磷酸化可以保护致癌RAS蛋白免受LZTR1介导的降解作用

《Blood Cancer Discovery》：Phosphorylation Protects Oncogenic RAS from LZTR1-Mediated Degradation

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**摘要**

致癌性的KRAS和NRAS突变在血液系统恶性肿瘤中非常常见，但它们在这种环境下的信号通路作用仍不如在癌变组织中那么清楚。通过在多发性骨髓瘤中进行多组学筛选，我们试图识别调控RAS活性的因子。我们发现磷酸酶PP1C能够去磷酸化RAS的保守残基T148，从而允许LZTR1依赖的蛋白酶体降解机制发挥作用。然而，LZTR1对KRAS A146的获得性功能突变无效，因为这些突变位于T148附近，并且在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和急性髓系白血病（AML）等血液系统癌症中较为常见。值得注意的是，血液系统细胞中的KRAS蛋白稳定性比癌变细胞低4倍，这揭示了一个针对RAS蛋白稳定性的独特治疗机会。PAK1和PAK2通过磷酸化T148来保护RAS免受LZTR1依赖的降解，抑制PAK1/2的活性可以改善以RAS为靶点的治疗效果。总体而言，这些发现揭示了一个主要在血液系统癌症中活跃的调控RAS稳定性的通路，并且有可能成为药物调控的目标。

**重要性：**我们发现PP1C和PAK1/2调控RAS的T148位点磷酸化，从而控制LZTR1介导的RAS降解过程，这一过程在多发性骨髓瘤、DLBCL和AML中都有体现。抑制PAK1/2可以降低RAS的表达，从而提高以RAS为靶点的治疗效果。值得注意的是，在血液系统癌症中普遍存在的KRAS A146突变能够保护RAS免受这种降解。

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**引言**

RAS小GTP酶家族（包括KRAS、NRAS和HRAS）在30%的人类癌症中发生突变（1）。虽然它们主要与胰腺癌、结肠癌和肺癌的发病机制相关，但RAS突变也是许多血液系统恶性肿瘤的关键驱动因素。特别是，KRAS或NRAS的致癌性突变是多发性骨髓瘤的典型特征。多发性骨髓瘤是一种无法治愈的浆细胞肿瘤，美国每年新增病例超过36,000例（seer.cancer.gov）。大约40%的新诊断多发性骨髓瘤肿瘤携带RAS突变，而在复发和难治性病例中这一比例上升到50%到70%（2, 3）。研究表明，RAS突变与疾病侵袭性和预后不良相关，尽管这种影响的程度因研究而异（4–11）。致癌性RAS能够激活多种信号通路（12）。经典的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路，由RAF–MEK–ERK组成，被认为是癌变的主要驱动因素，因为它能促进一系列致癌转录程序（13）。该信号级联反应由RAS、适配器SHOC2和丝氨酸/苏氨酸磷酸酶PP1C组成的复合体启动（14–17），后者会去磷酸化RAF上的自抑制位点（BRAF S365；参考文献18）。此外，突变的RAS还能直接激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K；参考文献19），这种活性可能是致癌性RAS的独特特征（20）。然而，我们之前的研究表明，多发性骨髓瘤中的RAS信号通路与癌变组织中的经典信号通路存在质的不同，这表明RAS依赖的转化具有情境依赖性。我们发现，多发性骨髓瘤中的病理RAS信号通路利用了恶性浆细胞对游离氨基酸的依赖性，通过持续激活溶酶体表面的mTORC1信号通路来实现其功能（21）。鉴于RAS在多发性骨髓瘤中同时激活了两种强效的致癌通路，并且KRAS和NRAS突变在侵袭性和难治性病例中高度頻发，有效靶向RAS信号通路可能为那些对现有疗法无效的患者提供潜在的治疗途径。直接靶向KRAS和NRAS的活性仍然极具挑战性，而且实体瘤对已批准的KRAS抑制剂很快就会产生耐药性（22, 23）。更好地理解血液系统癌症中的RAS生物学特性将有助于寻找新的方法来干扰RAS信号通路。在这项研究中，我们进行了多组学筛选，以发现多发性骨髓瘤中RAS蛋白稳定性的新调控因子。这些筛选和后续实验揭示了多发性骨髓瘤及其他血液系统癌症（包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）和急性髓系白血病（AML）中特异的致癌性RAS信号通路机制，这些机制的核心是依赖于磷酸化作用的LZTR1介导的突变RAS异构体的降解。

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**结果**

**多组学筛选确定PPP1R2和PP1C是RAS蛋白稳定性的调控因子**

为了识别致癌性RAS的新调控因子，我们开发了一种基于CRISPR的筛选方法，以突变的KRASG12D蛋白表达作为检测终点（图1A；补充图S1A）。我们使用依赖KRAS的XG7和RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞系作为血液系统恶性肿瘤中RAS信号通路的模型系统。这些细胞被设计为异位表达mNeonGreen（mNG）-KRASG12D–内部核糖体进入位点（IRES）–Lyt2（鼠Cd8a）构建体，通过IRES按化学计量比表达mNG-KRASG12D和Lyt2蛋白。在用Brunello单导向RNA（sgRNA）文库转导并诱导Cas9表达后，将细胞分为mNG-KRASG12D高表达和低表达的两个亚群。由于mNG-KRASG12D和Lyt2的表达是相互关联的，我们根据mNG-KRASG12D相对于Lyt2的表达水平对细胞进行分类，以控制构建体本身的表达差异（图1A）。我们计算了一个“KRAS稳定性评分”，定义为mNG-KRASG12D高表达亚群和低表达亚群之间每个基因的sgRNA相对丰度对数的z分数（FC）。三个独立实验（XG7中的两个和RPMI 8226中的一个）的数据被用来生成KRAS稳定性评分，并附有相应的P值（图1B；补充表S1）。筛选结果识别出50个可能与RAS表达降低相关的基因（KRAS稳定性评分≤ ?0.8，P ≤ 0.05），其中包括KRAS本身的敲除实验，从而验证了筛选方法的有效性。

