《Talanta》：Optimization of a SWIEET-LC-MS/MS method for quantification of regulated pyrrolizidine alkaloids: Application to honey samples
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吡咯里西啶生物碱（PAs）及其氧化形式（PANOs）是植物合成的次级代谢产物，作为针对食草动物和病原体的化学防御物质。这些化合物构成结构多样的家族，包含650余种已知分子，主要存在于菊科、夹竹桃科、紫草科、豆科和兰科等特定植物科中。PAs和PANOs主要积累于
吡咯里西啶生物碱（PAs）及其氧化形式（PANOs）是植物合成的次级代谢产物，作为针对食草动物和病原体的化学防御物质。这些化合物构成结构多样的家族，包含650余种已知分子，主要存在于菊科、夹竹桃科、紫草科、豆科和兰科等特定植物科中。PAs和PANOs主要积累于植物的繁殖器官如种子和花中，在叶、茎和根中含量较低。其在植物组织内的浓度受物种、植物器官、采收时间和储存条件等因素影响。近期研究还考察了PAs在不同环境条件下的降解行为，强调了紫外辐射和碱性pH对其稳定性及转化产物形成的影响。PAs和PANOs已被认定对人类和动物具有肝毒性、遗传毒性和致癌潜力。急性暴露于高浓度可导致严重肝损伤，包括肝窦阻塞综合征，而通过污染食品长期摄入低水平则可能导致肝纤维化、肺动脉高压、遗传改变和肝细胞癌等长期效应。蜂蜜是全球消费最广泛的食品之一。尽管因其营养特性和抗氧化含量而受重视，但其可能受到农药残留、真菌毒素尤其是PAs等植物毒素的污染。蜂蜜中PAs和PANOs的存在源于某些植物花蜜和花粉中的含量，这些物质被觅食蜜蜂采集并运送至蜂巢，可能导致最终产品的污染。近年来，快速预警系统食品和饲料门户网站上关于不同食品中PAs和PANOs高水平的食品预警数量显著增加（从2019年的2次预警增至2025年的57次），部分原因在于其被纳入欧盟委员会法规(EU) 2023/915，该法规建议对各种基质中35种PAs和PANOs进行监测，并对所有单个化合物之和设定了最高限量。然而，PA和PANO的监测仍极具挑战性。当前大多数分析方法无法涵盖全部35种受管制化合物，主要由于分析标准品成本高昂，更关键的是实现其色谱分离的困难。许多PA和PANO为异构体，在液相色谱（LC）分析中发生共洗脱，无法通过质谱（MS）检测加以区分。这一局限性反映在欧盟委员会法规(EU) 2023/915中，该法规出于定量目的考虑了分析物在不同组别中可能的共洗脱情况。在此背景下，文献报道的大多数分析方法采用反相液相色谱（RPLC）与串联质谱（MS/MS）联用，使用C8或C18色谱柱。此外，亲水相互作用液相色谱（HILIC）可分离某些异构体对，而大多数反相LC方法无法实现此分离。这些异构体对也可使用二维液相色谱（2D-LC）-MS进行分离，其中两个色谱维度相结合以实现异构体分离。然而，Wawroszová等近期使用C18色谱柱成功分离了全部35种受管制分析物，代表了一项重大突破，避免了HILIC相对于C18色谱柱较长的平衡时间和较低的重现性。此外，液相色谱与离子淌度-质谱（IM-MS）联用也被提出用于基于碰撞截面积（CCS）值判断异构体分析物是否可分离。然而，共洗脱异构体PAs的CCS值差异不显著，表明该方法也不足以分离这些化合物。在样品制备方面，PAs和PANOs为高极性有机化合物，需要极性有机溶剂进行高效提取。对于蜂蜜中这些化合物的测定，样品处理最常涉及溶剂提取，随后经常采用固相萃取（SPE）或盐析辅助液液萃取（SALLE）进行净化和预浓缩，或基于QuEChERS的方法。SPE通常使用强阳离子交换（SCX）、混合模式阳离子交换（MCX）或反相SPE柱。然而，该方法因需要购买一次性萃取柱而导致样品制备经济成本较高。另一方面，基于QuEChERS的提取和SALLE均为通用样品处理方法，适用于广泛的分析物，包括极性和非极性化合物。