《Influenza and Other Respiratory Viruses》：Development and Validation of Serological Tests for Avian Influenza Antibodies in Meat Juice From Wild Birds
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背景：高致病性禽流感（HPAI）病例的全球增加和波动及其对野生鸟类和家禽的影响，凸显了血清学监测的重要性。血清是抗体检测的标准样本材料，但从野生鸟类获取血清具有挑战性。本研究评估了肉渗出液（肉汁）作为替代样本基质，利用商业ELISA试剂盒进行死后禽流感病毒（A
背景：高致病性禽流感（HPAI）病例的全球增加和波动及其对野生鸟类和家禽的影响，凸显了血清学监测的重要性。血清是抗体检测的标准样本材料，但从野生鸟类获取血清具有挑战性。本研究评估了肉渗出液（肉汁）作为替代样本基质，利用商业ELISA试剂盒进行死后禽流感病毒（AIV）抗体检测的可行性。方法：该方法利用新城疫病毒（NDV）和AIV疫苗免疫禽类的样本进行验证，比较了颈皮肤、胸肌、翅肌、心脏和心血中血清与肉汁的抗体检测结果。随后，从136只狩猎野生鸟类（包括绿头鸭 Anas platyrhynchos、雉鸡 Phasianus colchicus 和灰雁 Anser anser）采集颈皮肤肉汁，并筛查针对甲型流感核蛋白（NP）和血凝素（H5）的抗体。结果：在免疫禽类的肉汁中检测到针对NDV和AIV的抗体，其中颈皮肤中抗体水平较高。在25/137只野生鸟类中检测到针对AIV NP的抗体，包括23/75只绿头鸭和2/59只雉鸡。在10/75只绿头鸭中检测到H5抗体，而所有雉鸡和灰雁检测均为阴性。结论：肉汁是替代血清进行禽类野生动物死后AIV血清学的实用方法。该方法可促进野生鸟类AIV的更广泛流行病学研究，为了解鸟类种群中感染的动态和群体免疫随时间的变化提供见解。
**研究背景与问题**
禽流感病毒（AIV）属于正黏病毒科（Orthomyxoviridae）甲型流感病毒属（Alphainfluenzavirus），对野生和家禽种群构成持续威胁。自H5N1高致病性禽流感病毒（HPAIV）A/goose/Guangdong/1996出现以来，H5Nx分支（Gs/Gd lineage）已通过野生鸟类迁徙引发多波洲际传播，在欧洲野生动物中造成重大疫情暴发。2021年，分支2.3.4.4b H5N1成为欧洲优势HPAIV亚型，且流行病学特征发生显著变化——从季节性暴发转变为全年持续性流行。一个关键假设是野生鸟类群体免疫的发展可降低后续季节疫情的严重程度和数量，并可能影响向家禽传播的风险。然而，对野生鸟类群体免疫的了解仍然有限。传统血清学监测依赖采血，具有侵入性且操作困难，需要从活鸟获取新鲜血液以获得高质量血清。肉渗出液（肉汁）含有抗体，可能成为野生鸟类死后抗体检测的更实用替代方案。肉汁血清学已用于多种动物病原体抗体流行率调查，但据研究人员所知，肉汁用于禽类病毒抗体检测尚未见报道。本研究旨在评估不同禽类组织的肉汁作为血清替代品用于ELISA检测AIV抗体的可行性，并将该方法应用于丹麦野生鸟类的筛查。
**主要技术方法**
研究分为三个阶段：（1）利用NDV疫苗免疫的商业蛋鸡建立肉汁提取方案，比较颈皮肤、胸肌、翅肌、心脏和心血；（2）利用实验性H5 AIV疫苗免疫鸡和阴性对照进行方法优化及灵敏度和特异性评估，测试冻融法和PBS稀释法提取肉汁，并评估热灭活效果；（3）将优化方案应用于丹麦狩猎野生鸟类筛查。野生鸟类样本来自2024年12月13-15日狩猎周末在11个不同地点采集的137只鸟头（绿头鸭 n=75、雉鸡 n=59、灰雁 n=3），经丹麦狩猎野味屠宰场收集。抗体检测使用商业ELISA试剂盒，包括NDV间接ELISA、NDV NP间接ELISA、H5间接ELISA（FLUH5S）、H5抗体竞争ELISA（FLUACH5）和甲型流感抗体竞争ELISA（FLUACA）。
