《Signal Transduction and Targeted Therapy》：MUC1 attenuates chronic obstructive pulmonary disease through integrated regulation of pulmonary epithelial cell senescence, transdifferentiation, and inflammatory cascades
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肺泡上皮细胞稳态受损是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的关键致病特征。黏蛋白1（MUC1/Muc1）是一种膜锚定糖蛋白，在调控多种疾病进展中发挥重要作用。本研究旨在阐明MUC1在COPD发病机制中的作用及其机制。研究人员发现MUC1中的功能性变异（rs407203
肺泡上皮细胞稳态受损是慢性阻塞性肺疾病（COPD）的关键致病特征。黏蛋白1（MUC1/Muc1）是一种膜锚定糖蛋白，在调控多种疾病进展中发挥重要作用。本研究旨在阐明MUC1在COPD发病机制中的作用及其机制。研究人员发现MUC1中的功能性变异（rs4072037 T > C和rs12411216 C > A）与COPD易感性增加相关。肺组织中MUC1-C的表达呈年龄依赖性，在成人中升高但在老年COPD患者中降低。老年Muc1缺陷小鼠显示肺泡II型（AT2）上皮细胞衰老增加并自发形成肺气肿。在香烟烟雾（CS）诱导的COPD模型小鼠中，Muc1缺陷导致肺功能加速下降、线粒体功能受损、肺部炎症增强以及AT2向肺泡I型（AT1）上皮细胞转分化受损。腺相关病毒血清型9（AAV9）介导的AT2细胞特异性Muc1重建改善了COPD，与肺部炎症的综合抑制以及AT2转分化和线粒体功能的增强相关。在机制上，研究人员发现MUC1通过激活PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬流和AMPK/NDUFS4驱动的AT2细胞线粒体代谢重编程来减轻衰老及相关细胞功能障碍。此外，MUC1通过增强β-catenin核转位来调控CS提取物（CSE）诱导的人AT2向AT1转分化。而且，肺上皮细胞中MUC1的过表达在体外和体内均抑制CS诱导的NF-κB活化和炎症反应。总之，本研究确定MUC1是一种保护性分子和COPD（尤其是肺气肿）的潜在靶点，其通过促进AT2向AT1细胞转分化同时抑制衰老和炎症发挥作用。
**研究背景与意义**
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是全球第三大死因，据2019年全球疾病负担研究数据，COPD导致约328万人死亡，占全球死亡总数的近7%，吸烟是其首要危险因素。预计到2050年，COPD病例数将接近6亿。COPD以持续性气流受限和肺组织破坏为特征，慢性炎症在其进展中发挥核心作用。炎症细胞及其释放的产物加剧气道和肺泡上皮损伤，并阻碍肺组织修复。作为肺衰老性疾病，COPD的进展与线粒体自噬受损相关。生理条件下，受损线粒体通过线粒体自噬被清除；然而在COPD中，线粒体自噬受损导致功能障碍性线粒体积累，增加氧化应激并促进促炎因子释放，最终导致细胞衰老和肺泡破坏。此外，肺泡II型（alveolar type II, AT2）上皮细胞作为祖细胞可分化为I型（AT1）上皮细胞以修复受损肺泡结构。在COPD中，AT2向AT1细胞分化减少阻碍肺泡上皮修复。因此，肺上皮细胞衰老、转分化动力学改变和炎症级联反应共同促进COPD发展。
黏蛋白1（MUC1/Muc1）是一种高度糖基化的跨膜糖蛋白，由两个主要亚基组成：胞外N端亚基（MUC1-N）和跨膜C端亚基（MUC1-C）。MUC1-C含有多个磷酸化位点，可与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR）和β-catenin等信号分子相互作用，从而介导包括炎症调控和组织重塑在内的多种细胞功能。慢性炎症对COPD发展至关重要，炎症通过影响气道修复和重塑过程损伤气道。在气道中，MUC1已被证实在小鼠铜绿假单胞菌急性感染模型中发挥抗炎作用。此外，呼吸道合胞病毒感染和不可分型流感嗜血杆菌的体外实验也证实了MUC1在肺上皮细胞中的抗炎效应。值得注意的是，糖皮质激素抵抗型COPD患者中MUC1-C表达降低，提示MUC1-C在调控类固醇反应性和炎症中发挥作用。除抗炎作用外，MUC1还影响线粒体稳态。