基于疏水相互作用色谱的绿色高纯度HEK293来源细胞外囊泡分离替代溶剂体系研究

《Talanta》：Alternative Solvent Systems for Green, High-Purity Isolation of HEK293-Derived Extracellular Vesicles Using Hydrophobic Interaction Chromatography

细胞外囊泡（EVs）是直径为30–1000 nm的异质性循环生物纳米颗粒群体，其分子特征反映其细胞来源，内含蛋白质、脂质、核酸和代谢物等生物活性分子，参与多种细胞过程。近年来，EVs的研究重点已转向临床转化和治疗潜力。然而，缺乏标准化且适用的方法从多样复杂的基质中分离和表征EVs，仍是其临床转化的主要挑战。现有分离方法包括超速离心、聚合物沉淀、尺寸过滤和免疫亲和等，但普遍存在耗时长、产量低、通量和重复性有限等问题。液相色谱及相关技术在放大、自动化、重复性和通量方面具有实用替代优势。研究人员所在团队已将疏水相互作用色谱（HIC）应用于天然聚酯（PET）和尼龙毛细管通道聚合物（C-CP）纤维固定相，从多种样品基质中分离EVs，回收率达10¹⁰–10¹² particles mL^-1，纯度高达95%。该HIC方法采用等度阶梯梯度依次分离基质组分、蛋白质和EVs，由于天然纤维相对疏水，需使用（质子）溶剂或表面活性剂将生物分子/纳米颗粒从纤维上解吸，迄今乙腈（ACN）被证明是非常有效的洗脱溶剂（体积浓度<40%）。然而，ACN因其相关毒性而存在健康风险。绿色分析化学（GAC）的发展趋势是使用替代有机溶剂以减少对环境和健康的不利影响。近年用乙醇（EtOH）、异丙醇（iPA）和碳酸二甲酯（DMC）等危害更小的绿色有机溶剂替代ACN已获成功。本研究的主要目标为：1）扩展聚合物纤维平台上用于分离EVs的洗脱液空间；2）通过应用更绿色的替代溶剂体系（SSs）减少或替代ACN的使用。为此，研究人员采用系统方法筛选不同溶剂（单一或组合），以确定可能优于现有ACN洗脱方法的实用改进方案。