这些方法利用盐析效应实现相分离并分离提取物。Kalinke等近期开发了所谓糖-水-异丙醇-乙腈提取技术（SWIEET）用于极性化合物的提取。该方法依赖于初始均相水-有机溶剂体系中葡萄糖诱导的相分离，使目标分析物分配至有机相。尽管在概念上类似于盐析辅助液液萃取（SALLE），SWIEET用葡萄糖——一种廉价且易得的添加剂——替代了传统上用于促进相分离的无机盐。该方法已在多种基质中评估了其有效性，包括废水、河水、番茄、土壤和燕麦样品。然而，其应用仍然稀少，且主要局限于其原始开发者的环境监测工作。据研究人员所知，此前尚无研究考察SWIEET对蜂蜜分析的适用性，也未考察其从如此复杂的富糖基质中提取整个化合物家族的适用性。在此背景下，本工作构成SWIEET首次应用于蜂蜜中PA和PANO的测定，突出了其作为食品安全评估替代样品处理策略的新颖性。此外，分析化学的当前趋势日益鼓励开发符合白分析化学（WAC）原则的方法，该原则通过整合环境影响、分析性能和实际适用性来评估分析方法。采用基于WAC的评估可促进开发不仅降低实验室程序环境影响，而且保持足够分析性能、适用性和操作简便性的方法。基于这些方法学空白，本工作的目标是开发、优化和验证首个SWIEET-LC-MS/MS方法，用于单独测定当前欧洲法规中包含的35种PAs和PANOs，并将其应用于蜂蜜样品。为确保所有目标分析物的最大提取效率，使用Draper-Lin小型复合设计与多响应渴望函数相结合对影响SWIEET的主要参数进行蜂蜜样品优化。此外，本研究涉及色谱性能的广泛评估，以提高主要异构体PAs和PANOs的分离分辨率，从而实现其准确定量测定。为实现此目标，对具有不同固定相选择性（即C18、C8、PBr和联苯化学）的广泛LC色谱柱进行了严格评估。此外，按照WAC原则标准对优化和验证的方法进行了全面评估，以评价其可持续性、分析性能、实际适用性和创新等级。最后，通过分析34个不同植物来源和生产类型的蜂蜜样品，证明了该方法的实际适用性。最终，所提出的方法为蜂蜜中PA和PANO的监测提供了合适的分析工具，有助于为未来的膳食暴露评估研究生成存在性数据。
研究背景方面，吡咯里西啶生物碱（PAs）及其N-氧化物（PANOs）是植物次级代谢产物，已知650余种，主要存在于菊科、紫草科等植物中，具有肝毒性、遗传毒性和致癌性。蜂蜜作为全球广泛消费的食品，可能因蜜蜂采集含PAs植物的花蜜和花粉而受到污染。近年来欧盟食品和饲料快速预警系统（RASFF）中关于PAs的预警数量显著增加，欧盟委员会法规(EU) 2023/915将35种PAs和PANOs纳入监测范围，但未对蜂蜜设定特定最高限量。目前存在的主要问题包括：多数分析方法无法涵盖全部35种受管制化合物，主要由于标准品成本高和异构体色谱分离困难；许多PAs和PANOs为异构体，在液相色谱中易共洗脱且质谱无法区分；样品制备方面，固相萃取（SPE）成本较高，而QuEChERS和盐析辅助液液萃取（SALLE）为通用方法但非专属。Kalinke等近期开发的糖-水-异丙醇-乙腈提取技术（SWIEET）基于葡萄糖诱导相分离，已用于环境样品但尚未应用于蜂蜜。基于此，本研究旨在开发、优化和验证首个SWIEET-LC-MS/MS方法用于蜂蜜中35种PAs和PANOs的单独测定，并进行色谱柱筛选优化分离，同时按照白分析化学（WAC）原则进行全面评估。研究意义在于为蜂蜜中PAs和PANOs的监测提供合适分析工具，支持未来膳食暴露评估和监管决策。
关键技术方法方面，研究人员采用SWIEET进行样品提取，以葡萄糖诱导相分离替代传统盐析；采用Draper-Lin小型复合设计（D-LSCD）结合多响应渴望函数优化提取条件；系统评估了C18（包括Luna Omega Polar、ACQUITY UPLC CSH C18等）、C8、五溴苄基（PBr）和联苯等多种固定相色谱柱的分离性能；采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）在多反应监测（MRM）模式下进行定量分析；按照欧盟法规(EU) 2023/2783和EURL-MP指南进行方法验证；并应用AGREE、BAGI、RAPI和VIGI四种WAC指标工具进行综合评估。蜂蜜样品队列为从西班牙格拉纳达市场及周边地区采集的34个蜂蜜样品，包括8个有机认证蜂蜜和5个来自乡村手工养蜂者的蜂蜜。
