益生菌酵母Saccharomyces boulardii的遗传工程工具箱：内源启动子与终止子表征、无标记CRISPR-Cas9整合位点评估及rDNA多拷贝整合

《Synthetic and Systems Biotechnology》：A genetic engineering toolkit for the probiotic yeast Saccharomyces boulardii

Saccharomyces boulardii（S. boulardii）是临床实践和消费产品中唯一广泛使用的酵母益生菌。该菌兼具胃肠道耐受性、固有抗生素耐受性和真核蛋白加工能力，使其成为工程化益生菌、原位生物制造和活体生物治疗递送的有吸引力的底盘。然而，在临床使用的S. boulardii CNCM I-745背景下，对调控元件、候选基因组整合位点和多拷贝整合策略的宿主特异性表征仍然有限。本研究以S. boulardii CNCM I-745为宿主，开发并表征了一个将转录调控元件与基因组整合策略相结合的遗传工程工具箱。研究人员首先定量了20个内源组成型启动子、2个诱导型启动子和6个终止子的活性；随后建立了无标记CRISPR-Cas9工作流程并评估了10个染色体整合位点，其中6个位点的编辑效率（editing efficiency）超过80%，同时支持可比的转基因表达且无可检测的生长缺陷；最后，研究人员构建了基于rDNA重复序列的多拷贝整合系统，使转基因表达较单拷贝整合提高9.8至22.6倍，并揭示了估计拷贝数与报告基因输出之间显著的正相关但非比例关系。该工具箱为S. boulardii提供了一组可调启动子和终止子、与无标记CRISPR-Cas9工作流程兼容的候选染色体整合位点。这些资源扩展了该益生菌酵母的遗传可操作性，并为开发具有增强益生、治疗和生物制造功能的工程化S. boulardii菌株奠定了基础。

研究背景与问题：益生菌是能帮助维持肠道微生物平衡并赋予宿主健康益处的活微生物，常见种类包括Escherichia coli Nissle 1917及Lactobacillus、Bacillus、Bifidobacterium、Streptococcus和Enterococcus等产乳酸菌。近年来，许多益生菌菌株被进一步工程化用于疾病治疗和健康干预。Saccharomyces boulardii（S. boulardii）是目前唯一被广泛用作益生菌的酵母菌种，1923年由Henri Boulard从荔枝和山竹果皮中首次分离，此后广泛应用于食品、药品和健康产品，尤其用于管理腹泻等胃肠道疾病。该菌被美国食品药品监督管理局（FDA）认定为公认安全（GRAS），其临床疗效已在双盲研究中得到验证，且与Bifidobacterium、Lactobacillus和E. coli等常用益生菌相比表现出更强的免疫调节特性。此外，S. boulardii具有37 °C生长、耐受低pH、固有抗生素耐受性和真核翻译后修饰能力等对工程应用极具吸引力的特征，这些特性支持其在胃肠道中的存活，并使其成为原位生产和递送复杂治疗性蛋白和生物制剂的潜力底盘。遗传工程和合成生物学的进展为工程化S. boulardii创造了新机遇，近期应用包括治疗分子递送、延长胃肠道滞留时间、扩展底物利用和构建生物防护策略，这些应用均需要稳健的遗传部件和可靠的基因组工程工具。已有研究建立了S. boulardii的重要遗传工程工具，包括质粒表达系统、CRISPR-Cas9/Cas12a介导的基因组编辑、组成型启动子和终止子表征以及可编程转录调控。然而，在临床使用的S. boulardii CNCM I-745背景下的宿主特异性表征仍相对有限，尤其是诱导型调控元件、系统评估的候选基因组整合位点和靶向多拷贝整合策略方面。为解决这些空白，研究人员在S. boulardii CNCM I-745中表征了20个内源组成型启动子、2个诱导型启动子和6个终止子，使用通用报告框架评估了10个候选染色体整合位点，并建立了靶向rDNA的多拷贝整合策略。该工作通过更广泛的内源部件比较和评估候选整合策略的通用框架对其进行了扩展，并为合理开发具有增强益生和治疗特性的工程化S. boulardii菌株奠定了基础。

