基于纳米孔测序与深度学习分类器的细胞tRNA绝对定量与图谱分析

《Nature Communications》：Absolute quantification and profiling of cellular tRNAs by nanopore sequencing and a deep learning classifier

转移RNA（tRNA）在翻译过程中将mRNA密码子与氨基酸连接。其丰度和修饰状态受动态调控，并影响翻译效率、mRNA稳定性和蛋白质稳态。准确分析tRNA图谱至关重要，但深度测序在cDNA合成过程中受修饰诱导的偏差影响，而纳米孔直接RNA测序（DRS）在准确的tRNA图谱分析方面仍面临挑战。研究人员开发了一个端到端的深度学习模型，称为nano tRNA classifier，该模型直接利用纳米孔DRS的离子电流信号对tRNA进行分类，无需碱基识别（basecalling）。该模型在所有大肠杆菌（Escherichia coli）tRNA物种中实现了98.2%的分类准确率和高读段保留率。研究人员使用天然tRNA的等摩尔混合物作为地面真值参考，校正了读段计数偏差，从而实现了多种培养条件下的绝对定量和图谱分析。研究人员进一步开发了二进制分类器，能够在单分子水平上以高准确率检测特定的tRNA修饰。这一基于纳米孔的平台整合了准确的tRNA分类、绝对定量和单分子修饰检测。

研究背景方面，tRNA是翻译过程中将mRNA密码子与氨基酸对应的接头分子，其丰度和修饰状态受动态调控，影响翻译效率、mRNA稳定性和蛋白质稳态。tRNA丰度变化可影响特定mRNA的最优翻译，一旦最优翻译受损，mRNA通过密码子最优性介导的mRNA降解（COMD）途径被显著去稳定化，新生蛋白不能正确折叠，从而影响蛋白质稳态并触发整合应激反应。tRNA稳态水平失调和/或tRNA修饰缺失可导致病理后果，尤其是神经系统疾病和癌症。tRNA携带大量且化学多样的转录后修饰，超过150种RNA修饰中80%以上存在于tRNA中。要研究tRNA丰度及其修饰状态的生理和病理意义，必须快速可靠地在不同生物学背景下定量和分析细胞tRNA。目前存在的主要问题在于：基于下一代测序（NGS）的技术在将tRNA转化为cDNA时，tRNA修饰会干扰碱基配对，诱导逆转录提前终止，尽管可通过AlkB介导的去甲基化和使用热稳定逆转录酶等方法部分缓解，但许多修饰仍阻碍cDNA合成，这些截短的cDNA和错误掺入降低了比对准确性和效率，引入不可避免的偏差。纳米孔直接RNA测序（DRS）无需cDNA转换即可直接分析RNA分子，但tRNA的纳米孔测序仍面临重大挑战：由于tRNA修饰的影响，错配率升高，增加了高度同源tRNA序列间错误比对的可能性，降低了比对准确性；严格比对过滤器虽确保位点特异性准确性但大幅减少可用读段数，导致准确性与通量之间的权衡；现有碱基识别器未针对tRNA修饰进行优化，tRNA中多种修饰聚集在短区域，导致信号分割和碱基识别不准确。因此，研究人员开展了本项研究，开发了名为nano tRNA classifier的深度学习框架，直接利用纳米孔DRS离子电流信号对细胞tRNA进行分类，无需依赖碱基识别或序列比对。研究人员使用纯化tRNA的等摩尔混合物作为定量参考，建立了校正tRNA物种依赖性读段偏差的策略，实现了单个细胞tRNA的绝对定量，并揭示了生长条件依赖的tRNA库变化。研究人员还将该框架扩展至修饰状态的二进制分类，实现了单分子水平上特定tRNA修饰的灵敏检测和定量分析。该研究的意义在于建立了集准确tRNA分类、绝对定量和修饰图谱分析于一体的纳米孔平台，使得tRNA丰度可从传统的相对描述转变为直接定量细胞内tRNA拷贝数，为分析翻译效率、密码子最优性、应激反应和疾病中的翻译失调提供了定量框架。论文发表在《Nature Communications》。