**CRISPR筛选揭示PPP1R2和PP1C控制RAS蛋白稳定性**
A. CRISPR筛选策略用于识别人类多发性骨髓瘤细胞系中RAS蛋白稳定性的调控因子。
B. 平均KRAS稳定性评分的火山图（n = 3个生物学重复实验）。显著降低（粉红色）或增加（紫色）KRASG12D表达的基因被标出。注释表示通过MS（21）鉴定为与RAS相互作用的朋友的基因。
C. 从KRAS稳定性筛选（KRAS稳定性评分≤ ?0.8，P ≤ 0.05）、RAS BioID2蛋白质组学研究（相对于对照组富集度≥1 log2；参考文献21）以及多发性骨髓瘤细胞系（XG7, RPMI 8226；CSS ≤ ?1；参考文献25）中必需的基因所重叠的基因的维恩图。
D. 在XG7、RPMI 8226和MM.1S多发性骨髓瘤细胞系中，转导对照组shRNA（shCTRL）或靶向PPP1R2的shRNA后3天，对RAS、PPP1R2和GAPDH进行Western blot分析，n = 3个生物学重复实验。
E. 在RPMI 8226细胞中，转导shCTRL后3天，PPP1R2-BioID2相对于空载体的富集情况。
F. 在XG7、RPMI 8226和MM.1S多发性骨髓瘤细胞系中，转导shCTRL、shPPP1R2.1和/或异位表达DN PP1C后3天，对RAS、PPP1R2和GAPDH进行Western blot分析，n = 3个生物学重复实验。
G. 在115例多发性骨髓瘤患者的肿瘤中，比较RAS（x轴）和平均PP1C（PPP1CA、PPP1CB、PPP1CC和PPP1CC；PPP1CB；y轴）的蛋白表达水平（26）。线条表示简单线性回归拟合；R2 = 0.1593，****，P < 0.0001。
H. PPP1R2和PP1C调控RAS蛋白表达的模型。在正常情况下，PPP1R2抑制PP1C活性；PPP1R2被破坏后，PP1C活性增加会降低RAS水平；反之，PP1C被破坏则会增加RAS表达。

**进一步研究**
这50个基因因在蛋白质组学实验中邻近突变RAS的蛋白质（相对于对照组富集度≥1 log2；参考文献21）以及在RAS依赖的多发性骨髓瘤细胞系中必需的基因（KRAS稳定性评分≤ ?1；参考文献25）而被优先考虑进一步研究。这一分析显示PPP1R2和KRAS是RAS表达的调控因子（图1C）。在敲低PPP1R2后的Western blot分析证实，其缺失显著降低了KRAS依赖的多发性骨髓瘤细胞系XG7、RPMI 8226和MM.1S中的RAS蛋白表达（图1D），在这些细胞系中突变的KRAS是主要表达的RAS异构体（21）。PPP1R2是丝氨酸/苏氨酸磷酸酶催化亚单位PP1C的调控因子（28）。PP1C调控多种细胞过程，包括细胞代谢和分裂（29–31）。值得注意的是，PP1C通过SHOC2与RAS家族蛋白结合，通过去磷酸化RAF激酶上的自抑制位点来增强下游MAP激酶信号通路（18）。我们确认SHOC2的敲降会减少PPP1R2与KRASG12D的共免疫沉淀（co-IP）（补充图S1B）。为了表征PPP1R2在多发性骨髓瘤中的功能，我们用通用生物素连接酶BioID2标记PPP1R2，并通过质谱（MS）鉴定了距离PPP1R2 10到30纳米范围内的蛋白质。正如预期的那样，PPP1R2在XG7和RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞系中与所有PP1C亚型（PPP1CA、PPP1CB和PPP1CC）紧密相关（图1E；补充图S1C；补充表S2）。尽管在这些PPP1R2 BioID2实验中没有观察到KRAS，但我们之前发现PPP1R2和所有三种PP1C亚型在多发性骨髓瘤细胞中的PP1R2 BioID2实验中都富集（补充图S1C；参考文献21）。在我们的CRISPR KRAS蛋白稳定性筛选中，PP1C基因没有显著被选中（补充表S1），可能是因为单个亚型的缺失被其他PP1C亚型所补偿。根据不同的研究背景，PPP1R2有时被描述为PP1C活性的正调节因子，有时为负调节因子（28）。为了直接检测PP1C的活性，我们在依赖KRAS的多发性骨髓瘤细胞系XG7和RPMI 8226中表达了dominant-negative（DN）版本的PP1C（PPP1CAD95N；参考文献33）。我们发现DN PP1C显著增强了RAS的表达（补充图S1D），这表明PPP1R2在这种环境中充当PP1C活性的抑制剂。同时敲降PPP1R2并异位表达DN PP1C会增加RAS表达，从而抵消了PPP1R2敲降的效果，证明PPP1R2通过调节PP1C来调控RAS蛋白稳定性（图1F）。与此一致的是，我们在多发性骨髓瘤患者的原发肿瘤中通过MS测量发现，总PP1C蛋白水平与RAS蛋白表达呈负相关（图1G；P < 0.0001；参考文献26）。这些数据支持了一个模型，即PP1C活性干扰RAS表达，而PPP1R2作为PP1C的负调节因子（图1H）。

**PP1C调控RAS在T148位的磷酸化**
鉴于PP1C是一种已知的与RAS异构体密切相关的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶（14–16），我们假设PP1C可能调控RAS的磷酸化。先前有报道称RAS在多个位点被磷酸化，其中一些位点可以调节其活性和稳定性（34）。为了识别控制多发性骨髓瘤中RAS稳定性的潜在丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点，我们基于先前确定的磷酸化位点，在mNG-KRASG12D-IRES-Lyt2骨架上生成了八个S/T到A的突变体（图2A；参考文献35）。利用这些构建体，我们对mNG-KRAS表达水平相似的多发性骨髓瘤细胞系进行了FACS分析（通过Lyt2表面染色判断；补充图S2A）。在八个位点中，破坏T148位点始终降低了mNG-KRASG12D的蛋白表达，这通过FACS（图2B和C）或Western blot（补充图S2B）得到证实。我们发现，在不同的表达水平下，mNG-KRASG12D+T148A的表达相对于mNG-KRASG12D的表达水平较低，这是通过相对Lyt2的表达来衡量的（补充图S2C）。值得注意的是，KRASG12D+T148A的表达无法有效激活下游的RAS信号通路，这一点通过MEK和4EBP1的磷酸化水平得以验证（见补充图S2D和S2E）。图2。

PP1C能够使KRAS的T148位点去磷酸化。A部分展示了KRAS致癌热点突变的位置以及潜在的丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点；B部分展示了在XG7、RPMI 8226和MM.1S多发性骨髓瘤细胞中，含有指定S/T到A突变的mNG-KRASG12D构建体的代表性FACS数据（n = 3个生物学重复实验）；C部分显示了平均标准化后的mNG-KRASG12D磷酸化突变体FACS数据，误差条表示标准差，****表示P < 0.0001；*表示P < 0.01（单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验）；D部分对表达指定mNG-KRAS突变的XG7细胞中的mNG-KRAS、PP1C和GAPDH进行了Western blot分析，并同时加入了空载体（?）或DN PP1C（+）作为对照（n = 3个生物学重复实验）；E部分通过使用从XG7细胞中免疫沉淀的mNG-KRASG12D中的抗-phospho-T148-RAS信号来检测重组PPP1CA的体外磷酸酶活性（n = 4个生物学重复实验）；F部分构建了一个模型来说明PP1C如何直接使KRAS的T148位点去磷酸化；G部分比较了KRASG12D+T148A（x轴）与KRASG12D+T148D（y轴）BioID2构建体的富集情况；H部分展示了在XG7细胞中RAS与下游效应因子相互作用的代表性图像（红色表示PLA结果），其中蓝色为4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），绿色为小麦胚芽凝集素，刻度尺为10 μm；I部分表示相对于空载体条件的PLA评分结果，****表示P < 0.0001（单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验），n = 3个生物学重复实验。