研究结果方面，在ESI-MS参数优化中，研究人员通过单独灌注各目标化合物优化了前体离子、产物离子及碰撞能量（CE）、去簇电压（DP）等关键参数，选择了各化合物定量和定性离子对的最佳信号强度。在色谱分离优化中，首先评估了6种C18色谱柱，初步筛选条件下多数分析物分离度低于0.5，Zorbax Eclipse Plus和Kinetex XB-C18因分离度超过1.2的峰对最少而被排除；第二轮筛选增加水相比例后，Luna Omega Polar和ACQUITY HSS T3表现较优；进一步以100%水相起始梯度优化，进样体积评估显示1 μL提供最佳分离度和峰形，柱温评估显示25 °C为最佳折中；Luna Omega Polar柱在C18柱中表现最佳，47%的分离度值超过1.5，但仅能分离31种分析物，两对异构体共洗脱；柱温程序化可改善retrorsine/usaramine对的分离但未实现全部35种分离；最终ACQUITY UPLC CSH C18柱通过适配的17步梯度程序成功分离全部35种目标分析物，为唯一能完全分离的C18柱，但操作窗口较窄，对色谱环境微小变化敏感。在替代固定相评估中，ACQUITY BEH C8柱优化后分离31种分析物，lycopsamine/indicine和intermedine N-oxide/indicine N-oxide共洗脱；Cosmocore PBr柱分离31种，intermedine N-oxide/indicine N-oxide和senecivernine/senecionine共洗脱；Raptor Biphenyl柱以甲醇为有机相分离31种，spartioidine/seneciphylline及其N-氧化物共洗脱；替代固定相均未超过CSH C18的分离性能。在样品处理优化中，SWIEET与SALLE比较显示SWIEET提取回收率更高（多数超过60%），两者基质效应均较低（一般低于±20%），SWIEET因回收率显著改善而被选用；Draper-Lin小型复合设计优化4个变量（IPA含量、葡萄糖浓度、提取体积、再提取体积），渴望函数指数93.3%预测最优条件为22% IPA、2.5 M葡萄糖、4 mL提取体积、4.12 mL再提取体积，预测值与实验值吻合良好；葡萄糖溶液pH评估显示pH 12时回收率低于70%且基质效应显著，pH 2和5.8时回收率超过70%且基质效应在±20%内，选择pH 5.8以避免额外酸化步骤；提取物复溶体积评估显示1.0 mL在保持灵敏度和基质效应可接受方面最佳。在方法验证中，所有鉴定标准均满足，保留时间偏差在±0.1 min内，离子比偏差在±30%内；线性范围因分析物而异，Pearson相关系数0.9870–0.9999，多数分析物因异方差性采用加权最小二乘（WLS）回归，反算浓度偏差均低于±20%；LOD为0.03–1.02 μg kg?1，LOQ为0.11–3.40 μg kg?1，仅少数分析物LOQ高于1.5 μg kg?1；提取回收率65.6–114%，多数在70–120%范围内；基质效应?37.6%至12.8%，主要为信号抑制，多数在±20%内或附近；精密度RSD为4.1–17.6%，均低于20%阈值；正确度多数表观回收率在70–120%范围内，所有值在50.0–140%之间，PANO与相应游离碱表观回收率相似，但spartioidine、intermedine、lycopsamine和retrorsine等游离碱在一个或多个浓度水平下表观回收率低于70%，因此所有浓度均进行了空白扣除和正确度校正。