主要关键技术方法：研究以通过CRISPR-Cas9介导缺失URA3从S. boulardii CNCM I-745生成的酵母菌株HDy1为宿主，用于启动子强度测定、整合位点评估和多拷贝整合工具表征；半乳糖诱导实验在HDy1或相应GAL80缺失菌株中进行；克隆实验在E. coli DH5α中完成。关键技术包括：Gibson组装构建质粒；醋酸锂法酵母转化；以yEGFP为报告基因、通过荧光/OD₆₀₀归一化定量启动子和终止子活性；基于CHOPCHOP设计sgRNA、针对参考基因组装配ASM129837v2（NCBI装配登录号GCA_001298375.2）的无标记CRISPR-Cas9基因组整合及基于荧光集落比例的编辑效率评估；菌落PCR及5′/3′连接PCR、WT特异性PCR验证整合；生长曲线与最大比生长速率（μ_max）测定；qPCR测定基因拷贝数；以及基于rDNA重复序列的多拷贝整合系统构建与传代稳定性评估。研究未涉及样本队列来源。

研究结果：

3.1 内源启动子和终止子的表征：研究人员以yEGFP为报告基因，在低拷贝ARS/CEN质粒和多拷贝2μ质粒两种基因剂量背景下测定20个内源组成型启动子活性，并以荧光/OD₆₀₀归一化比较启动子强度。结果显示启动子活性范围广泛，P_PDC1在测试的游离质粒条件下相对活性最高，P_TDH3、P_CIT1、P_TEF1、P_HXT7和P_FBA1表现出可比的高水平活性，可归类为强启动子，其余启动子表现为中等或较弱活性；由于这5个强启动子表达输出相似，可作为多基因构建体中可互换的强启动子以减少重复序列引起的同源重组。启动子相对活性排序在ARS/CEN和2μ质粒背景下相似，但ARS/CEN报告基因荧光信号较低、实验变异较大，故后续诱导型启动子和终止子表征采用2μ质粒。对诱导型启动子，P_CUP1可被Cu²⁺有效激活，荧光强度随Cu²⁺浓度先升高后逐渐降低，同时最终OD₆₀₀随Cu²⁺浓度升高而逐渐下降，表明高Cu²⁺损害细胞生长；P_CUP1诱导比总体随Cu²⁺浓度升高而增加，综合考虑诱导效率和细胞毒性，约0.03 mM Cu²⁺在启动子激活与细胞生长间提供适当平衡，相对未诱导对照实现18.52倍诱导。P_GAL1未能完全重现S. cerevisiae中经典的葡萄糖阻遏调控，在补充20 g/L半乳糖的SC-ura培养基中，其活性相对无半乳糖条件增加4.14倍；进一步缺失GAL80后，P_GAL1不再被半乳糖诱导，其转录强度较GAL80缺失前半乳糖诱导状态额外增加2.1倍，表明GAL80缺失将P_GAL1从半乳糖响应型启动子转变为具有高基础活性和大幅降低半乳糖依赖诱导比的启动子；研究人员讨论认为S. boulardii保留主要GAL调控和Leloir途径基因，但半乳糖利用效率低与PGM2（编码连接Leloir途径与糖酵解的磷酸葡萄糖变位酶）的保守截短突变相关，该代谢特征可能促成所观察到的中等启动子响应。对终止子，研究人员选取6个高表达基因终止密码子下游225 bp序列作为候选终止子，在P_TDH3驱动的2μ报告质粒中测试，6个终止子产生的表达输出差异相对较小，其中T_ACT1支持最高表达水平，提示需要精细调节转基因表达时可进一步优化特定启动子-终止子组合。

3.2 异源基因候选基因组整合位点的开发与表征：由于体内应用中质粒表达系统常因营养缺陷型或抗生素选择标记难以维持及质粒稳定性有限而不适用，稳定染色体整合对持续表达至关重要。S. boulardii为二倍体，依赖选择标记的传统线性DNA同源重组方法难以迭代编辑，且难以获得单倍体菌株，故研究人员采用无标记CRISPR-Cas9方法，并借鉴S. cerevisiae MYT工具箱设计原则，选择并表征10个候选染色体整合位点。对每个位点构建可通过Gibson组装装配目的基因的基本整合质粒，以yEGFP为报告基因与CRISPR-Cas9质粒共转化，以荧光集落占总集落比例记录基于荧光的整合频率。结果显示INT2、INT4、INT5、INT7、INT8和INT10共6个位点编辑效率超过80%。代表性GFP阳性集落经菌落PCR初筛获得预期大小扩增子；每个位点两个独立分离的GFP阳性克隆经5′和3′基因组-盒连接特异性PCR确认正确同靶整合；靶向原始Cas9切割位点完整基因组序列的WT特异性PCR在亲本HDy1中检测到预期扩增子而在所分析整合体中未检测到，表明PCR未检出未编辑等位基因，支持所测位点的双等位基因修饰；INT1、INT4、INT5和INT8的代表性整合体在非选择性条件下培养后不能在SC-ura上生长，支持Cas9质粒成功治愈及无瞬时选择质粒保留的基因组整合。以荧光/OD₆₀₀评估各位点表达输出，尽管INT1和INT6报告输出略高于其他位点，但总体变异相对有限，这些位点提供了一组报告表达广泛可比的候选整合位点，有利于可转移遗传线路和信号模块设计，也为通过不同强度启动子进行合理调节留有空间。生长曲线和最大比生长速率分析显示，所有10个整合菌株生长曲线与亲本HDy1相当，在所测YPD培养条件下未检测到显著差异，表明所选位点整合不施加可检测的不利生长影响。