为了探讨PP1C是否调节T148位点的磷酸化，我们在表达八个KRASG12D磷酸化突变体的细胞中表达了DN PP1C。结果表明，带有T148A突变的KRASG12D的表达水平并未因DN PP1C的表达而增加，而其他七个磷酸化突变体及KRASG12D对照组的KRAS表达水平均有所上升（见图2D）。同样，PPP1R2的敲低并未进一步降低KRASG12D+T148A的表达，而所有其他KRASG12D磷酸化突变体的表达水平都降低了（见补充图S2F）。此外，与CRISPR介导的内源性突变KRAS敲除相比，KRASG12D+T148A未能有效恢复XG7细胞的存活能力（见补充图S2G）。我们还生成了T148D的磷酸化模拟突变体，以模拟持续的KRAS T148位点磷酸化状态。KRASG12D+T148D的表达水平高于KRASG12D，并且其表达不受DN PP1C过表达或PPP1R2敲低的影响（见补充图S2H和S2I）。这些数据证实了PPP1R2和PP1C确实调节了KRAS在T148位点的磷酸化。接下来，我们开发了一种特异性磷酸化抗体来直接检测内源性T148位点的磷酸化情况（见补充图S2J）。在依赖KRAS的XG7、RPMI 8226和MM.1S细胞中，DN PP1C的表达导致KRAS T148位点磷酸化水平升高（见补充图S2K和S2L），从而证明了PP1C调控了内源性突变KRAS的磷酸化。为了确定PP1C是否直接去磷酸化KRAS，我们进行了体外磷酸酶实验。将表达mNG-KRASG12D的XG7细胞裂解并煮沸以破坏蛋白质-蛋白质相互作用，随后用抗-mNG beads免疫沉淀KRASG12D，并与重组的HIS标记的PPP1CA共孵育1小时。使用抗-phospho-T148-RAS进行Western blot分析，结果显示PP1C确实直接去磷酸化了KRAS的T148位点（见图2E和F）。为了评估KRAS T148位点磷酸化的功能影响，我们克隆了带有T148A和T148D突变的BioID2标记版本的KRASG12D，并通过MS比较了未磷酸化和磷酸化KRASG12D模型的相互作用伴侣。结果显示，KRASG12D+T148D的表达水平显著高于KRASG12D+T148A，并且与多种多发性骨髓瘤中的已知KRAS信号因子（如RAF1、RALA和SLC3A2）的结合程度更高（见图2G；补充表S3；参考文献21）。我们还进行了邻近连接实验（PLA），证实了表达的KRAS磷酸化突变体与下游效应因子MEK、MTOR和SLC3A2之间的蛋白质-蛋白质相互作用。PLA是一种基于抗体的方法，能够检测约40纳米范围内的蛋白质-蛋白质相互作用，并以红色荧光点显示（36）。结果显示，KRASG12D+T148A与这些关键信号因子的结合程度显著低于KRASG12D或KRASG12D+T148D（见图2H和I）。

由于PPP1R2/PP1C通过T148位点的磷酸化来调节KRAS蛋白表达，我们推测该位点也可能控制KRAS的泛素化及随后的蛋白酶体降解。与此一致的是，使用MG-132抑制蛋白酶体降解能够增加KRASG12D+T148A的蛋白表达（见补充图S3A）。因此，我们直接检测了在XG7和RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞中表达的KRASG12D及其T148A和T148D磷酸化突变体的泛素化状态。与KRASG12D相比，不可被磷酸化的KRASG12D+T148A具有更高的泛素结合能力，而模拟磷酸化的KRASG12D+T148D则表现出较低的泛素结合能力（见图3A）。同样，调节PPP1R2和PP1C的表达及活性也会改变KRAS的泛素化状态（见补充图S3B和S3C），证实了T148位点的磷酸化可以防止RAS的降解（见图3）。

T148位点的磷酸化能够保护KRAS免受LZTR1介导的降解。A部分通过IP-Western blot分析了外源性表达的KRAS构建体上的泛素结合情况（n = 3个生物学重复实验）；B部分展示了图1A和B中KRAS稳定性筛选中与泛素相关的基因的散点图；C部分通过Venn图展示了泛素相关基因（KRAS表达增加，P ≤ 0.05）、BioID2研究中发现的KRAS相互作用伙伴（富集度≥1 log2倍；参考文献21）以及在依赖RAS的多发性骨髓瘤细胞系（XG7、RPMI8226；CSS ≥ 0.5；参考文献25）中鉴定出的肿瘤抑制基因；D部分比较了依赖RAS的（粉色）与不依赖RAS的（灰色）多发性骨髓瘤细胞系中LZTR1的CSS（25）；E部分在XG7、RPMI 8226和MM.1S多发性骨髓瘤细胞中表达shCTRL或2个针对LZTR1的shRNA后，对RAS、LZTR1和GAPDH进行了Western blot分析（n = 3个生物学重复实验）；F部分展示了LZTR1的基本相互作用网络，将RPMI 8226和XG7的平均CSS（x轴）与相同细胞系中LZTR1-BioID2实验中蛋白质的平均富集度（y轴）进行了对比；粉色阴影表示富集度≥1 log2倍且CSS ≤ ?1的蛋白质；紫色表示文中讨论的蛋白质；G部分在XG7、RPMI 8226和MM.1S多发性骨髓瘤细胞中，对指定的KRASG12D磷酸化突变体与LZTR1进行了共免疫沉淀（co-IP）；H部分展示了在表达指定KRAS突变体的XG7细胞中RAS与LZTR1相互作用的代表性图像（红色表示PLA结果），其中蓝色为4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI），绿色为小麦胚芽凝集素，刻度尺为10 μm；I部分表示相对于空载体条件的LZTR1-RAS评分结果，****表示P < 0.0001；*表示P < 0.01（单因素方差分析后进行Tukey多重比较检验），n = 3个生物学重复实验；J部分在转染对照组、PPP1R2和/或LZTR1 shRNA后，对RAS、pT148-RAS、PPP1R2、LZTR1和GAPDH进行了Western blot分析；K部分通过FACS比较了在shLZTR1处理细胞与shCTRL处理细胞中mNG-KRAS的K到R突变引起的mNG-KRAS表达相对变化；L部分在转染了KRAS G12D、T148A、T148D、K147R或K147R + T148A突变的细胞中，对泛素结合情况进行了免疫印迹分析（n = 2个生物学重复实验）。