在WAC指标评估中，AGREE评分0.37，高于SALLE的0.27，表明SWIEET更绿色但整体绿色度有限，归因于蜂蜜基质复杂性所需的有机溶剂、相分离、蒸发和复溶步骤；BAGI评分75，表明实际适用性高，适合常规分析；RAPI评分42.5，主要因未评估中间精密度、重现性和稳健性等可选参数及采用保守评分方法；VIGI评分60，归类为高度创新，归因于LC-MS/MS方法、补充可持续性和性能指标的应用、严格遵循SANTE鉴定标准、痕量水平灵敏度及SWIEET策略的新颖适配。在商品蜂蜜样品分析中，34个样品中13种PAs至少在1个样品中被定量，85%的样品含有至少1种目标分析物，未检出可定量的PANOs，与PANO在蜜蜂消化过程中被还原导致蜂蜜中以游离碱为主的认识一致；echimidine最常被定量（52.9%），最高浓度52 μg kg?1见于有机薰衣草蜂蜜；heliosupine次之（41.2%），最高9.1 μg kg?1见于同一样品；rinderine和heliotrine各占35.3%，rinderine最高10.7 μg kg?1见于有机多花蜂蜜，heliotrine最高117 μg kg?1见于有机迷迭香蜂蜜，为所有定量PAs中最高单个浓度；非有机商品蜂蜜中多数PAs检出率最高，有机和手工蜂蜜中PA存在率相对较低，最高单个PA浓度主要与商业有机蜂蜜相关，但样品数量有限不足以建立有机生产与PA存在的直接因果关系，可能解释为周围植被差异和产PA植物局部可获得性；植物来源方面PA分布差异显著，最高总PA浓度见于迷迭香蜂蜜（202 μg kg?1），19%样品为4种PAs阳性，4%样品检出多达8种不同PAs；当前欧洲法规对花粉基食品补充剂、花粉和花粉产品设定PAs/PANOs总和最高限量500 μg kg?1，蜂蜜无特定最高限量，本研究中最高总和浓度202 μg kg?1低于花粉产品法规限量，不应解读为法规符合性评估，但提示蜂蜜中PA存在从毒理学角度可能仍有相关性；与近期研究比较，本工作最高总PA浓度一般高于先前报道（昆士兰蜂蜜除外），echimidine为蜂蜜中最常检出的PA之一。
讨论部分总结：本研究描述了创新性SWIEET-LC-MS/MS方法的开发和优化，用于蜂蜜中35种PAs及其N-氧化物的测定。该方法将葡萄糖诱导相分离样品制备的新颖应用与广泛色谱优化策略相结合，实现了结构相关PA和PANO异构体的单独测定。方法按照欧洲指南成功验证，并表现出令人满意的分析性能和实际适用性，得到白分析化学指标的支持。据研究人员所知，这是SWIEET首次应用于复杂蜂蜜基质中该类污染物的全面测定。除分析性能外，该方法在常规食品安全监测和针对性筛查项目中具有潜在应用价值。对34个蜂蜜样品的应用揭示了PAs的高发生率，突出了对尚无特定欧洲最高限量的食品中这些植物毒素持续监测的重要性。未来研究应聚焦于将该方法扩展至更大规模和地理多样化的蜂蜜样品集，以更全面表征不同植物来源和生产系统中PA和PANO的存在情况，所得数据可有助于膳食暴露评估、支持与早期预警策略相关的污染模式识别，并为未来蜂蜜中PA和PANO污染的监管考虑提供科学证据。研究结论翻译：本研究描述了创新性SWIEET-LC-MS/MS方法的开发和优化，用于蜂蜜中35种PAs及其N-氧化物的测定。所提出的方法将葡萄糖诱导相分离样品制备的新颖应用与广泛的色谱优化策略相结合，使得结构相关的PA和PANO异构体能够被单独测定。该方法按照欧洲指南成功验证，并表现出令人满意的分析性能和实际适用性，得到了白分析化学指标的支持。据研究人员所知，这是SWIEET首次应用于复杂蜂蜜基质中该类污染物的全面测定。除分析性能外，所提出的方法在常规食品安全监测和旨在识别蜂蜜中PA和PANO污染的针对性筛查项目中具有潜在应用。其对34个蜂蜜样品的应用揭示了PAs的高发生率，突出了对一种尚未建立特定欧洲最高限量的食品中这些植物毒素持续监测的重要性。未来研究应聚焦于将该方法的应用扩展至更大规模和地理多样化的蜂蜜样品集，从而更全面地表征不同植物来源和生产系统中PA和PANO的存在情况。所得数据可有助于膳食暴露评估，支持识别与早期预警策略相关的污染模式，并为未来关于蜂蜜中PA和PANO污染的监管考虑提供科学证据。