在技术方法方面，研究人员主要采用了以下关键技术：利用互循环色谱法（RCC）从大肠杆菌总RNA中平行分离纯化44种tRNA作为地面真值数据；设计了tRNA特异性接头通过夹板连接捕获tRNA的3′-NCCA末端，实现纳米孔DRS和Illumina测序的文库构建；开发了基于一维卷积神经网络（1D-CNN）和一维WaveNet模块组合的深度学习模型tyCooNN，直接以离子电流信号为输入进行tRNA分类；建立了基于隐藏马尔可夫模型（HMM）和局部序列比对的接头修剪及信号归一化预处理流程；使用等摩尔tRNA混合物作为定量参考校正平台依赖性读段偏差；利用tRNA修饰酶基因敲除菌株（ΔthiI、ΔtruB、ΔtrmB、ΔtapT）构建二进制分类器检测特定修饰。样本队列来源方面，大肠杆菌基因敲除菌株ΔthiI::Kmr、ΔtruB::Kmr、ΔtrmB::Kmr、ΔtapT::Kmr及其亲本菌株BW25113来自日本国立遗传学研究所National BioResource Project；转录组数据来自E. coli K-12对数期和稳定期数据集GSE188752。

研究结果方面，第一，研究人员聚焦于建立将纳米孔DRS读段准确分类至对应tRNA物种的方法，选择大肠杆菌tRNA作为模型系统，利用RCC方法分离了40种单个tRNA物种，四对等解码器因序列几乎相同而共纯化，共获得44个组分，每个纯化tRNA通过光密度精确定量并经RNA质谱验证质量，作为地面真值纳米孔DRS数据用于训练卷积神经网络。第二，研究人员设计了由两个寡核苷酸组成的tRNA特异性接头，基于捕获tRNA 3′-末端NCCA悬垂的夹板连接策略，接头连接后几乎所有tRNA均被连接，表明tRNA物种间连接偏差可忽略，对44种分离tRNA物种和两个酵母tRNA转录本 spike-in进行纳米孔DRS，每种tRNA获得36,000至139,000条读段。第三，研究人员开发了原始纳米孔DRS读段的预处理流程，包括接头修剪、信号归一化和质量控制，基于测序接头与3′ tRNA特异性接头高电流区之间的电流差（Δd）进行信号归一化，通过5′-末端填充将信号延伸至8192个时间点的固定长度，基于读段长度、碱基识别质量、信噪比和接头修剪准确性进行质量控制，每个样本去除10%至28%的读段，中位数为14%。第四，研究人员开发了nano tRNA classifier（tyCooNN），结合CNN进行局部特征提取和WaveNet架构，采用两阶段训练策略，从非增强初始训练过渡到增强阶段，在全部46种tRNA物种上达到平均99%的准确率，分类错误主要涉及tRNAThr1和tRNALeu4的样本污染，质谱分析证实为污染而非模型错误。第五，研究人员将ntc44模型与基于比对的传统方法进行比较，Minimap2平均准确率75.6%、读段保留率72.5%，BWA-MEM平均准确率97.8%但读段保留率仅50.7%，Parasail平均准确率71.2%、读段保留率94.4%，ntc44分类器达到最高平均分类准确率（99.1%）同时保留82.7%的读段；使用未修饰IVT tRNA训练的ntc48IVT模型对天然tRNA仅达77.9%准确率，而ntc44对48种IVT tRNA达到平均98.6%准确率，表明ntc44不受tRNA修饰状态动态变化的影响。第六，为分类全部48种大肠杆菌tRNA物种，研究人员开发了计算策略分离四对等解码器，结合IVT数据集训练的二进制分类器和基于比对的分配方法，提取两种方法一致分配的高置信度读段，最终构建的ntc48模型达到98.2%的分类准确率。第七，研究人员利用等摩尔混合物进行绝对定量，发现纳米孔DRS和Illumina测序之间存在高达5.48倍的读段偏差，且偏差在三次独立实验中可重复再现；经等摩尔参考归一化后，两平台间的相关性从R2=0.23显著提高至R2=0.86，建立了完整的细胞tRNA分析流程，可在1天内完成全部过程，测定了稳定期全部48种大肠杆菌tRNA的丰度，tRNAGly3最丰富占7.08%，tRNASec最少仅占0.07%，约101倍差异，9种tRNA（Gly3、Lys、Arg2、Leu1、Glu、Asp、Asn、Ile1和fMet1）各超过4%共占约50%。第八，研究人员分析了不同生长条件下大肠杆菌tRNA的差异表达，对数期和稳定期之间tRNA库保持高度相关（R2=0.86），但特定tRNA差异表达，Glu、Leu1P、Gln2和Trp在对数期高表达而在稳定期显著降低，Gly1、Leu4、Thr2、Thr3和Thr4在稳定期增加；计算了每个密码子的有效tRNA浓度，CUG（Leu）密码子对应的tRNA约占总量的10%，AGA（Arg）、AGG（Arg）、CGG（Arg）、AUA（Ile）和CCC（Pro）为稀有密码子，有效tRNA浓度平均约0.4%，与最丰富的CUG（Leu）密码子约25倍差异；tRNA丰度与加权密码子使用在对数期（R2=0.67）和稳定期（R2=0.73）均呈强相关；在LB与M9培养基比较中，LB中高表达的Thr4和Met在M9中降低，而fMet2、Glu和Trp增加；在ΔthiI菌株中，携带s4U8修饰的多种tRNA稳态水平显著降低，tRNACys经Northern blotting验证降至WT水平的约五分之一。第九，研究人员评估了基于比对的方法检测tRNA修饰的性能，所有tRNA修饰的ROC分析AUC为0.73，但不同修饰类型的检测灵敏度差异很大，I、Q、m1G、m7G、ms2i6A、acp3U和Ψ较易检测，而s4U、m2A、s2C、Cm、L、ac4C和m6t6A难以检测，m7G和Ψ的AUC分别为0.95和0.89，s4U仅为0.47。第十，研究人员开发了基于tyCooNN的二进制分类器直接检测特定tRNA修饰，以tRNAGly3中的Ψ55为目标，分类器达到平均验证准确率96%，预测的Ψ55比例与实际混合比例高度吻合，假阳性和假阴性率分别为3.5%和4.8%，而基于比对的方法分别为19.0%和23.8%；Ψ55在另外27种tRNA物种中也被成功高准确率检测；对ΔthiI（s4U8）、ΔtrmB（m7G46）、ΔtapT（acp3U47）和ΔtruB（Ψ55）菌株的分析表明，各分类器成功区分了目标修饰的存在与否，s4U8虽无法通过基于比对的方法检测但二进制分类器在多种tRNA物种中实现了检测。