接下来，我们试图确定负责T148依赖性KRAS泛素化的潜在泛素连接酶。我们聚焦在稳定性筛选中显著增加KRAS表达的泛素相关基因（图3B），并将这些基因与KRAS相互作用伙伴（富集度≥1 log2倍；参考文献21）以及依赖RAS的多发性骨髓瘤细胞系中的肿瘤抑制基因（CSS ≥ 0.5；参考文献25）进行比较，最终确定了LZTR1（见图3C）。LZTR1是一种E3泛素连接酶，先前有研究指出它能够促进KRAS的降解（参考文献38, 39），同时也能与RAS相关蛋白（如RIT1）共同作用（参考文献40）。因此，在依赖RAS的多发性骨髓瘤细胞系中，LZTR1的敲除会抑制KRAS的降解（见图3D），而在不依赖RAS和NRAS的多发性骨髓瘤细胞系中则不会（见图3D），并且LZTR1的敲低通过减少KRAS的K48连接泛素化来增加KRAS蛋白的表达（见补充图S3D）。此外，在用环己酰胺处理的XG7和MM.1S细胞中，LZTR1的敲低显著延长了KRAS蛋白的半衰期（见补充图S3E和S3F）。为了进一步了解LZTR1在多发性骨髓瘤细胞中的功能，我们在依赖RAS的RPMI 8226和XG7细胞中外源表达了LZTR1-BioID2构建体。观察到LZTR1与CUL3、多种蛋白酶体亚基（PSMC1、PSMD2、PSMD7、PSMD6和PSMC3）以及COP9信号复合体（COPS2、COPS6、COPS5和COPS8）之间存在强烈相互作用，这与其作为CUL3–RBX1 E3泛素连接酶复合体适配器的功能相符（见图3F；补充表S4）。基因本体学分析显示，与LZTR1相关的蛋白质（富集度≥1 log2倍）主要参与细胞器的富集和囊泡介导的运输（见补充图S3G）。此外，我们发现LZTR1既与KRAS蛋白结合，也与PPP1R2蛋白结合，但与PP1C家族成员的结合程度较低，这表明LZTR1可能参与依赖于磷酸化的KRAS调控。确实，LZTR1通过共免疫沉淀（co-IP，见图3G）和PLA（见图3H和I）优先与KRASG12D+T148A磷酸化突变体结合，这表明KRAS T148位点的磷酸化调控了LZTR1介导的降解。接下来，我们在依赖RAS的XG7和RPMI 8226多发性骨髓瘤细胞中敲低了PPP1R2和LZTR1的表达。PPP1R2的敲低增加了PP1C的活性，从而降低了总KRAS和磷酸化KRAS的水平，而LZTR1的敲低则提高了总KRAS和磷酸化KRAS的水平（见图3J）。同时敲低LZTR1和PPP1R2不仅增加了总KRAS的水平，还增加了磷酸化KRAS的水平，这表明PPP1R2依赖性的KRAS表达丢失是由LZTR1介导的。为了了解LZTR1如何调控多发性骨髓瘤中的KRAS稳定性，我们将mNG-KRASG12D上的赖氨酸残基突变为精氨酸，以阻止泛素化同时保持其正电荷（见补充图S3H）。表达构建体是在XG7细胞中实现的，通过FACS分析监测了LZTR1敲低后KRAS蛋白的稳定性（图3K）。在我们测试的15个赖氨酸残基中，只有KRAS的K5和K147突变使得KRAS表达对LZTR1敲低不敏感。值得注意的是，K147位于KRAS的T148磷酸化位点附近。因此，我们检查了携带K147R和T148A突变的异源表达的KRASG12D突变体上的泛素结合情况（图3L）。与之前一样，KRASG12D+T148A的泛素结合显著多于单独的KRASG12D，而KRASG12D+T148D的泛素结合减少。有趣的是，KRASG12D+K147R的泛素结合量比KRASG12D少，进一步添加T148A也未增加泛素结合，这表明T148的磷酸化控制了K147的泛素化。已经解出了LZTR1与GDP-KRAS结合的晶体结构（42）。使用AlphaFold（44）对带有T148磷酸化突变的GDP结合KRASG12D与LZTR1和CUL3进行建模（43），证实了T148的负电荷破坏了LZTR1在KRAS的K147（黄色）附近的结合（补充图S3I）。综合这些数据，我们支持一个模型，即PP1C/PPP1R2依赖的KRAS T148磷酸化调节保护KRAS免受LZTR1介导的K147泛素化（补充图S3J）。