3.3 多拷贝整合工具的构建与表征：传统多位点多拷贝整合策略劳动密集且最大拷贝数受可用位点数限制，故研究人员基于rDNA重复序列开发多拷贝整合方法。S. cerevisiae rDNA重复拷贝数约200，S. boulardii作为二倍体酵母预期含有许多rDNA重复，尽管现有基因组装配中仅注释8个rDNA序列。该系统由两个质粒组成：pHD163为携带rDNA同源臂、其间插入yEGFP和目的基因克隆位点的整合质粒；pHD164为表达靶向rDNA位点sgRNA的Cas9质粒。实践中，携带表达盒的rDNA同源臂片段由pHD163经PCR扩增并与pHD164共转化尿嘧啶营养缺陷型S. boulardii，铺于SC-ura后不同数量表达盒随机整合入rDNA位点，随后挑选高绿色荧光集落培养并进一步荧光测定。qPCR定量显示所检测最高拷贝数达51；在32个独立分离的rDNA多拷贝整合体中，估计yEGFP拷贝数与荧光/OD₆₀₀呈显著正相关（Spearman ρ = 0.529，P = 0.0019），但观察到相当大的克隆间变异，荧光并不随拷贝数成比例增加，表明拷贝数本身不能完全解释所观察的表达差异；此外部分克隆出现生长受损，提示多拷贝基因表达可对宿主施加代谢负担，实际应用应综合考虑荧光输出、生长性能和目标产物产量。总体而言，与单位点整合相比，基于rDNA的多拷贝整合系统使基因表达提高9.8至22.6倍。稳定性评估中，32个独立分离克隆在非选择性YPD中连续传代，培养10代和20代后多数整合体仍保持相对单拷贝菌株升高的yEGFP拷贝数和报告输出，但两参数在连续传代中总体逐渐下降，表明rDNA靶向多拷贝整合可在多代中维持增强的基因剂量和表达，同时提示需考虑非选择性条件下克隆依赖的长期稳定性。