在肿瘤细胞中，MUC1-C转位至线粒体并与ATPase家族蛋白ATAD3A相互作用，促进ATAD3A降解，此过程保护PTEN诱导激酶1（PTEN-induced kinase 1, PINK1）免受切割并稳定PINK1介导的线粒体自噬通路。然而，MUC1在COPD相关细胞衰老中线粒体作用的直接证据尚不清楚。此外，Wnt/β-catenin信号通路在胚胎小鼠肺发育全程保持高度活跃，Wnt或β-catenin基因敲除的胚胎小鼠正常肺器官形成受损。在COPD中，该信号通路活性普遍降低。MUC1-C已被证实可与β-catenin相互作用并促进其进入细胞核，从而促进Wnt靶基因的激活。然而，MUC1-C在COPD进展中调控Wnt/β-catenin信号通路的具体作用尚待阐明。总之，尽管MUC1参与多种与炎症和细胞稳态相关的通路，但MUC1是否调控COPD的发生和进展仍不清楚。研究人员提出假说：在COPD中，MUC1通过抑制炎症级联反应、减少肺上皮细胞衰老以及促进肺泡上皮祖细胞（AT2细胞）转分化来抑制肺泡损伤并维持肺功能。为验证该假说，研究人员首先在独立汉族人群队列中分析MUC1常见单核苷酸多态性（single-nucleotide polymorphisms, SNPs）与COPD易感性的关联，随后利用暴露于香烟烟雾（cigarette smoke, CS）的基因工程小鼠模型和香烟烟雾提取物（CS extract, CSE）刺激的细胞模型研究MUC1在COPD/肺气肿发病中的功能作用。
**关键技术方法**
研究人员首先在南方汉族队列（756例COPD患者和768例健康对照）中进行基因分型，并在北方汉族独立队列（594例COPD患者和600例对照，来自内蒙古自治区人民医院）中进行验证。动物实验采用Muc1全身敲除（Muc1?/?）小鼠、AT2细胞特异性Muc1条件性敲除（Muc1AT2?/?）小鼠及其野生型同窝对照，通过全身暴露系统进行6个月CS暴露（每天2次、每次2小时、每周6天）建立COPD模型，并采用自然衰老小鼠（3、6、18月龄）模拟衰老轨迹。体外实验使用人AT2细胞（hAT2）、16HBE细胞和A549细胞，结合CSE刺激。主要技术包括：AAV9介导的AT2细胞特异性Muc1基因重建（AAV9-Muc1）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）并构建COPD肺细胞图谱（CLCA-AT2，包含131,015个AT2细胞）、免疫共沉淀（Co-IP）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、甲基化特异性PCR（MSP）、透射电子显微镜（TEM）、微型CT（micro-CT）及肺功能测定等。
**研究结果**
**MUC1功能性变异增加COPD易感性**：通过对南方汉族队列的SNP分析，研究人员发现MUC1基因rs4072037 T > C和rs12411216 C > A变异基因型在隐性模型中与COPD风险增加显著相关（rs4072037：P = 0.010，OR = 1.75，95% CI = 1.15–2.68；rs12411216：P = 0.027，OR = 1.62，95% CI = 1.06–2.47）。分层分析显示，rs4072037 CC基因型在老年人、男性、非吸烟者、无COPD家族史者中COPD风险显著升高。基因-环境交互分析发现MUC1变异与COPD家族史（P = 0.01）及吸烟状态（P = 0.013和0.034）存在显著交互作用。在按吸烟包年匹配的亚队列中，遗传效应独立于吸烟史。rs4072037多态性与COPD易感性的关联在北方汉族独立队列中得到重复验证。功能实验表明，rs4072037 C等位基因与MUC1蛋白表达降低相关；rs12411216 AA等位基因在基础和TNF-α/CSE刺激条件下MUC1启动子转录活性均显著低于CC等位基因。
**MUC1-C在COPD患者、CS暴露老龄小鼠和自然衰老小鼠肺组织中的表达模式**：年轻成人COPD患者（≤50岁）肺组织中MUC1-C表达较年龄匹配健康对照显著升高；而在老年人群（≥70岁）中，COPD患者MUC1-C表达显著降低。SFTPC? AT2细胞内MUC1-C荧光定量分析证实了上述年龄相关变化模式。动物实验进一步验证：CS暴露成年小鼠气道和肺泡上皮中Muc1表达显著升高，而CS暴露老龄小鼠中显著降低。共聚焦显微镜显示CS暴露老龄小鼠肺组织中Muc1-C核内和线粒体定位显著减少。Western blot证实自然衰老小鼠肺组织Muc1-C表达呈年龄依赖性下降。基于CLCA-AT2分析，MUC1主要在AT2细胞而非巨噬细胞中表达，COPD来源AT2细胞中MUC1表达较对照显著下调，且在GOLD 3–4期较GOLD 1–2期更为明显。