尽管我们发现K147可以负调控KRAS表达，但在多发性骨髓瘤研究基金会（MMRF）的CoMMpass研究中通过全外显子测序（WES）分析的多个骨髓瘤肿瘤中并未报告KRAS K147突变（45）。然而，位于A146位置的致癌热点突变很常见。KRAS A146突变（A146T、A146V和A146P）会破坏鸟苷核苷酸的结合，从而促进GDP与GTP的交换（46），并在多发性骨髓瘤以及包括慢性髓系白血病、胶质母细胞瘤（GBM）、急性淋巴细胞白血病（ALL）和AML在内的几种其他癌症中发现（图4A；参考文献1）。图4。查看大图下载幻灯片。A146突变保护KRAS免受LZTR1介导的降解：A，不同肿瘤类型中KRAS A146突变所占百分比的条形图。血液系统恶性肿瘤以粉色突出显示。数据来自Prior及其同事（1）。B和C，使用对照或PPP1R2 shRNAs（B）或指示的外源表达的KRAS突变体（C）转染后，对RAS、PPP1R2和GAPDH进行Western blot分析，n = 3个生物学重复实验。D，在XG7和AMO1多发性骨髓瘤细胞中，对指示的KRAS突变体与PPP1R2或PP1C进行共免疫沉淀（co-IP），n = 3个生物学重复实验。E，在XG7、RPMI 8226、AMO1和H1112多发性骨髓瘤细胞中，对内源性RAS的pT148磷酸化进行Western blot分析，n = 3个生物学重复实验。F，在携带G12D、A146T或A146V的H1112细胞中，通过mNG-KRAS pulldown后进行泛素结合的Western blot分析，n = 3个生物学重复实验。G，对指示的多发性骨髓瘤细胞在10 nmol/L环己酰胺（CHX）处理不同时间点后的RAS表达进行免疫印迹定量，并归一化到GAPDH，n = 2个生物学重复实验；误差条表示标准差；代表性印迹见补充图S4G。H，在XG7、AMO1和H1112细胞中，使用对照或LZTR1 shRNAs转染后，对RAS、LZTR1和GAPDH进行Western blot分析，n = 3个生物学重复实验。I，在10 nmol/L CHX处理不同时间点后，对指示的细胞系中的RAS表达进行免疫印迹定量，并归一化到GAPDH [蓝色，结肠腺癌（COAD）；黑色，胰腺腺癌（PAAD）；橙色，生发中心B细胞样弥漫大B细胞淋巴瘤（GCB DLBCL）；红色，急性髓系白血病（AML）]，n = 2个生物学重复实验；误差条表示标准差；代表性印迹见补充图S4G。J，点图显示指示细胞系中RAS的半衰期（粉色，多发性骨髓瘤；紫色空心圆，多发性骨髓瘤KRAS A146；蓝色，COAD；黑色，PAAD；橙色，GCB DLBCL；红色，AML）。K，点图显示在表达对照或LZTR1靶向shRNA后，不同多发性骨髓瘤细胞系（粉色；左）或腺癌细胞系（蓝色，COAD；黑色，PAAD；绿色，LUAD）中10 nmol/L CHX处理后的RAS半衰期，n = 2个生物学重复实验。L和M，在指示的腺癌细胞系（L）和GCB DLBCL细胞系（M）中，使用对照shRNA或LZTR1 shRNAs转染后进行RAS表达的免疫印迹分析，n = 3个生物学重复实验。BLCA，膀胱尿路上皮癌；BRCA，乳腺癌；CESC，宫颈鳞状细胞癌和子宫内膜腺癌；CML，慢性髓系白血病；ESCA，食管癌；HNSC，头颈部鳞状细胞癌；KIRC，肾透明细胞癌；LGG，脑低级别胶质瘤；LIHC，肝细胞癌；LUSC，肺鳞状细胞癌；OV，卵巢浆液性囊腺癌；PRAD，前列腺腺癌；READ，直肠腺癌；SIAD，小肠腺癌；SKCM，皮肤黑色素瘤；STAD，胃癌；THCA，甲状腺癌；THCAA，乳头状甲状腺癌。图4。查看大图下载幻灯片。考虑到A146残基与K147和T148相邻，我们假设KRAS A146突变可能除了促进GTP交换外，还能抵抗PPP1R2/PP1C/LZTR1介导的降解。为了验证这一点，我们使用了分别内源表达KRASA146T和KRASA146V的AMO1和H1112多发性骨髓瘤细胞。PPP1R2敲低或DN PP1C表达对这些细胞中的RAS表达没有影响（图4B；补充图S4A）。为了排除细胞内在因素，我们在AMO1和H1112细胞中稳定表达了KRASG12D、KRASA146T或KRASA146V。PPP1R2敲低（图4C）或DN PP1C表达（补充图S4B）仅影响KRASG12D的表达，表明KRAS A146突变对PPP1R2/PP1C的调节不敏感。相应地，我们在XG7或AMO1多发性骨髓瘤细胞中观察到PPP1R2和PP1C与KRASG12D的共免疫沉淀，但未观察到与KRASA146T和KRASA146V的共免疫沉淀（图4D）。这表明PP1C不能有效地结合，因此无法使携带A146突变的KRAS去磷酸化。在首次确认抗pT148 KRAS抗体可以特异性检测到KRASA146T上的T148磷酸化后（补充图S4C），我们发现携带KRAS A146突变 的AMO1和H1112多发性骨髓瘤细胞的KRAS T148磷酸化水平高于携带KRAS G12突变的XG7和RPMI 8226细胞（图4E）。我们的结果表明，KRAS A146突变赋予了对LZTR1介导的泛素化和降解的抵抗。值得注意的是，携带KRAS A146突变的多发性骨髓瘤患者的LZTR1转录本水平显著高于携带其他致癌KRAS或NRAS突变的患者，这支持了这些突变尽管表达升高但仍对LZTR1介导的降解不敏感的观点。相应地，我们发现在H1112细胞中异源表达KRASA146T和KRASA146V比KRASG12D的泛素化程度更低（图4F）。相应地，我们观察到携带KRAS A146突变的AMO1和H1112细胞中的RAS蛋白稳定性高于XG7、RPMI 8226和MM.1S细胞表达KRAS G12突变的情况（图4G）。这些数据表明LZTR1对携带A146突变的KRAS可能作用较弱，并且我们发现LZTR1敲低对AMO1和H1112多发性骨髓瘤细胞中的KRAS表达水平没有影响（图4H）。然而，在表达KRASG12D的对照XG7细胞中，LZTR1敲低后内源性RAS水平升高（图4H）。在mNG-KRASA146T骨架上添加K147R和T148A/D突变并未进一步改变KRAS蛋白表达（补充图S4D）。总体而言，这些数据表明A146突变赋予了对LZTR1介导的降解的抵抗，这与它们促进GTP结合的致癌机制不同。有趣的是，DepMap CRISPR依赖性数据库的数据表明，LZTR1在KRAS依赖的多发性骨髓瘤中更倾向于作为肿瘤抑制因子，而在KRAS驱动的腺癌中则不然（补充图S4E；参考文献47）。我们还发现肿瘤类型中A146突变的频率与LZTR1的肿瘤抑制效应的大小之间存在显著相关性（R2 = 0.6612；P < 0.0001）（补充图S4F）。多发性骨髓瘤和GBM具有最高的KRAS A146突变频率和最强的LZTR1肿瘤抑制效应。相反，大多数腺癌，如结肠（COAD）和胰腺腺癌（PAAD），A146突变的频率较低，在DepMap CRISPR数据中对LZTR1敲除无反应。这些数据表明LZTR1可能并不像在多发性骨髓瘤中那样在许多腺癌中调节KRAS表达，这与报道的KRASG12C在上皮肿瘤系中的长半衰期（约22小时；参考文献48）一致。上述研究表明，携带G12位点突变的多发性骨髓瘤细胞的半衰期显著较短，约为3至4小时。为了更好地比较不同肿瘤类型中的KRAS蛋白稳定性，我们使用环己酰胺追踪了所有携带突变KRAS的多种肿瘤细胞系中的RAS蛋白水平，包括结肠（COAD；LOVO和GP2D）、胰腺（PAAD；ASPC1和PANC1）和肺腺癌（LUAD；NCI H23、A549和NCI H1299）的腺癌细胞系，以及来自生发中心B细胞DLBCL（GCB DLBCL；WSU-FSCCL、Toledo和WILL2）和AML（HL60和THP1）的额外血液癌细胞系。尽管在多发性骨髓瘤细胞中RAS表达在3至4小时内迅速下降（图4G、I和J），但在许多测试的腺癌细胞系中，RAS保持稳定长达12小时，LOVO和A549除外（图4I和J；补充图S4G）。值得注意的是，GCB DLBCL和AML细胞系中的RAS蛋白半衰期相对较短，为4至6小时（图4I和J）。接下来，我们研究了LZTR1在调节多发性骨髓瘤和具有较长KRAS半衰期的腺癌细胞系中RAS稳定性中的作用。我们发现LZTR1敲低显著延长了环己酰胺处理后的RAS蛋白半衰期（图4K）。相比之下，经过测试的PAAD、COAD和LUAD细胞系在LZTR1敲低后RAS稳定性几乎没有变化，这表明LZTR1在这些细胞中并不强烈调控KRAS的表达。相应地，我们观察到LZTR1敲低增加了LOVO细胞中的RAS蛋白表达，但对GP2D、ASPC1和PANC1细胞系没有影响（图4L；补充图S4H），这与我们的环己亚胺数据一致，数据显示LOVO的RAS稳定性介于腺癌和血液癌细胞系之间（图4I）。同样，PPP1R2敲低或异位表达DN PP1C后RAS表达的变化仅发生在LOVO细胞中，而不在GP2D、ASPC1、PANC1和Mia PaCa-2细胞中（补充图S4I和S4J）。上述数据表明，PPP1R2/PP1C和LZTR1对KRAS表达的调控可能是血液系统恶性肿瘤的常见特征。为了证实这一点，我们使用了GCB DLBCL细胞系模型。尽管GCB DLBCL中KRAS突变较为罕见，但靶向A146的突变占该类型癌症中总KRAS突变的10%以上（49, 50）。与我们在多发性骨髓瘤中的发现一致，我们观察到LZTR1敲低（图4M）和异位表达DN PP1C（补充图S4K）增加了RAS表达，而PPP1R2敲低（补充图S4L）则减少了WILL2、WSU FSCCL和Toledo细胞系中的RAS表达，这些细胞都表达突变型KRASG13D。综上所述，这些数据表明血液系统癌症与腺癌中KRAS稳定性的调控存在差异，并进一步支持PPP1R2/PP1C/LZTR1依赖的KRAS稳定性调控可能是血液系统癌症的特征。

