《Andrology》：Temporal Effects of Exogenous Testosterone on the Circulating Small Noncoding RNA Landscape in a Placebo?Controlled Human Study
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摘要
背景：合成代谢雄激素类固醇（Anabolic–androgenic steroids，AAS）被广泛滥用，但作为生理读数及滥用生物标志物的分子标记仍缺乏明确定义。循环小非编码RNA（small noncoding RNAs，sncRNAs）是潜在的内分泌
摘要
背景：合成代谢雄激素类固醇（Anabolic–androgenic steroids，AAS）被广泛滥用，但作为生理读数及滥用生物标志物的分子标记仍缺乏明确定义。循环小非编码RNA（small noncoding RNAs，sncRNAs）是潜在的内分泌响应信使及候选生物标志物。
目的：确定外源性睾酮给药是否能急性且持续地改变循环sncRNAs。
材料与方法：这是一项在健康性腺功能正常男性（n=19；20–30岁）中开展的随机、双盲、安慰剂对照试验。受试者在第0天和第21天接受250 mg混合睾酮酯（Sustanon 250）或安慰剂的肌肉注射。在第0天、第1天和第42天采集血清，并使用RealSeq-Biofluids文库试剂盒对分离的RNA进行小RNA测序。研究人员利用RT-qPCR技术在29名围青春期男孩的纵向血清样本中检测了miR-214-3p与睾酮浓度之间的关联，并通过原位杂交技术研究了其在睾丸组织中的表达。
结果：在睾酮给药后24小时，研究人员鉴定出一个由19个Sustanon响应的sncRNAs组成的独特特征谱（12个上调，7个下调），其中PIWI相互作用RNA（piRNAs）是最具代表性的类别。其中一个Sustanon特异性的sncRNA，即miR-214-3p，被发现与围青春期男孩的循环睾酮水平呈正相关，并在睾丸组织中表达，包括产生睾酮的间质细胞（Leydig cells）。尽管在第42天睾酮水平已恢复至基线浓度，仍有160个sncRNAs保持改变，表明睾酮使用具有持续效应。整合短期和长期分析揭示了43个Sustanon特异性的sncRNAs，其中包括核仁小RNA U3（small nucleolar RNA U3）。
讨论：尽管样本量有限，本研究强调了多个sncRNAs响应于睾酮暴露。未来需要进一步研究以对所鉴定的sncRNAs形成功能性、组织特异性的理解。
结论：短暂的超生理剂量睾酮暴露会在急性期及数周内重塑循环sncRNAs，这表明雄激素参与了全身性的基于RNA的通讯。数个响应的sncRNAs，特别是miR-214-3p和snoRNA U3，显示出作为雄激素滥用生物标志物的潜力。
研究背景与问题
合成代谢雄激素类固醇（AAS）被广泛滥用，尤其在运动员群体中，用以增加肌肉质量和提升体能表现。然而，AAS的使用伴随着众多不良反应，如肾毒性、高血压、肝毒性和血脂异常，并可导致临床显著的睾酮缺乏和不育。尽管反兴奋剂机构致力于开发可靠的检测方法，但目前用于监测AAS滥用的分子标志物，尤其是能反映其生理效应的读数和生物标志物，仍然十分匮乏。
循环小非编码RNA（sncRNAs）是一类多样化的调控RNA，它们不仅能在细胞内发挥转录后调控作用，还能稳定存在于血清等体液中，并可能被受体细胞摄取进而调节基因表达，因此被认为是潜在的内分泌样信使。已有研究表明，sncRNAs的变化与内分泌活性改变有关，例如在睾丸功能受损或人绒毛膜促性腺激素（hCG）刺激后，特定类型的sncRNAs（如piRNAs和miRNAs）会发生显著变化。这提示sncRNAs可能成为反映雄激素状态和检测AAS滥用的新型生物标志物。然而，现有研究多集中于特定的sncRNA亚型（如miRNA或piRNA），对于AAS如何全面影响所有亚型的循环sncRNAs，尤其是在急性暴露和长期效应方面，尚存在知识空白。
为此，研究人员开展了一项随机、双盲、安慰剂对照的人体研究，旨在全面评估外源性睾酮（Sustanon 250）给药后，对健康年轻男性循环sncRNA谱系的急性与持续性影响。
研究方法概述
- 1.
