《Pigment Cell & Melanoma Research》：Preclinical Models of Uveal Melanoma: Strengths, Limitations, and Translational Utility
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葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，其特征为高度倾向转移性播散，尤其是肝脏转移，而肝脏转移在很大程度上仍无法治愈。尽管在UM的分子特征研究方面取得了进展，治疗开发的进展仍然有限，部分原因是缺乏能够忠实再现该疾
葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，其特征为高度倾向转移性播散，尤其是肝脏转移，而肝脏转移在很大程度上仍无法治愈。尽管在UM的分子特征研究方面取得了进展，治疗开发的进展仍然有限，部分原因是缺乏能够忠实再现该疾病生物学复杂性和临床行为的临床前模型。目前已开发出多种体外和体内系统，包括原代培养和已建立的细胞系、三维（three-dimensional, 3D）培养、患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）、异种移植和基因工程动物模型。每种模型都捕捉UM生物学的特定方面，但也存在与遗传漂变、微环境背景、免疫相互作用和转移保真度相关的固有局限性。在本综述中，研究人员概述了当前用于研究UM的临床前模型，重点关注各系统的优势和局限性。研究人员还讨论了提高模型保真度和转化相关性的新兴策略。持续开发整合且生理相关的模型对于弥合UM发现与临床应用之间的差距至关重要。
1 Introduction
葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UM）是成人最常见的原发性眼内恶性肿瘤，起源于葡萄膜内的黑色素细胞，包括脉络膜、睫状体和虹膜。尽管原发肿瘤可通过放疗或眼内容剜除等局部治疗有效控制，但近50%的患者会发生转移性疾病，主要转移至肝脏，预后不良且治疗选择有限。GNAQ或GNA11的激活突变是UM的早期事件，而BAP1失活等继发性改变与转移风险相关。尽管基因组谱分析和风险分层不断进步，但在理解肿瘤进展、转移播散和治疗耐药机制方面仍存在重大缺口，且纵向人样本的有限可用性以及UM生物学相关背景下建模的难度进一步加剧了这些挑战。因此，临床前模型通过在受控条件下实现机制研究、生物标志物发现和治疗测试，在弥合这一缺口中发挥关键作用。然而，没有单一模型能全面再现人类UM的复杂性，特别是肿瘤异质性、微环境相互作用、免疫调节和肝脏特异性转移。目前大多数UM研究依赖已建立的癌细胞系，但长期体外培养可导致遗传漂变，使细胞系偏离原发肿瘤的分子特征。原代正常脉络膜黑色素细胞（normal choroidal melanocytes, NCMs）和携带致癌突变的“痣样”脉络膜黑色素细胞是研究早期转化的重要体系，但其分离和长期培养在技术上有困难。本综述讨论新兴的UM模型及其在临床前研究中的生物学和转化相关性。
2 UM Cell Models
体外UM模型可使用多种组织解离和培养策略从患者肿瘤组织建立，组织通常来自眼内容剜除、局部切除或细针穿刺活检，需立即处理以保持细胞活力。组织片段通过机械解离为单细胞悬液，可采用直接接种或基于细胞外基质（extracellular matrix, ECM）或成纤维细胞的饲养层。已建立的UM细胞系表现出显著的表型和遗传异质性，体外培养细胞呈现梭形、上皮样或混合形态，倍增时间（population doubling time, PDT）约为15-120小时。这些细胞系涵盖GNAQ、GNA11、SF3B1、EIF1AX和BAP1的多种突变以及染色体1、3、6和8的改变，提供了研究UM生物学和治疗反应的工具。