多发性骨髓瘤同时携带KRAS和NRAS的致癌激活突变（补充图S5A；参考文献1），虽然ALL和AML也携带KRAS A146突变，但这些白血病更倾向于表达突变的NRAS形式（51）。T148周围的氨基酸序列在人类KRAS、NRAS和HRAS中高度保守（图5A），这表明PPP1R2/PP1C也可能通过T148磷酸化来调控NRAS表达。我们发现PPP1R2敲低减少了依赖于NRAS的多发性骨髓瘤细胞SKMM1、INA6和NCI H929以及HL60和THP1 AML细胞中的RAS表达（图5B和C；补充图S5B）。相反，DN PP1C的表达增加了这些依赖于NRAS的细胞中的RAS表达（补充图S5C和S5D）。图5。PP1C调节NRAS T148磷酸化及LZTR1依赖的降解。A，人类KRAS（KRAS4A）、NRAS和HRAS中T148周围的序列比对。B，在SKMM1、INA6和NCI-H929多发性骨髓瘤细胞中，转导对照shRNA或靶向PPP1R2的shRNAs后，对RAS、PPP1R2和GAPDH进行Western blot分析，n=3个生物学重复。C，在THP1和HL60 AML细胞中，转导对照shRNA或靶向PPP1R2的shRNAs后，对RAS、PPP1R2和GAPDH进行Western blot分析，n=3个生物学重复。D，异位表达指定的NRAS磷酸突变体，并在PPP1R2敲低后进行Western blot分析，n=3个生物学重复。E，在SKMM1多发性骨髓瘤细胞和THP1 AML细胞中异位表达指定的NRAS磷酸突变体，并在DN PP1C表达后进行Western blot分析，n=3个生物学重复。F，通过IP–Western blot分析SKMM1多发性骨髓瘤细胞中异位表达的NRAS突变体与泛素的结合，n=3个生物学重复。G，在SKMM1、INA6、HL60和THP1细胞中，用对照shRNA或靶向LZTR1的shRNAs处理后，对RAS、LZTR1和GAPDH进行Western blot分析，n=3个生物学重复。H，在指定的多发性骨髓瘤和AML细胞中评估pT148 RAS磷酸化情况。

多发性骨髓瘤同时携带KRAS和NRAS的致癌激活突变（补充图S5A；参考文献1），尽管ALL和AML也携带KRAS A146突变，但这些白血病更倾向于表达突变的NRAS形式（51）。T148周围的氨基酸序列在人类KRAS、NRAS和HRAS中高度保守（图5A），这表明PPP1R2/PP1C也可能通过T148磷酸化来调控NRAS表达。我们发现PPP1R2敲低减少了依赖于NRAS的多发性骨髓瘤细胞SKMM1、INA6和NCI H929以及HL60和THP1 AML细胞中的RAS表达（图5B和C；补充图S5B）。相反，DN PP1C的表达增加了这些依赖于NRAS的细胞中的RAS表达（补充图S5C和S5D）。图5。这些数据表明T148磷酸化也可能调节NRAS蛋白的稳定性。在SKMM1和INA6多发性骨髓瘤细胞以及THP1 AML细胞中，异位表达含有T148磷酸突变的mNG-NRASG12D构建体显示T148A突变降低了RAS表达水平（补充图S5E）。Western blot分析显示，尽管PPP1R2敲低减少了NRASG12D的表达，但对NRAS磷酸突变体T148A和T148D没有影响（图5D）。同样，过表达DN PP1C仅增加了NRASG12D的表达，而在SKMM1多发性骨髓瘤细胞和THP1 AML细胞中，T148磷酸突变体未受影响（图5E）。与我们对KRAS的发现一致，我们发现异位表达的NRAS磷酸突变体调节了泛素结合，在SKMM1多发性骨髓瘤细胞和THP1 AML细胞中观察到泛素结合增加（图5F；补充图S5F）。此外，LZTR1敲低后多发性骨髓瘤和AML细胞中的NRAS蛋白水平增加（图5G），表明LZTR1介导的NRAS降解也受T148磷酸化的调节。正如预期的那样，我们的抗磷酸化T148 KRAS抗体也能识别到多发性骨髓瘤中NRAS上的T148磷酸化（图5H）。除了依赖致癌的KRAS和NRAS外，多发性骨髓瘤还可以通过表面受体（如FGFR3）下游的野生型（WT）KRAS和NRAS的病理性激活来驱动（52）。因此，我们接下来测试了PPP1R2是否在表达WT KRAS和NRAS的多发性骨髓瘤细胞中调节RAS表达。我们评估了在不同多发性骨髓瘤细胞群体中PPP1R2敲低后的RAS蛋白水平：XG7细胞表达突变型KRASG12D作为阳性对照；KMS34和KMS11细胞依赖FGFR3上游的WT RAS；LP1和KMS12PE细胞独立于RAS或FGFR3信号传导。PPP1R2敲低显著降低了依赖于KRAS的XG7细胞中的RAS表达，在KMS34和KMS11细胞中效果中等，在LP1和KMS12PE细胞中效果较弱（补充图S5G）。总体而言，这些数据表明PPP1R2优先调节活跃的RAS信号传导——无论其来源是KRAS/NRAS的致癌突变还是表面受体下游的激活。

