智能材料与设备架构助力多重CRISPR诊断技术的发展

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Smart Materials and Device Architectures Enabling Multiplexed CRISPR Diagnostics

• 对实现多重CRISPR/Cas诊断的工程原理进行了深入评估。• 比较了支持分散式CRISPR生物传感的制造方法和智能材料。• 讨论了用于高性能多重CRISPR平台的集成微器件架构。• 强调了临床可部署的CRISPR诊断在转化应用中的关键挑战和未来机会。

引言
现代治疗正逐渐从“一刀切”的模式转向个性化精准医疗。因此，快速识别疾病特异性分子生物标志物已成为及时临床干预的核心。蛋白质和核酸是许多癌症、传染病和神经退行性疾病的已知生物标志物。然而，它们在临床样本中的丰度通常极低，这给分析带来了重大挑战。此外，复杂疾病很少由单一靶点引起；通常存在多个分子特征，迫切需要从单靶点检测转向多重检测。多重平台可以节省生物样本，并减少处理时间和成本。绘制多个生物标志物的图谱可以提供更完整的疾病视图，从而实现更好的预后和个性化治疗策略。

许多分析技术，包括聚合酶链反应（PCR）、定量PCR（qPCR）、微阵列和下一代测序（NGS），都具有出色的分析灵敏度和特异性。然而，将这些实验室方法转化为稳健的即时检测（POCT）平台仍然是一个重大挑战。在解决这一差距的新技术中，基于CRISPR/Cas的诊断方法因结合了可编程的分子识别和催化信号放大而受到了广泛关注。根据世界卫生组织的指南，理想的POCT设备应满足REASSURED标准：实时连接性、样品采集便捷性、经济实惠、敏感性、特异性、用户友好性、快速性和稳健性、无需设备以及可交付性。尽管在生物传感器开发方面进行了数十年的深入研究，但只有少数分子诊断平台成功进入了临床应用。缩小这一转化差距不仅需要分子生物学的进步，还需要材料科学、设备工程和可扩展制造的进步。

1987年，Ishino等人首次在大肠杆菌中发现了短回文序列[1]，但当时这些重复序列的生物学意义尚不清楚。1995年，Francisco Mojica在Haloferax mediterranei和Haloferax volcanii中发现了短串联重复序列，并报告了CRISPR相关基因（cas基因）的鉴定[2]。2005年，CRISPR与针对外来DNA的适应性免疫机制联系在一起，表明CRISPR可以保护细菌免受噬菌体感染。这导致了Cas9蛋白及其相关酶切活性的发现[3][4][5]。2012年，Jennifer Doudna和Emmanuelle Charpentier通过重新利用Cas9系统实现了精确的基因组编辑，彻底改变了这一领域[6]。尽管Cas9系统因其基因编辑能力而受到广泛关注，但Cas12和Cas13的附带切割活性的发现使CRISPR成为一种多功能的分子诊断分析平台。CRISPR系统可分为两类七种类型和46个亚型。第一类包括I型、III型、IV型和VII型，这些类型涉及多个Cas蛋白共同作用，由于其复杂的机制，在诊断应用中尚未得到广泛探索；而第二类包括II型、V型和VI型[7]。