值得注意的是，同一供体的原发（MEL270）和转移（OMM2.3和OMM2.5）细胞系为研究跨疾病阶段的肿瘤细胞行为提供了匹配体系。然而，细胞系的误鉴定和交叉污染可能损害其有效性，OCM1后被证实为M14皮肤黑色素瘤细胞系的衍生物即是例证。建立长期UM细胞系的成功率很低，MP38和MP65两株细胞系直接来源于73份患者标本中的原发肿瘤。尽管BAP1蛋白缺失和3号染色体单体历史上在常用细胞系中代表性不足，但这些例子表明BAP1缺陷细胞系可以建立，且生长缓慢说明高转移风险特征不一定赋予体外快速增殖能力。体外系统的另一局限是体外培养对快速生长或最适克隆的选择，Jager等对五种常用UM细胞系与原发肿瘤的系统比较发现基因型和表型存在显著差异。UM细胞通常以二维（two-dimensional, 2D）模式培养，操作简便且成本低，但单层培养不能充分再现组织和肿瘤的自然结构，也不提供与完整组织相同的生化与力学信号、组织结构和基质相互作用。三维（three-dimensional, 3D）培养包括球体（spheroids）和患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs），可恢复选定的空间结构和细胞间相互作用。UM球体可通过无附着条件或ECM包被表面建立，具有增殖外层、凋亡核心和缺氧梯度，药物反应与2D培养不同。肿瘤来源的PDOs保留源肿瘤的关键特征，Dalvin等建立的类器官生物库从44个原发肿瘤中成功生成40个（91%），保留了GNAQ、GNA11和BAP1改变及组织病理学和转录组特征。共培养系统用于研究肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）相互作用，包括与视网膜周细胞、内皮细胞、肝星状细胞和免疫细胞的共培养。
3 Premalignant Cell Model and Derivation of Isogenic Cell Lines
大多数UM起源于脉络膜黑色素细胞。NCMs参与光吸收、氧化稳态和炎症信号传导，为非恶性对照和早期转化研究提供了起点，但供体眼获取困难限制了其可用性。癌基因突变的痣样模型也是癌前模型，研究人员通过慢病毒转导将突变GNAQ引入NCMs以模拟UM发生的早期事件，但常规慢病毒转导引入的是突变转基因而非编辑内源位点。CRISPR/Cas9提供了靶向基因组编辑的补充方法。在引入致癌突变时需要平衡足够基因剂量与oncogene-induced senescence（OIS，癌基因诱导的衰老）的诱导，OIS是细胞肿瘤抑制机制，构成恶性转化的初始屏障。原代细胞的有限复制潜力限制了实验通量，Fuentes-Rodriguez等通过慢病毒表达CDK4R24C、细胞周期蛋白D1和人类端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase, hTERT）建立了NCM-K4DT永生化细胞系，并通过CRISPR/Cas9介导的敲入实现了GNAQ的定点整合。
4 Animal Models
UM动物模型支持肿瘤起始、生长、免疫和转移研究，包括自发、同种异体移植、异种移植、转基因和诱导模型。模型选择应与生物学问题和终点相匹配。
4.1 Spontaneous Models
自发性眼黑色素瘤在无实验性遗传修饰、移植或诱导剂暴露的情况下发生，已在犬、猫和啮齿动物中描述。这些模型允许研究免疫活性宿主中自然发生的疾病，但其稀有性、生长和播散的可变性以及疾病起始控制的缺乏限制了实验应用，其与人类UM的遗传和生物学相似性有待确立。
4.2 Syngeneic Transplant Models
同种异体移植模型将细胞或组织植入遗传匹配的宿主，无需免疫抑制治疗即可最小化免疫排斥。皮肤黑色素细胞系如B16LS9和HCmel12已植入C57BL/6小鼠，B16LS9尤其与肝转移建模相关。此类模型保留功能性免疫，适合评估免疫反应和治疗干预，以及研究肿瘤-免疫细胞相互作用。近期Xu等建立了来自GnaqQ209L/Bap1失活/Myc激活眼肿瘤的细胞系，可在免疫活性受者中异位生长，为同种异体研究提供了更具疾病相关性的基础。