老年COPD患者MUC1启动子甲基化水平显著高于年轻患者，提示年龄依赖性MUC1启动子高甲基化可能削弱CS诱导肺损伤时MUC1的代偿性上调。
**MUC1缺陷加剧COPD发展**：在6个月CS暴露模型中，Muc1?/?小鼠较Muc1+/+同窝对照表现出更严重的肺功能下降（FRC、TLC、RI、Cchord、FVC增加，FEV100/FVC降低），肺泡破坏加重。Muc1AT2?/?小鼠同样表现出肺功能受损（FEV20/FVC和FEV50/FVC降低）和肺泡间隙显著扩大。Muc1缺陷显著加剧CS诱导的气道重塑和上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）。CS暴露后Muc1?/?小鼠BALF中总白细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞计数显著增加，IL-1β和IL-6分泌增强。转录组测序显示Muc1?/?小鼠AT1标志物（Aqp5、Pdpn、Ager）表达显著降低。scRNA-seq伪时间轨迹分析揭示Muc1缺陷抑制AT2细胞身份转录程序并显著破坏向AT1谱系的正常分化轨迹，表现为Krt8?中间祖细胞异常积累和谱系标记AT2细胞成功分化为AT1细胞显著减少。在无CS暴露条件下，Muc1?/?小鼠从3至18月龄表现出更明显的年龄相关COPD表型恶化（IC增加、FEV100/FVC下降加速），18月龄Muc1?/?小鼠肺泡破坏加重，SFTPC? AT2细胞内p53共表达增加，Lamin B1表达降低。体外实验表明MUC1敲低降低细胞活力、减少Ki67核定位、上调p21和IL-6/IL-8表达、增加细胞内ROS、降低线粒体膜电位、增强SA-β-gal活性。
**AAV9介导的肺上皮细胞MUC1特异性重建改善COPD**：研究人员构建了AAV9-Sftpc-Muc1-EGFP载体，在CS暴露3个月后经气管内给药一次，继续暴露3个月。AAV9在AT2细胞中的转导效率平均约78%。Muc1过表达显著改善肺功能参数（FRC、FVC、IC、FEV50/FVC），在CS暴露老龄小鼠中效果尤为显著。H&E染色和MLI定量显示Muc1恢复后肺泡破坏减少。Micro-CT显示肺部结构改善，TEM观察到mAT2细胞线粒体形态异常得到纠正。Western blot和免疫荧光检测显示AT2标志物SFTPC与AT1标志物AQP5表达失衡得到纠正。在hAT2细胞中，MUC1过表达在CSE刺激下有效维持AQP5表达水平。在16HBE细胞中，MUC1过表达显著抑制CSE诱导的SA-β-gal活性增加、降低MitoSOX荧光强度并增强ATP产生。
**MUC1通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬和AMPK/NDUFS4驱动的线粒体代谢重编程减轻衰老相关肺泡上皮功能障碍**：CS暴露后Muc1AT2?/?小鼠肺泡上皮细胞线粒体自噬显著抑制，表现为LC3B与TOM20共定位减少，PINK1和TOM20表达降低。Co-IP分析显示CSE刺激后MUC1-C与线粒体蛋白ATAD3A的相互作用减弱。MUC1-C敲低导致A549细胞PINK1蛋白表达下调；MUC1-C过表达显著增加CSE刺激下hAT2细胞LC3B-II/LC3B-I比值。MUC1缺陷导致线粒体呼吸链复合物I亚基NDUFS4下调，MUC1过表达以AQC结构域依赖方式恢复其表达。MUC1-C能够结合磷酸化AMPK（p-AMPK），CSE刺激后其相互作用显著减少。MUC1缺陷损害线粒体和胞质中AMPK活性，伴随NAD?/NADH比值降低。MUC1上调糖酵解相关蛋白HK1和HK2表达。在MUC1缺陷hAT2细胞中过表达ATAD3A可显著挽救CSE处理下PINK1表达下调，过表达AMPKα可有效挽救HK1表达缺陷。CSE刺激1小时内MUC1-C即发生早期线粒体转位，ROS清除剂NAC可显著减弱此转位，提示氧化应激是MUC1-C早期线粒体转位的关键触发因素。
**MUC1通过增强β-catenin核转位介导的经典Wnt/β-catenin信号激活调控CSE诱导的hAT2转分化**：CS暴露小鼠AT2细胞和肺组织中β-catenin表达显著降低。气管内给予AAV9-Muc1显著增加CS暴露下SFTPC?Muc1?β-catenin?AT2细胞数量，β-catenin、Muc1与SFTPC共定位显著增强。Muc1AT2?/?小鼠肺组织中β-catenin表达显著降低。rs4072037 T>C多态性导致β-catenin蛋白水平显著降低。