临床试验设计：采用随机、双盲、安慰剂对照设计，纳入19名健康性腺功能正常男性（20-30岁），分别在第0天和第21天肌肉注射Sustanon 250（250 mg混合睾酮酯）或安慰剂（1 mL生理盐水）。
- 2.
样本采集与测序：在第0天（基线）、第1天和第42天采集血清样本。使用Quick-cfRNA Serum & Plasma Kit提取总RNA，随后采用RealSeq-Biofluids文库试剂盒构建小RNA文库，并在Illumina NextSeq 550平台上进行单端75 bp测序。
- 3.
数据分析：测序数据经过去接头、长度筛选后，使用Bowtie2将序列比对至rRNA、tRNA、miRNA（MirGeneDB）、piRNA（piRBase）等多个数据库。使用edgeR包进行差异表达分析，以错误发现率（FDR）q值<0.05为显著性阈值。
- 4.
独立队列验证：从哥本哈根青春期研究II（COPUSII）中选取29名围青春期男孩的纵向血清样本，通过RT-qPCR技术验证miR-214-3p与睾酮浓度的相关性。
- 5.
组织定位：通过原位杂交（ISH）技术，在成人睾丸组织切片上检测miR-214-3p的表达和定位。
研究结果
3.1 Sustanon对循环sncRNAs的短期效应
通过对比基线和第1天的sncRNA表达谱，研究人员发现，在排除安慰剂组也发生变化的sncRNAs后，Sustanon组特有12个上调的sncRNAs和7个下调的sncRNAs。其中，piRNAs是数量最多的亚型（占37%）。在差异表达的miRNAs中，研究人员重点关注了上调的hsa-miR-214-v1-3p和hsa-miR-374-P1-pre，以及下调的hsa-let-7-P2c2-3p。
3.2 miR-214与睾酮浓度的关联
在独立队列（围青春期男孩）中，研究人员发现：
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睾酮浓度高于10 nmol/L的个体，其循环miR-214-3p水平显著更高（p = 1.2e-06）。
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miR-214-3p水平与睾酮浓度呈微弱但显著的正相关（Spearman's R = 0.15, p = 0.0018），但与黄体生成素（LH）无显著关联。
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原位杂交实验证实，miR-214-3p在正常睾丸组织中表达，特别是在产生睾酮的间质细胞（Leydig cells）和多种生殖细胞中均有表达。
这些结果表明，更高的睾酮水平与升高的循环miR-214-3p相关联，且循环miR-214-3p水平可能反映了其在睾丸中的表达。
3.3 Sustanon对sncRNAs的长期效应
在第42天（此时循环激素水平已恢复至基线），研究人员发现Sustanon组仍有114个sncRNAs特异性上调，46个特异性下调。这表明即使睾酮浓度恢复正常，两次超生理剂量的注射仍可诱导持续的分子效应。
3.4 Sustanon使用的短期与长期联合效应
通过综合分析短期（第1天）和长期（第42天）效应，并排除安慰剂的影响，研究人员鉴定出43个Sustanon特异的sncRNAs。层次聚类分析揭示了四种不同的时间表达模式：持续下调、主要在42天上调、持续上调、以及仅在第一天上调。其中，核仁小RNA U3（snoRNA U3）是所有分析中共有的最持久的Sustanon特异性sncRNA，其在第1天显著上调。此外，piR-hsa-2699947在第1天上调后在第42天回落至基线，而Hsa-Mir-1180_3p则表现出从第1天到第42天持续下调的模式。
讨论与结论
讨论总结：本研究首次全面描绘了外源性睾酮（Sustanon）对循环sncRNAs谱系的急性和持续性影响。研究发现的多个响应sncRNAs与睾丸生物学功能紧密相关。例如，miR-214-3p的快速上调及其在间质细胞的表达，支持其作为睾酮作用的直接下游靶点。SnoRNA U3的持续变化提示睾酮可能影响了核糖体生物发生等基础细胞过程。同时，多种piRNAs的改变也印证了睾丸是主要的响应器官。尽管样本量较小是主要局限，但本研究结果揭示了雄激素在调节系统性RNA介导的细胞间通讯中扮演着比以往认知更广泛的角色。
结论翻译：短暂的超生理剂量睾酮暴露会在急性期及数周内重塑循环sncRNAs，这表明雄激素参与了全身性的基于RNA的通讯。数个响应的sncRNAs，特别是miR-214-3p和snoRNA U3，显示出作为雄激素滥用生物标志物的潜力。