4.3 Xenograft Models
异种移植模型涉及跨物种植入细胞或组织，人UM异种移植通常使用通过遗传性免疫缺陷、药理学免疫抑制或免疫不成熟允许植入的宿主。兔具有相对大的眼睛，便于眼内接种和多模式监测，但需要持续的免疫抑制，且非脉络膜来源的历史模型显示坏死和出血。优化的人UM兔模型支持长达20周的随访，循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ctDNA）水平与眼内肿瘤生长相关。啮齿类异种移植更具实用性，PDXs提供补充方法，某些PDX系列在传代中保留主要分子特征。脉络膜上腔NSG异种移植模型后接眼内容剜除，部分受体小鼠产生肝转移。斑马鱼提供脊椎动物活体成像平台，胚胎允许人细胞在适应性免疫成熟前植入，但宿主温度低和观察窗口短可影响肿瘤行为。鸡胚支持眼内移植和尿囊尿膜（chorioallantoic membrane, CAM）异种移植，尿囊尿膜囊提供可及、相对低成本的系统。
4.4 Transgenic Models
转基因模型通过基因工程重现特定疾病相关突变。RETAAD小鼠模型产生UM样病变，播散细胞数月内保持休眠状态。Grm1转基因小鼠显示脉络膜增厚、Melan-A和S100B高表达等UM病变特征。Huang等通过条件性Rosa26位点表达人GNAQQ209L，Moore等在四周龄Tyr-CreERT2下表达GNA11Q209L，不同诱导时间和靶向细胞群体产生不同表型。Xu等开发了互补模型，在成人小鼠脉络膜上腔局部递送慢病毒Cre，Gnaq激活单独产生脉络膜痣，联合CRISPR介导的Bap1失活增加痣发生率，添加稳定的Myc等位基因产生完全渗透的眼内肿瘤，部分小鼠肝脏检测到黑色素瘤标志物阳性细胞。这些模型支持致癌信号、协同改变和肿瘤-免疫相互作用研究，但在细胞类型特异性和转移行为上存在差异。斑马鱼模型中，Mouti等和Perez等表达人GNAQ转基因，Yevdash等使用脉络膜靶向质粒注射和电穿孔将GNAQQ209L与体细胞CRISPR/Cas9结合。
4.5 Induced Models
诱导模型研究使用外部暴露检查眼黑色素细胞病变的诱导和已建立肿瘤行为的变化。早期猫模型使用猫肉瘤病毒接种新生kitten，7,12-二甲基苯并[a]蒽与巴豆油联合应用产生痣到非典型增殖的病损。蓝光暴露增加92.1异种移植肿瘤中PCNA表达和再培养细胞的增殖能力。这些模型可检验特定暴露相关假设，但其对UM的相关性取决于诱导剂、宿主和测量终点。
5 Emerging Technologies
新兴方法包括三维生物打印和精密肿瘤切片培养（precision-cut tumor slice cultures, PCTS）。生物打印结合细胞与生物材料基质控制空间排列，支持细胞间和细胞-基质相互作用，但存在血管化不完全、基质性质改变、打印相关细胞损伤等局限。PCTS从新鲜肿瘤组织制备薄切片并体外维持，保留天然组织结构的选定方面，支持短期治疗研究，但存在组织可用性、采样异质性、制备相关损伤和活力逐渐丧失等局限。培养持续时间取决于组织类型和条件。
6 Conclusion
临床前模型对推进UM病理生物学理解和支持诊断与治疗开发不可或缺，但每个系统仅捕捉疾病复杂性的一个子集，模型选择应针对特定科学问题。体外模型提供可及性和机制控制但受遗传漂变和微环境复杂性缺乏限制。球体、PDOs和共培养恢复了选定的肿瘤架构和基质/免疫相互作用。患者来源和体内模型保留了选定的肿瘤异质性和结构，但受可扩展性、免疫兼容性和转移性进展不完全复制的限制。未来的关键挑战不是识别单一“最优”模型，而是战略性地整合互补系统，包括人源化和免疫活性平台、改进的转移模型，以及结合CRISPR的高风险UM基因型建模与定义的基质和免疫成分的高级工程系统。跨互补模型的验证将有助于明确各系统再现UM进展的哪些方面。
