剂（如bioPROTACs）通过融合POI结合蛋白与E3连接酶招募模块来弥补这一空白，但其主要通过细胞内表达递送，限制了作为外源性研究工具的可及性和转化潜力。KRAS蛋白，特别是其致癌变体，是典型的难成药靶点。尽管针对特定亚型（如G12C、G12D、G12S）已开发出共价小分子抑制剂，但对大多数KRAS变体的可逆抑制仍依赖基于蛋白质的结合子。其中，R11.1.6（R11）是一种从Sso7d支架进化而来的热稳定7 kDa结合子，以4 nM亲和力结合KRAS^G12D，并对KRAS^WT有10倍选择性。将R11改造为可外源性递送的嵌合降解剂需解决三个蛋白质工程问题：在不破坏KRAS结合界面的前提下引入位点特异性生物偶联手柄、实现所得蛋白质-小分子偶联物的细胞递送，以及缓解因结合子表面赖氨酸残基泛素化导致的自我降解。

二、主要关键技术方法

本研究采用的关键技术方法包括：1）定点诱变与克隆技术，用于构建R11的各种变体（如C端半胱氨酸变体R11-Cys、完全无赖氨酸变体R11^ΔLys及赖氨酸精简变体R11^Lite）；2）重组蛋白表达与纯化，利用大肠杆菌（Escherichia coli）Rosetta 2 (DE3)菌株表达N端六组氨酸（6×His）-SUMO融合蛋白，并通过金属亲和层析和SUMO蛋白酶切割进行纯化；3）生物层干涉测量法（bio-layer interferometry, BLI），用于测定R11变体及其VHL偶联物与KRAS^WT和KRAS^G12D的结合亲和力；4）硫醇-马来酰亚胺化学偶联，用于将R11-Cys变体与BODIPY FL马来酰亚胺或马来酰亚胺-PEG₄-VHL试剂（化合物4）进行位点特异性偶联；5）蛋白质酯化，使用α-芳基-α-重氮酰胺试剂（化合物1）对R11偶联物进行修饰以实现细胞递送；6）活细胞共聚焦显微镜，用于观察BODIPY标记蛋白在CHO-K1和SW48^G12D细胞中的摄取情况；7）免疫印迹（immunoblotting），用于检测经酯化R11-VHL处理后HPAF-II、AsPC-1和SW48^G12D细胞中KRAS^G12D和pan-RAS的水平变化。

三、研究结果

2.1 用于化学偶联的R11变体的设计与表达

研究人员最初设计了N端半胱氨酸变体（Cys-R11），但重组表达产量低（0.5 mg L^-1）且纯度不高（80%）。随后测试了C端半胱氨酸变体（R11-Cys），其产量提高了7倍（3.5 mg L^-1），纯度超过95%。BLI测量显示，R11-Cys-VHL偶联物对KRAS^G12D的亲和力比亲本R11弱约10倍，但鉴于表达产量的显著提升，研究人员采用R11-Cys作为后续工作的主要支架。

2.2 抗泛素化R11变体的工程改造

R11含有10个赖氨酸残基，其中3个（Lys32、Lys40和Lys59）在与KRAS^G12D的共晶结构中形成直接接触。研究人员设计了两种变体：R11^ΔLys将所有10个赖氨酸替换为精氨酸，R11^Lite则仅保留与KRAS接触的三个赖氨酸。两种变体在大肠杆菌中的表达产量与天然R11相当（分别为3.5和1.5 mg L^-1）。BLI分析表明，两者均保留了对KRAS^WT和KRAS^G12D的纳摩尔级结合亲和力。这表明Sso7d衍生的KRAS结合界面能够耐受广泛的K→R取代。然而，R11^ΔLys-Cys偶联物在马来酰亚胺反应中发生沉淀，而R11^Lite-Cys则可行，因此研究人员推进了R11-Cys和R11^Lite-Cys用于下游化学功能化。

2.3 R11变体的生物偶联与细胞递送

通过标准硫醇-马来酰亚胺化学实现了R11-Cys和R11^Lite-Cys与BODIPY-马来酰亚胺的偶联，并经ESI Q-TOF质谱表征。通过α-芳基-α-重氮酰胺试剂1对蛋白质偶联物进行酯化处理，得到每分子蛋白质携带中位数1-5个烷基酯标签的偶联物。活细胞共聚焦显微镜显示，酯化R11-BODIPY处理CHO-K1细胞后出现了细胞内BODIPY荧光。值得注意的是，R11^Lite-BODIPY甚至在未经酯化的情况下也能在SW48^G12D细胞中积累，表明K→R取代赋予了该变体一定程度的固有细胞通透性。

2.4 酯化R11-VHL对pan-RAS的VHL依赖性降低

研究人员合成了马来酰亚胺-PEG₄-VHL配体试剂（4）用于位点特异性半胱氨酸修饰。在HPAF-II细胞中，酯化R11-VHL（est-R11-VHL）以剂量依赖的方式诱导pan-RAS水平降低，在10.0 μM浓度下相对于无蛋白对照和未酯化R11-VHL对照达到约40%的损失。KRAS^G12D水平虽有下降趋势但未达统计学显著性。在另外两种表达KRAS^G12D的细胞系AsPC-1和SW48^G12D中未观察到pan-RAS或KRAS^G12D的降低。竞争实验表明，将est-R11-VHL与过量游离VHL配体共同处理HPAF-II细胞，消除了单独使用est-R11-VHL所观察到的pan-RAS降低，这支持了VHL配体依赖性的作用机制。

2.5 R11^Lite-VHL作为候选抗泛素化降解剂

研究人员将R11^Lite-Cys与马来酰亚胺-PEG₄-VHL试剂偶联，并直接用R11^Lite-VHL处理HPAF-II细胞。虽然在一个重复实验中观察到了pan-RAS降低，但在第二次重复中未能重现，因此未对该变体进行进一步的定量表征。

四、讨论与结论

本研究建立了将Sso7d衍生结合子改造为化学可偶联降解剂组分的若干实用设计原则。首先，半胱氨酸引入位点会实质性地影响表达产量和目标亲和力，设计者应预见到这种权衡。其次，Sso7d基KRAS结合界面高度耐受赖氨酸到精氨酸的广泛取代，这为获得抗泛素化变体提供了直接途径。第三，完全的K→R取代在偶联背景下会带来溶解度代价，而“赖氨酸精简”设计（R11^Lite）在避免此问题的同时大幅减少了可用泛素化位点。第四，精氨酸富集可能赋予固有的细胞通透性。

在功能方面，本研究为外源性递送的嵌合降解剂提供了概念验证。在HPAF-II细胞中，酯化R11-VHL产生了可重复、剂量依赖且VHL依赖的pan-RAS水平降低。该设计存在三个局限性：降解效果温和（10 μM时约40%），对KRAS^G12D无选择性；降解活性呈细胞系依赖性；偶联物本身可能易受自我泛素化或其他胞内损失机制的影响。

该嵌合降解剂策略介于小分子PROTACs和基于蛋白质的bioPROTACs之间，对于已有蛋白质结合子但缺乏小分子POI配体的不可成药靶点的快速原型开发尤为有用。未来方向包括探索替代偶联位点、优化连接子以及测试其他E3连接酶招募模块。更广泛地说，本研究结果表明，蛋白质工程，特别是使结合子支架适应化学偶联、胞内使用以及降低对赖氨酸依赖性自我修饰的敏感性，是基于蛋白质的降解剂开发中关键但尚未充分探索的组成部分。