我们确定PP1C能够脱磷酸化KRAS和NRAS的T148位点，从而调节LZTR1介导的RAS降解。这一机制提示存在一种能够磷酸化T148的相反激酶（图6A）。已有报道GSK3B可以在T148和T144位点磷酸化RAS以调节RAS蛋白表达（53），我们发现用GSK3B抑制剂IM-12处理的多发性骨髓瘤细胞通过免疫印迹法略微增加了RAS表达（补充图S6A）。图6。图6。确定靶向RAS T148的激酶。A，一个可能通过磷酸化RAS T148来调节RAS蛋白稳定性的假定激酶的示意图。B，来自图1A和B中KRAS稳定性筛选的激酶相关基因的散点图。C，具有降低RAS表达（≤ ?0.5 KRAS稳定性评分）的激酶基因、来自BioID2研究的RAS相互作用伙伴（≥0.8 log2倍富集；参考文献21）以及在依赖于RAS的多发性骨髓瘤细胞（XG7、RPMI 8226；CSS ≤ ?1；参考文献25）中鉴定出的必需基因的文氏图。D，在XG7、RPMI 8226和SKMM1多发性骨髓瘤细胞中，用100 nmol/L的指定药物处理24和48小时后，对RAS表达进行Western blot分析，n=5个生物学重复。E，在用MG-132（10 μmol/L）处理8小时并随后用指定药物（100 nmol/L FRAX597和FRAX486、10 nmol/L AZD-8055）处理48小时后，评估细胞中的pT148 RAS磷酸化情况，n=3个生物学重复。F，在指定的多发性骨髓瘤细胞中，共IP PAK1和PAK2与异位表达的mNG-KRASG12D，n=2个生物学重复。G，表示的细胞表达列出的shRNAs或DN PP1C，并用RMC-6236进行剂量滴定处理。数据显示的是实验（列出的shRNA或DN PP1C）与shCTRL的比例。所示数值为两次实验的平均值。H，在体外激酶测定中，重组PAK1作为底物对重组KRAS进行检测。使用FRAX597（100 nmol/L）的抑制作用来验证特异性，n=4个生物学重复。I，对两个多发性骨髓瘤患者的主要样本，分别用指定剂量的FRAX597（x轴）和RMC-6236（y轴）处理后的细胞活力进行了 excess HSA药物协同作用分析。细胞活力通过CCK-8在4天时测量，n=3个生物学重复。J，在异位表达KRASG12D或KRASG12D+T148D的XG7细胞中，用100 nmol/L FRAX527和/或8 nmol/L RMC-6236处理后，细胞活力情况，n=5个生物学重复（单因素ANOVA后进行Tukey多重比较测试）。K，用载体（灰色）、3 mg/kg FRAX597（紫色）、5 mg/kg RMC-6236（粉色）或两种药物的组合（红色）处理的MM.1S异种移植瘤的体积。

多发性骨髓瘤同时携带KRAS和NRAS的致癌激活突变（补充图S5A；参考文献1），虽然ALL和AML也携带KRAS A146突变，但这些白血病更倾向于表达突变的NRAS（51）。T148周围的氨基酸序列在人类KRAS、NRAS和HRAS中高度保守（图5A），这表明PPP1R2/PP1C也可能通过T148磷酸化来调节NRAS表达。我们发现PPP1R2敲低减少了依赖于NRAS的多发性骨髓瘤细胞SKMM1、INA6和NCI H929以及HL60和THP1 AML细胞中的RAS表达（图5B和C；补充图S5B）。相反，DN PP1C的表达增加了这些依赖于NRAS的细胞中的RAS表达（补充图S5C和S5D）。图5。这些数据表明T148磷酸化也可能调节NRAS蛋白的稳定性。在SKMM1和INA6多发性骨髓瘤细胞以及THP1 AML细胞中，异位表达含有T148磷酸突变的mNG-NRASG12D构建体显示T148A突变降低了RAS表达水平（补充图S5E）。Western blot分析显示，尽管PPP1R2敲低减少了NRASG12D的表达，但对NRAS磷酸突变体T148A和T148D没有影响（图5D）。同样，过表达DN PP1C仅增加了NRASG12D的表达，而在SKMM1多发性骨髓瘤细胞和THP1 AML细胞中T148磷酸突变体未受影响（图5E）。与我们对KRAS的发现一致，我们发现异位表达的NRAS磷酸突变体调节了泛素结合，在SKMM1多发性骨髓瘤细胞和THP1 AML细胞中观察到泛素结合增加（图5F；补充图S5F）。此外，LZTR1敲低后多发性骨髓瘤和AML细胞中的NRAS蛋白水平增加（图5G），表明LZTR1介导的NRAS降解也受T148磷酸化的调节。正如预期的那样，我们的抗磷酸化T148 KRAS抗体也能识别到多发性骨髓瘤中NRAS上的T148磷酸化（图5H）。除了依赖致癌的KRAS和NRAS外，多发性骨髓瘤还可能由野生型（WT）KRAS和NRAS在表面受体（如FGFR3）下游的病理性激活驱动（52）。因此，我们接下来测试了PPP1R2是否在表达WT KRAS和NRAS的多发性骨髓瘤细胞中调节RAS表达。我们评估了在不同多发性骨髓瘤细胞群体中PPP1R2敲低后的RAS蛋白水平：XG7细胞表达突变型KRASG12D作为阳性对照；KMS34和KMS11细胞依赖于FGFR3上游的WT RAS；LP1和KMS12PE细胞不依赖于RAS或FGFR3信号传导。PPP1R2敲低显著降低了依赖于KRAS的XG7细胞中的RAS表达，在KMS34和KMS11细胞中效果中等，在LP1和KMS12PE细胞中效果较弱（补充图S5G）。总体而言，这些数据表明PPP1R2优先调节活跃的RAS信号传导——无论其来源是KRAS/NRAS的致癌突变还是表面受体下游的激活。