CSE刺激后，MUC1过表达组β-catenin表达显著高于阴性对照组，核内β-catenin表达进一步增加；shMUC1组核内β-catenin表达较shNC组进一步降低。Wnt/β-catenin通路抑制剂XAV-939处理或β-catenin shRNA转导后，即使MUC1过表达也无法恢复β-catenin及AT1标志物（PDPN和AQP5）表达水平。仅依靠Wnt3a激活β-catenin下游信号不足以改善CSE刺激导致的AT2向AT1转分化受损。
**β-catenin介导MUC1依赖性线粒体自噬和代谢重编程**：MUC1过表达后，XAV-939处理消除了MUC1介导的线粒体自噬流恢复。MUC1依赖性的HK2和LDHA调控主要通过β-catenin激活发挥作用，而对HK1和AMPK磷酸化的影响则通过β-catenin非依赖途径。
**MUC1通过抑制NF-κB依赖性信号抑制CS诱导的肺部炎症**：CSE处理后，siMUC1转染的16HBE细胞IL-6和IL-8分泌增加，核内NF-κB水平进一步升高。Muc1?/?小鼠肺组织中观察到类似结果。EMSA显示CS暴露显著诱导Muc1AT2+/+小鼠NF-κB DNA结合活性，Muc1AT2?/?小鼠在空气暴露下即表现出升高的基础NF-κB活化，CS暴露后进一步大幅增加。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究通过群体遗传学发现MUC1功能性变异与COPD易感性相关，rs4072037C等位基因可能通过降低MUC1蛋白水平赋予易感性，rs12411216 A在CSE和TNF-α刺激条件下显著降低MUC1转录活性。MUC1-C在COPD患者中的表达水平和亚细胞定位模式呈现显著年龄相关差异，年龄依赖性MUC1启动子高甲基化可能削弱CS诱导肺损伤时MUC1的代偿性上调，导致老年患者更严重的肺泡上皮修复缺陷。Muc1缺陷小鼠自发形成肺气肿，老龄Muc1缺陷小鼠AT2细胞出现细胞衰老。在COPD小鼠模型中，Muc1基因缺失加速肺功能下降、损害线粒体功能、增加炎症并破坏AT2向AT1转分化。AAV9介导的肺上皮细胞MUC1特异性重建改善COPD恶化。靶向其信号轴——PINK1/Parkin依赖性线粒体自噬和AMPK/NDUFS4驱动的线粒体代谢重编程、Wnt/β-catenin信号激活以及NF-κB依赖性信号——为干预疾病发生和进展提供了多方面机会。本研究首次报道MUC1-C直接与线粒体AMPK形成复合物调控葡萄糖代谢重编程。MUC1缺陷导致线粒体p-AMPK水平降低和NAD?/NADH比值下降，并引起电子传递链复合物I亚基NDUFS4下调。在CS诱导的小鼠COPD模型中，Muc1缺陷增加炎症因子分泌，与肺结构损伤和功能损害加重相关。本研究证明CS暴露增加Muc1+/+小鼠NF-κB活化，Muc1?/?小鼠中增加更为显著，表明Muc1抑制NF-κB活性。MUC1过表达在CSE处理培养中保持转分化能力，肺靶向Muc1过表达在CS暴露小鼠中增强AT2向AT1分化，恢复上皮完整性；AT2特异性Muc1敲低则减弱此修复过程。机制上，MUC1稳定β-catenin并增强其核转位，β-catenin信号药理学阻断消除了MUC1对线粒体自噬和关键代谢酶的恢复作用。同时鉴定出β-catenin非依赖性的AMPK和HK1调控，揭示了MUC1信号网络的额外复杂性。动物实验表明气道递送AAV9-Muc1有效转导AT2细胞、维持Muc1表达并赋予疾病保护，支持通过AAV9增强肺泡上皮MUC1表达可能成为COPD潜在基因治疗策略的假说。研究还承认了若干局限性，包括残余选择偏倚、未解析rs4072037是否通过改变MUC1剪接异构体比例发挥功能、线粒体自噬流未直接用溶酶体抑制剂测定、AAV9基因治疗的安全性问题尚未解决等。
研究结论部分翻译：总之，MUC1是COPD中肺泡上皮稳态和修复的核心调控因子。MUC1调控AT2向AT1细胞命运决定，这一过程对肺泡再生至关重要。机制上，MUC1协调一个整合信号网络，涵盖线粒体自噬、AMPK激活和代谢重编程，经典Wnt/β-catenin作为主要下游介质。此外，研究人员证明MUC1缺陷促进功能障碍性衰老肺泡上皮细胞的积累，这是COPD的关键特征。重要的是，本研究首次提供了新型治疗策略的体内概念验证，表明气道定向递送AAV9-Muc1可防止CS诱导的肺损伤。虽然这些发现阐明了MUC1的关键作用并提出了有前景的基因治疗候选者，但成功的临床转化需要未来严格的临床前研究来全面解决安全性、生物分布和长期疗效参数。总之，本研究结果确立MUC1不仅是COPD病理的关键分子决定因素，也是再生干预的可行靶点。