Cas12（Cpf1）是一种第二类V型RNA引导的DNA内切酶系统，可以切割单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA）。它还具有非特异性附带切割活性，可以无差别地切割任何存在的非目标ssDNA或dsDNA[8]（图1a）。Cas13（C2c2）是一种第二类VI型RNA引导的RNA内切酶。Cas13可以识别目标单链RNA，并且也具有非特异性附带切割活性，可以切割任何存在的非目标单链RNA[9][10]（图1b）。2017年，发现了Cas13a（C2c2）的核糖核酸酶活性，从而开发出了SHERLOCK，这是第一个基于CRISPR/Cas的荧光读数传感平台，能够以阿托摩尔级灵敏度检测寨卡病毒和登革热病毒株[11]。随后，Chen等人开发了DNA内切酶靶向CRISPR转报告器（DETECTR）来识别HPV16和HPV18病毒株[8]。2018年，Li等人开发了一种低成本多功能高效系统（HOLMES），用于检测DNA和RNA目标。这是与DETECTR同时开发的第一个基于Cas12a的诊断平台。如果系统中存在目标DNA，Cas12a/crRNA会与目标形成三元复合物，被激活并切割F-Q探针。他们发现Cas12a-crRNA的最小可检测浓度为0.1 nM，与PCR结合使用时可达到10 aM[12]。这些发现共同为基础新一代基于CRISPR的诊断技术奠定了基础（图1c），其中目标诱导的附带切割被转化为光学、比色或电化学读数。

同时检测多个分子目标的能力已成为CRISPR诊断的核心目标。该领域仍面临重大工程挑战，特别是在多重检测方面[13][14]。这一挑战源于CRISPR/Cas效应子的固有附带核酸酶活性，这使得在单一反应中同时检测多个目标变得复杂。为了解决这些限制，研究人员采取了互补的多重检测策略。在这篇综述中，多重检测指的是在单一检测工作流程中同时检测多个目标。这些策略可以分为：(i) 空间多重检测，其中目标被物理分离到不同的反应室中；(ii) 光谱/光学多重检测，其中目标共享反应体积但通过不同的荧光染料、条形码、颜色等进行区分；(iii) 酶法/正交多重检测，其中具有不同附带切割偏好的不同Cas效应子或同源物配对；以及(iv) 基于分子/逻辑的多重检测，其中组合分子电路（AND/OR逻辑门）从多个输入生成单一的集成读数。

最早成功的多重检测策略之一依赖于表现出不同附带切割偏好的正交Cas效应子。Gootenberg等人通过结合LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a（每种都与特定的二核苷酸切割偏好相关，并配有相应的荧光报告器TEX、FAM Cy5和HEX）来扩展SHERLOCKv2技术，从而同时检测四个分子目标。由于每种酶的附带切割活性仅由其匹配的报告基序有效触发，通道间的交叉反应最小化，而特定酶的crRNA确保只有匹配给定目标的酶才会被激活，从而能够在单一反应中解析出四个目标，而无需物理分离[15]。Ghouneimy等人提出了另一种互补方法，他们建立了结合环介导等温扩增（LAMP）的CRISPR/Cas多重诊断检测（CRISPRD）用于宫颈癌检测。在此方法中，作者使用了三种不同的耐热Cas效应子——AapCas12b、TccCas13a和HheCas13a——实现了10个拷贝的检测限（LOD），并对HPV16、HPV18和RNase P内部控制具有高度特异性。AapCas12b针对HPV16并切割ROX标记的DNA报告器，HheCas13a针对HPV18并切割FAM标记的报告器，TccCas13a针对RNase P并切割HEX标记的报告器。由于每种核酸酶仅与其自身的引导RNA形成功能复合物，只能识别并优先切割其指定的目标，因此三种检测事件可以在同一容器内的不同荧光通道中区分开来[16]。虽然单容器检测法为简化工作流程提供了吸引人的途径，但仍需解决一些缺点，包括高背景信号、交叉反应、灵敏度降低和复杂的优化程序。因此，空间分隔已成为多重CRISPR诊断的强大补充策略。微流控或芯片实验室（LOC）平台可以对流体进行精确的时空控制，实现CRISPR反应的物理隔离，同时最小化并行检测之间的交叉反应。这些平台因其低样品消耗、操作简便、微型化潜力和高通量性能而受到广泛关注[17]。空间分隔的潜力或许最好体现在Ackerman等人开发的CARMEN平台上，该平台结合了微孔阵列和CRISPR检测技术，能够同时识别169种人类相关病毒。CARMEN通过为每个扩增样品和每个Cas13检测混合物（Cas13、crRNA和报告器）分配不同的颜色代码，将它们乳化成纳米级液滴，并汇集在一起。将这些液滴加载到微孔阵列上，每个样品与每个检测混合物在单独的孔中配对。合并每对液滴会触发反应，荧光读数映射回每个液滴的颜色代码，从而显示哪些样品对哪些目标呈阳性。这种被动组合配对方式使CARMEN能够在单个阵列上测试超过4,500个crRNA-目标对，将每次测试的试剂成本降低了300多倍[18]。然而，CARMEN依赖于专用仪器和复杂的协议，这促使了mCARMEN的发展[19]，这是一种基于Fluidigm的简化实现，其检测限为500拷贝/μL。随后探索了一系列设备架构，包括纸质设备、电化学芯片、微流控系统和可穿戴传感器用于多重CRISPR/Cas诊断。最近的一些综述[20][21][22]详细介绍了其中的一些策略。我们的综述采取了更全面的方法，概述了设备制造方法、先进的智能材料和设备平台，并探讨了材料工程、微制造和集成设备架构的进步如何融合，以实现临床相关的多重CRISPR诊断。