**研究结果**
**方法建立阶段结果**：NDV表面F蛋白抗体可通过冻融提取的肉汁在NDVS试验中检测到。心脏肉汁阳性率最高（20/20），其次为心血（19/20）、血清（19/20）、胸肌（19/20）、颈皮肤（12/13）和翅肌（18/20）。阳性样本中，心脏和颈皮肤抗体水平最高，胸肌和翅肌平均滴度较低但多数禽类仍呈阳性。NDV NP抗体也可在肉汁中检测到，血清检测率最高（17/20），其次为心血（16/20）、心脏（15/20）和颈皮肤（7/13），胸肌和翅肌滴度和检测率均较低。总体而言，肉汁中可检测到针对表面F蛋白和内部分NP蛋白的抗体；冻融法可从多数样本中成功提取肉汁，但颈皮肤仅在13/20只蛋鸡中提供足够肉汁用于检测；心脏、颈皮肤和心血产生最高阳性比例和抗体水平，与血清相当。
**方法优化与评估阶段结果**：使用冻融法检测H5特异性抗体，FLUH5S试验中血清4/5阳性、颈皮肤2/5阳性、胸肌0/5阳性、翅肌1/5阳性，血清和颈皮肤抗体滴度最高。使用PBS稀释法结合FLUH5S试验，免疫禽血清3/5阳性、颈皮肤2/4阳性、胸肌0/5阳性、翅肌0/5阳性，阴性对照全部阴性；热灭活后颈皮肤阳性降至1/4。使用FLUACH5竞争ELISA，免疫禽血清全部阳性（5/5），PBS稀释肉汁中颈皮肤4/4、胸肌5/5、翅肌5/5阳性，但阴性对照肉汁在多种基质（主要为胸肌）出现假阳性反应；热灭活后所有阴性对照转阴，消除了假阳性，免疫禽中颈皮肤2/2、翅肌4/5、胸肌2/5阳性。总体而言，肉汁检测性能取决于组织类型、提取方案和ELISA试验类型；颈皮肤在各组织中一致显示高抗体水平；冻融法提供最高抗体水平但PBS稀释法可从所有组织提取可测液体；热灭活降低S/N%值但消除假阳性；FLUACH5较FLUH5S识别更多阳性。
**野生鸟类筛查结果**：基于验证结果，选用颈皮肤、PBS稀释、热灭活和FLUACH5试验进行AIV H5筛查。共筛查137只野生鸟类（绿头鸭 n=75、雉鸡 n=59、灰雁 n=3），来自11个不同地点。NP抗体在25/137只野生鸟类中检测到，包括23/75只绿头鸭和2/59只雉鸡，阳性样本来自Stenstrup、Nyborg、Glamsbjerg、Rudk?bing、?rb?k、Gudme、Faaborg和Ringe。H5抗体在10/73只绿头鸭颈皮肤肉汁中检测到，雉鸡和灰雁均为阴性；因肉汁量不足，2只绿头鸭被排除出H5抗体筛查。血清阳性禽类来自多个采集地点，Rudk?bing阳性比例最高，其次为Nyborg、?rb?k和Faaborg。10只H5血清阳性绿头鸭中6只同时NP抗体阳性，25只NP血清阳性禽中6只H5抗体阳性。
**讨论与结论**
本研究证明禽类肉汁是利用商业ELISA试剂盒检测NDV和AIV特异性抗体的可行基质。优化方法为PBS稀释样本后热灭活。将该方法应用于野生鸟类，揭示了绿头鸭中针对H5和NP蛋白的AIV抗体以及雉鸡中针对NP的抗体，与以往在这些物种中检测到病毒的发现相吻合，支持该方法在野生鸟类血清监测中的适用性。心脏和颈部组织肉汁中抗体水平较高，胸肌和翅肌较低，与先前关于肉汁抗体组织特异性变异的研究一致，可能与组织血管化和残留血液含量差异有关。尽管冻融提取产生高抗体水平，但颈皮肤组织较干，不能一致提供足够提取物，这对野生动物样本应用至关重要；PBS稀释法可从所有样本中提取液体，结合热灭活代表了更可靠的常规监测方法。研究人员最初尝试从部分野生鸟类样本冻融提取肉汁但量不足，可能部分由于储存条件不理想（鸟头真空包装共享袋中冷冻后个体采样），首次冻融循环中肉汁释放后无法收集。PBS稀释法虽最初加入100 μL PBS，但野生鸟样本体积增至300 μL以补偿颈皮肤可回收肉汁有限，添加PBS可能稀释肉汁中抗体浓度从而降低ELISA灵敏度。调整ELISA预稀释步骤可部分补偿较低抗体浓度，但较低稀释度可能放大基质干扰。与先前研究一致，热处理消除了假阳性而不显著降低免疫禽样本检测，支持基质干扰影响试验特异性；热灭活后离心可提供足够液体上清用于ELISA检测。研究强调仅纳入有限数量实验性H5免疫禽，数据集不足以进行统计分析；部分禽类组织材料不足，无法重复检测或直接比较不同提取方法和试验性能。野生鸟类于2024年第四季度12月一个周末狩猎采集，该时期为丹麦H5 PCR阳性野生鸟类检出最多的时期。采集地点间血清阳性率存在变异，H5特异性抗体仅在绿头鸭中检测到，雉鸡和灰雁阴性，物种间差异可能与样本量小、生态或其他物种特异性因素影响暴露、易感性和AIV感染后存活有关。NP特异性抗体在更广泛亚群中检测到，可能反映NP蛋白含有所有AIV亚型共享表位，与野生鸟类暴露于多种不同亚型AIV一致。少数样本H5抗体可检测但NP抗体阴性，原因尚不完全清楚，可能与试验性能差异或针对不同病毒蛋白的抗体水平差异有关。在多个地点检测到肉汁中AIV H5和NP抗体支持该地区野生鸟类暴露于AIV，证明该方法适用于禽类野生动物监测。尽管结果令人鼓舞，仍需进一步研究优化方案并解决已识别的挑战。提高对野生鸟类抗体流行率的认识可有助于更好的风险评估、支持流行病学建模并促进HPAIV早期预警系统。该方法也可应用于其他野生动物和家畜的血清学监测，特别是在大型屠宰场，可改善监测并支持疫情早期检测和控制。