讨论部分总结如下：研究人员开发的nano tRNA classifier（tyCooNN）直接解读纳米孔DRS离子电流信号，不依赖碱基识别序列比对，实现了对细胞tRNA的准确全面分类，克服了传统基于比对方法在分类准确性和读段保留率之间的固有权衡。该模型架构采用逐步开发策略，1D-CNN底部模块单独即可提取信息性特征，引入WaveNet顶部模块通过膨胀卷积扩展感受野并捕获长程依赖关系进一步提高了分类性能。在绝对定量方面，研究人员通过制备44种大肠杆菌tRNA等摩尔混合标准样本，实现了平台依赖性读段偏差的定量评估和校正，校正后纳米孔DRS与Illumina测序的相关性从R2=0.25提高至R2=0.86，表明绝对定量不需要完全消除偏差而是建立偏差量化和校正框架。利用读段偏差校正实现了全部48种大肠杆菌tRNA丰度的高度准确量化，最丰富的tRNAGly3占7.08%，最少的tRNASec仅占0.07%，约100倍差异，基于已报道的细胞内总tRNA浓度225 μM估算了各tRNA物种在对数期和稳定期的细胞内浓度。与先前使用不同方法的研究比较，对数期纳米孔DRS数据与2D-PAGE分析呈中度相关（R2=0.56），与微阵列测量仅呈弱相关（R2=0.14），稳定期数据与已发表的DORQ-seq数据呈中度相关（R2=0.52）。在修饰检测方面，基于碱基识别错误的比对方法对mRNA和rRNA等修饰稀疏分布的长RNA表现良好，但tRNA修饰密集聚集在短序列中且单个修饰对纳米孔信号的影响不局限修饰位点而延伸至邻近残基，导致紧密间隔修饰的信号扰动重叠难以解析；二进制分类器整合全长tRNA的修饰依赖性信号变化而非仅依赖局部碱基识别错误，实现了包括s4U、m7G和acp3U在内的修饰在单读段水平上的准确区分，并可通过混合样本分析定量估计修饰频率。研究结论翻译如下：本研究建立了一个整合高准确度tRNA分类与纳米孔DRS绝对定量的平台。传统上tRNA丰度以相对术语讨论，而该方法能够直接定量细胞内tRNA拷贝数，为分析翻译效率、密码子最优性、应激反应和疾病中的翻译失调提供了定量框架。将该方法应用于包括人类在内的广泛生物体，将能够全面分析发育、环境响应、肿瘤发生和神经退行性变过程中tRNA库和修饰状态的动态变化。通过同时定量tRNA丰度和修饰状态，该方法将翻译系统重新定义为动态可重构的分子网络而非静态组件集合。本研究建立的平台提供了连接RNA修饰生物学和翻译调控定量研究的下一代分析框架。