研究背景：细胞外囊泡（EVs）作为反映细胞来源的异质性生物纳米颗粒（30–1000 nm），在临床转化和治疗应用方面备受关注，但缺乏标准化、适用的分离表征方法仍是其主要瓶颈。现有方法如超速离心、聚合物沉淀、尺寸过滤和免疫亲和等普遍存在耗时长、产量低、通量和重复性有限等不足。液相色谱及相关技术在放大、自动化和通量方面具有优势。研究人员所在团队已将疏水相互作用色谱（HIC）应用于天然聚酯（PET）毛细管通道聚合物（C-CP）纤维固定相，实现多种基质中EVs的分离，纯度可达95%。该平台采用等度阶梯梯度依次分离基质组分、蛋白质和EVs，因天然纤维相对疏水，需使用（质子）溶剂或表面活性剂进行解吸，乙腈（ACN）此前被证明为有效洗脱溶剂（体积浓度<40%），但ACN存在毒性相关的健康风险。绿色分析化学（GAC）倡导以乙醇（EtOH）、异丙醇（iPA）、碳酸二甲酯（DMC）等更绿色的溶剂替代ACN。本研究旨在扩展洗脱液空间并以绿色替代溶剂体系（SSs）减少或替代ACN，系统筛选单一及二元溶剂体系以确定优于现有ACN方法的方案。研究结论：该工作系统研究了EtOH、iPA、DMC及其二元组合作为PET C-CP纤维柱HIC模式下EV分离的替代溶剂体系。二元溶剂组合被证明是扩展EV分离流动相选择的有效策略，共鉴定出七种不影响色谱性能的新溶剂体系。所有新SS组成的环境影响均低于ACN，其中EtOH-DMC的化学危害降低最大（40%），成功实现了以绿色替代溶剂替换ACN的目标。与标准ACN洗脱方案相比，所有新SS的EV分离产物纯度较基准提高1.5–2.8倍。各SS均未影响nFCM粒径分布或四跨膜蛋白和膜标记的标记效率，形态和膜完整性均保持完好，证实这些SS适用于常规EV分离。近期RPLC研究已证明DMC作为绿色替代流动相组分用于小分子分离和治疗性肽纯化的益处，本研究将DMC的潜在用途扩展至生物纳米颗粒的HIC分离。将DMC纳入二元溶剂SS可提高表观洗脱强度，促进蛋白质富集洗脱步骤中更多蛋白质的去除，从而提高EV纯度。值得注意的是，iPA-DMC混合物表现出独特的选择性，产生一个独特的早期洗脱馏分，经nFCM和TEM证实含有EVs。未来需使用更浓集的馏分对该群体进行详细表征。该独特选择性有望为解析EV亚群和改善复杂基质（包括血浆、乳汁及与单克隆抗体生产相关的CHO细胞培养上清）中EV分离提供机会。基于本研究结果和实际考量，推荐EtOH用于常规EV分离；对于高分辨率分离的未来发展，推荐iPA-DMC。未来工作还将研究维持高效EV结合与洗脱所需的最佳盐和有机溶剂组成，同时降低方法的总体盐和有机含量。重要意义：本研究成功用绿色溶剂体系替代ACN用于PET纤维上的EV分离，在保持EV结构完整性和标记效率的同时将纯度提高至2.8倍，并显著降低化学危害，为EV分离的绿色化、规模化提供了实用方案。研究方法：研究人员采用UHPLC系统在PET C-CP纤维柱（2.1×150 mm，40纤维旋转即2640根纤维）上以HIC模式分离EVs，样品为HEK293细胞培养上清（由Harcum实验室提供）。采用三步等度阶梯梯度（100% MP-A 2 min保留、100% MP-B 3 min蛋白质洗脱、100% MP-C 3 min EV洗脱），筛选10种溶剂体系（单一及二元组合）。EV分离物经离心超滤浓缩换液后，用微量BCA法测定总蛋白，用纳米流式细胞术（nFCM）测定粒径、浓度及膜和四跨膜蛋白标记，用透射电镜（TEM）观察形态。纯度以nFCM EV浓度与BCA蛋白浓度之比计算。绿色度以ChlorTox量表结合加权危害数（WHN）模型评估。研究结果：3.1 溶剂体系在PET纤维上的定性洗脱特征：采用标准阶梯梯度法评估澄清上清的洗脱特征，单一溶剂体系（SS1-3）的蛋白质富集峰（步骤2）洗脱窗口和轮廓相似，EtOH（SS3）峰形明确而ACN和iPA有前肩；含DMC二元体系（SS4-6）中ACN-DMC因溶解性差致基线噪声，iPA-DMC（SS5）在蛋白质洗脱步骤出现明显第二峰（P2）且EV峰左肩消失，提示DMC与iPA组合具有正交选择性；通过SS2a（仅EV洗脱步骤含DMC）和SS5a（仅蛋白质洗脱步骤含DMC）系统变体进一步探究选择性，表明DMC与iPA组合在蛋白质洗脱步骤提高洗脱强度；二元单一溶剂混合物（SS7-9）中ACN-iPA和ACN-EtOH的EV峰有相似右肩提示ACN主导洗脱机制，iPA-EtOH（SS9）峰形明确无左肩。3.2 色谱性能：EV洗脱步骤柱背压随溶剂黏度（ACN2=0.999）无峰畸变，确定25 μL进样；采用10次连续进样、流速提高至1.25 mL min^-1使周期从14 min缩短至9 min；各SS的保留时间RSD<0.4%、峰面积RSD<4%（多数<2%），短期稳定性良好；ChlorTox评估显示所有替代SS的 hazard profile均优于ACN，EtOH-DMC降低最大（40%），其次EtOH（33%）和iPA-DMC（25%）。3.4 EV馏分纯度评估与表征：nFCM测定各SS颗粒浓度范围为1.47–3.26×10⁸ particles mL^-1，总体趋势与EV富集步骤UV216响应一致，iPA-DMC和SS5a因蛋白质洗脱步骤出现第二峰而颗粒浓度较低；微量BCA显示蛋白质富集步骤UV216响应与EV分离物蛋白浓度呈总体 inverse 关系；所有替代SS的纯度均高于SS1，EtOH和EtOH-DMC最高达2.8倍，SS2a最低仍约1.5倍，DMC的加入（iPA vs iPA-DMC、EtOH vs EtOH-DMC）一致提高纯度；nFCM粒径分布高度均一，众数尺寸75–80 nm±20 nm，各SS荧光标记效率良好，TEM显示囊泡结构完整、膜完整、尺寸100–290 nm。3.5 iPA-DMC独特选择性的初步研究：基于色谱特征和较低回收EV浓度，推测iPA-DMC诱导释放疏水性较低的EV亚群；优化方法后40次连续进样（共1 mL上清）评估长期性能，保留时间RSD<0.05%，峰面积RSD在20、30、40次后分别<9%、<14%、<18%，分离轮廓维持； pooled P2馏分nFCM显示模态尺寸约69 nm、浓度8×10⁶ particles mL^-1（事件数<300需谨慎解读），TEM显示72–174 nm的EV样结构，初步表明P2含低丰度EV群体，但其早期洗脱基础及主要组成尚待确立。讨论部分总结：本研究系统研究了EtOH、iPA、DMC及其二元组合作为PET C-CP纤维柱HIC模式EV分离的替代溶剂体系，二元溶剂组合是扩展流动相选择的有效策略，共鉴定七种新溶剂体系；所有新SS环境影响低于ACN，EtOH-DMC化学危害降低最大（40%）；新SS的EV分离物纯度较ACN基准提高1.5–2.8倍；各SS未影响nFCM粒径分布或四跨膜蛋白和膜标记效率，形态和膜完整性保持完好。近期RPLC研究表明DMC作为绿色替代流动相组分用于小分子分离和治疗性肽纯化的益处，本研究将DMC的潜在用途扩展至生物纳米颗粒HIC分离；DMC纳入二元SS提高表观洗脱强度、促进蛋白质去除从而提高EV纯度；iPA-DMC表现独特选择性，产生经nFCM和TEM证实的含EVs的早期洗脱馏分，未来需更浓集馏分详细表征，该选择性有望用于解析EV亚群和改善复杂基质中EV分离。基于结果和实际考量，推荐EtOH用于常规EV分离，iPA-DMC用于高分辨率分离的未来发展；未来还将研究维持高效EV结合与洗脱所需的最佳盐和有机溶剂组成以降低总体盐和有机含量。