讨论与结论：讨论部分指出，本研究系统建立了S. boulardii遗传工程工具箱，整合了内源启动子和终止子文库、无标记CRISPR-Cas9染色体整合位点和基于rDNA重复序列的多拷贝整合策略。启动子表征结果凸显了进化保守性与宿主特异性调控行为：P_PDC1在S. boulardii中活性最高，表明在S. cerevisiae中建立的相对启动子活性排序不能简单直接外推至该宿主，此类宿主依赖差异可能反映转录调控架构的分化，强调工程化新微生物底盘时需系统功能校准；同时多个具可比高水平活性的启动子为多基因系统提供可互换调控部件，可降低重复序列相关重组风险。对于诱导调控，P_CUP1和P_GAL1表明经典调控逻辑可部分转移至S. boulardii，同时凸显表达可调性与宿主生理间的重要权衡；诱导调控系统正从营养响应型调控转向临床相关环境和疾病相关信号。P_GAL1行为说明需同时考虑宿主调控和代谢特征，PGM2保守截短突变限制葡萄糖-1-磷酸向葡萄糖-6-磷酸转化并与半乳糖利用缓慢和半乳糖依赖生长抑制相关，近期S. boulardii半乳糖代谢工程表明恢复半乳糖利用可改善半乳糖响应生长和基因表达控制；GAL80缺失增加基础P_GAL1活性并降低对半乳糖的额外响应，与Gal80作为Gal4抑制因子的既定作用一致，提示GAL调控逻辑在S. boulardii中至少部分保守，其定量输出还可能受宿主特异性半乳糖代谢影响。讨论还指出，本研究所表征启动子和终止子活性基于游离yEGFP报告构建体，荧光/OD₆₀₀终点值应解释为特定质粒和培养条件下的相对调控性能而非内在活性直接测量；荧光报告输出整合转录下游多个过程包括翻译和荧光团成熟，并可能受细胞生长状态影响，故调控元件数据最适合在测试实验框架内比较选择遗传部件。基因组层面，所鉴定候选整合位点支持广泛可比的报告输出且无可检测生长损伤，但基因组背景是选择可靠整合位点的重要考量，理想着陆位点应支持转基因表达同时尽量减少对内源基因和调控区域的干扰，这些位点效应及对不同载货的性能仍需进一步验证；结合高效同源重组，无标记CRISPR-Cas9策略简化了二倍体宿主基因组编辑并避免标记回收负担。由于S. boulardii CNCM I-745为二倍体，等位基因编辑状态是重要考量，WT特异性PCR未检出残留未编辑等位基因、5′/3′连接PCR支持正确整合，结果与双等位基因修饰一致，但基于PCR的基因分型不能完全排除CRISPR相关杂合性丢失、较大染色体重排或额外异位供体整合，需全基因组分析全面评估编辑后基因组完整性；代表性整合体已验证瞬时携带URA3的Cas9质粒治愈。rDNA多拷贝整合已在酵母工程中广泛使用，S. cerevisiae中Chen等开发的IMIGE系统利用delta序列和rDNA重复进行迭代多拷贝整合，使麦角硫因和虫草素产量分别提高407.39%和222.13%；Hansenula polymorpha中靶向rDNA和Ty元件的多拷贝整合工具使β-胡萝卜素产量提高约60倍；本研究结果补充了这些研究并证明rDNA多拷贝整合在酵母底盘中的更广泛适用性，同时揭示表达放大与细胞负担间的内在张力，估计拷贝数与报告输出显著正相关但非比例关系及高拷贝克隆生长缺陷可能源于局部染色质背景差异和表达相关细胞资源需求，但本研究未直接检验这些机制。连续传代实验进一步显示rDNA靶向多拷贝整合体在多代中保持升高基因剂量和报告输出，但估计拷贝数和荧光/OD₆₀₀在无选择长期培养中逐渐下降，这与重复rDNA阵列动态和易重组特性一致，同源重组可导致重复拷贝数扩增或收缩；高拷贝整合体增强表达容量可能伴随长期遗传稳定性权衡，对需长期传代的应用，克隆特异性稳定性评估和拷贝数优化对平衡表达性能与菌株稳健性可能很重要。更广泛而言，本研究凸显工具转移与宿主特异性重建的关系：S. boulardii与S. cerevisiae的进化近缘使许多现有工具可相对顺利转移，但启动子强度排序和整合位点行为等关键参数仍需在目标宿主中重新定义；S. boulardii二倍体基因组是与单倍体模型酵母系统的重要区别约束，在此背景下无标记CRISPR-Cas9编辑具有明显方法学优势；这些发现表明工程化非模式酵母不仅是导入现有工具的过程，还需重新表征宿主特异性调控和基因组特性。研究局限性包括：启动子和整合位点源自单一菌株S. boulardii CNCM I-745，其他分离株（包括商业益生菌产品用菌株）可能遗传不同而影响工具箱可移植性；连续传代中拷贝数和荧光逐渐下降的结构基础未解决，基于PCR和qPCR的分析无法确定拷贝数丢失、rDNA重排、杂合性丢失或其他基因组事件，需长读长或全基因组分析；系统在胃肠道环境中的性能和稳定性仍待评估，近期利用CRISPR-Cas9工程化S. boulardii递送抗李斯特菌内溶素并在模拟人胃肠道条件中验证的工作提供了有用先例；评估主要在体外培养条件下进行，工程化S. boulardii体内性能包括与肠道微生物群和宿主免疫系统相互作用应在动物模型中测试；虽表征10个整合位点，该数量对构建复杂多基因代谢途径可能仍不足，需进一步扩展整合位点文库。

研究结论翻译：本研究为S. boulardii提供了一组可调启动子元件、经实验表征的候选染色体整合位点和简便的基于rDNA的多拷贝整合工具。这些资源可能促进S. boulardii作为下一代工程化益生菌用于疾病治疗、原位生物制造和治疗性递送。近期综述强调S. boulardii遗传工程正迅速向免疫调节、病原体中和、抗肥胖策略和维生素生产扩展，本研究建立的工具箱为这些应用提供了基础。未来工作可在若干方向推进：第一，诱导型启动子文库应扩展至响应更多临床相关环境信号，如炎症相关生物标志物；第二，应开发更多基因组整合位点以支持复杂代谢途径和治疗线路的多基因整合；第三，该工具箱应应用于治疗分子的生产和验证，如抗炎细胞因子和抗菌肽，并在动物模型中进行；第四，应纳入稳健的生物防护策略以应对工程化益生菌环境释放相关的生物安全问题。随着遗传工程工具的持续成熟，S. boulardii有潜力从传统益生菌进化为精确、可编程和多功能的活体生物治疗平台。