**多重CRISPR设备的制造策略和设备架构**
多重CRISPR诊断的性能不仅取决于分子识别化学，还取决于用于制造分析设备的制造策略。制造方法影响通道几何形状、试剂分隔、可扩展性、制造成本以及最终的大规模部署可行性。因此，选择合适的制造策略是将实验室原型转化为实际应用的关键工程考虑因素。

**支持CRISPR/Cas多重检测的智能材料**
从单分析物CRISPR检测到多重诊断平台的转变越来越依赖于材料科学的进步。智能材料不仅作为被动支撑，还主动影响信号生成、试剂分隔、分子传输和光学编码，从而解决了多重CRISPR生物传感中的几个基本挑战。因此，材料工程已成为设计中的核心组成部分。

**用于空间分离的微流控架构**
虽然智能材料提高了反应效率和信号生成，但设备架构决定了多个CRISPR反应是否可以并行操作而不相互干扰。空间分隔已成为克服多重CRISPR诊断固有限制的最有效策略之一。微流控平台可以物理隔离各个反应，减少报告器之间的串扰，降低非特异性附带切割。

**可穿戴传感器**
尽管可穿戴CRISPR诊断仍处于开发早期阶段，但它们代表了下一代分散式实时分子监测的最令人兴奋的方向之一。通过非侵入性方法监测汗液、唾液、呼吸液或间质液中的目标水平可以提供快速、实时的结果（图8a）。Nguyen等人通过将CRISPR/Cas反应置于空间分离的孔中，并使用不同的荧光染料开发了一种多重可穿戴CRISPR传感器。

**结论与未来展望**
多重CRISPR生物传感的追求推动了可编程分子识别、智能材料和微器件工程的融合，其中物理分离和空间分隔已成为最小化交叉反应和实现并行分析的主要工程策略。当前文献中的一个关键结论是，没有一种单一材料或设备架构能够提供通用的多重CRISPR解决方案。

**作者贡献声明**
Luca Capelli：撰写——原始草稿、正式分析、数据管理。
Dharshini Raghavan：撰写——原始草稿、正式分析、数据管理。
Alessandra Zanut：撰写——审查与编辑、监督、概念化。
Alessandro Bertucci：撰写——审查与编辑、监督、资金获取、概念化。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争财务利益或个人关系。

**致谢**
该项目获得了意大利癌症研究协会（AIRC）的资助，项目代码为31108，项目名称为“用于体液蛋白质生物标志物的CRISPR-Cas驱动检测技术[CRISPOWER]”，项目负责人为Alessandro Bertucci。该项目得到了意大利大学和研究部的国家恢复与韧性计划（NRRP）第4任务第2组第3.3项招标编号630/2024的资助，该计划由欧盟支持——NextGeneration EU。

Dharshini Raghavan | Luca Capelli | Elena Spezzani | Alessandro Bertucci