我们确定PP1C可以脱磷酸化KRAS和NRAS的T148位点，从而调节LZTR1介导的RAS降解。这一机制表明存在一种能够磷酸化T148的相反激酶（图6A）。已有报道GSK3B可以在T148和T144位点磷酸化RAS以调节RAS蛋白表达（53），我们发现用GSK3B抑制剂IM-12处理的多发性骨髓瘤细胞通过免疫印迹法略微增加了RAS表达（补充图S6A）。图6。图6。确定靶向RAS T148的激酶。A，一个可能通过磷酸化RAS T148来调节RAS蛋白稳定性的假定激酶的示意图。B，来自图1A和B中KRAS稳定性筛选的激酶相关基因的散点图。C，具有降低RAS表达（≤ ?0.5 KRAS稳定性评分）的激酶基因、来自BioID2研究的RAS相互作用伙伴（≥0.8 log2倍富集；参考文献21）以及在依赖于RAS的多发性骨髓瘤细胞（XG7、RPMI 8226；CSS ≤ ?1；参考文献25）中鉴定出的必需基因的文氏图。D，在XG7、RPMI 8226和SKMM1多发性骨髓瘤细胞中，用100 nmol/L的指定药物处理24和48小时后，对RAS表达进行Western blot分析，n=5个生物学重复。E，在用MG-132（10 μmol/L）处理8小时后并随后用指定药物（100 nmol/L FRAX597和FRAX486，10 nmol/L AZD-8055）处理48小时后，评估细胞中的pT148 RAS磷酸化情况，n=3个生物学重复。F，在指定的多发性骨髓瘤细胞中，共IP PAK1和PAK2与异位表达的mNG-KRASG12D，n=2个生物学重复。G，表示的细胞表达列出的shRNAs或DN PP1C，并用RMC-6236进行剂量滴定处理。数据显示的是实验（列出的shRNA或DN PP1C）与shCTRL的比例。所示数值为两次实验的平均值。H，在体外激酶测定中，重组PAK1作为底物对重组KRAS进行检测。使用FRAX597（100 nmol/L）的抑制作用来验证特异性，n=4个生物学重复。I，对两个多发性骨髓瘤患者的主要样本，分别用指定剂量的FRAX597（x轴）和RMC-6236（y轴）处理后的细胞活力进行了 excess HSA药物协同作用分析。细胞活力通过CCK-8在4天时测量，n=3个生物学重复。J，在异位表达KRASG12D或KRASG12D+T148D的XG7细胞中，用100 nmol/L FRAX527和/或8 nmol/L RMC-6236处理后，细胞活力情况，n=5个生物学重复（单因素ANOVA后进行Tukey多重比较测试）。K，用载体（灰色）、3 mg/kg FRAX597（紫色）、5 mg/kg RMC-6236（粉色）或两种药物的组合（红色）处理的MM.1S异种移植瘤的体积。L，模型展示了LZTR1介导的K147位点泛素化通过PP1C磷酸酶复合体（PPP1R2和PP1C）和激酶PAK1/2对T148磷酸化的相互调节来调控RAS蛋白稳定性，在稳态下（左图）；KRAS A146癌变突变保护K147位点不受泛素化（中图）；使用FRAX597抑制PAK1/2会促使RAS通过LZTR1介导的K147位点泛素化而被降解（右图）。详见图6。然而，我们寻找了一种特异性针对T148的激酶，其抑制作用可以减少KRAS或NRAS的表达，这可能成为治疗依赖RAS的血液系统恶性肿瘤的潜在靶点。为了鉴定候选激酶，我们检查了在KRAS稳定性筛选中（图6B）能够降低KRAS表达的激酶基因（www.kinhub.org）。将这些基因（KRAS稳定性评分≤-0.5）与RAS相互作用伙伴（富集度≥0.8 log2）以及依赖RAS的多发性骨髓瘤中的必需基因（CSS≤-1）进行比对，共鉴定出四种潜在激酶：MTOR、PAK1、PAK2和STRADB（图6C）。MTOR和PAK1/2有多种小分子抑制剂，这些抑制剂可能影响RAS的磷酸化和蛋白稳定性，而STRADB是一种伪激酶，没有激酶活性也没有抑制剂。使用FRAX597和FRAX486抑制PAK1/2或在AZD-8055作用下抑制MTOR可以在24至48小时内降低多发性骨髓瘤细胞系中的RAS表达，这一点通过免疫印迹（图6D）和在异位表达mNG-KRASG12D的细胞上的FACS分析得到了验证（补充图S6B和S6C）。由于MTOR抑制会整体降低蛋白合成，从而非特异性地减少RAS表达，接下来我们检测了这些激酶抑制剂是否特异性地降低RAS T148的磷酸化。我们发现，在用MG-132处理的依赖KRAS或NRAS的多发性骨髓瘤细胞中，两种PAK1/2抑制剂都能显著降低RAS T148的磷酸化水平，而MTOR抑制剂AZD-8055对T148磷酸化的降低效果较弱（图6E）。因此，当同时表达T148磷酸突变体时，FRAX597处理无法降低KRASG12D的蛋白表达，而AZD-8055无论是否表达T148磷酸突变体都能降低RAS表达（补充图S6D）。这些数据表明PAK1和PAK2通过直接磷酸化T148来调节RAS表达。与此一致的是，PAK1和PAK2都与异位表达的RAS共免疫沉淀（图6F）。此外，在携带KRAS A146突变的AMO1和H1112多发性骨髓瘤细胞中，PAK1/2的抑制并未降低RAS蛋白表达（补充图S6E–S6G），这与我们之前的研究结果一致，即A146突变无论T148磷酸化状态如何都能保护RAS免受LZTR1介导的降解。PAK1/2的抑制还调节了LZTR1敲低对XG7、RPMI 8226和SKMM1多发性骨髓瘤细胞系中RAS蛋白水平的影响（补充图S6H），表明PAK1/2以LZTR1依赖的方式调节RAS表达。单独使用FRAX597处理对依赖KRAS或NRAS的多发性骨髓瘤没有选择性毒性（补充图S6I）。尽管在CRISPR筛选中PAK1敲除对依赖RAS的多发性骨髓瘤具有选择性毒性，但PAK2无论是否依赖RAS都被证明是必需基因（补充图S6J）。为了确定PAK1或PAK2哪个更优先调节RAS稳定性，我们生成了针对PAK1、PAK2、PPP1R2和LZTR1的多发性骨髓瘤（XG7、MM.1S和H1112）以及PAAD（ASPC1和PANC1）的敲低细胞，并且还生成了异位表达DN PP1C的细胞。然后我们测试了这些细胞对泛RAS抑制剂RMC-6236的反应。我们发现PPP1R2的敲低使XG7和MM.1S细胞对RMC-6236的敏感性略有增强，而LZTR1的敲低或DN PP1C的表达则赋予了细胞抗性（图6G）。与之前的数据一致，这些扰动在表达KRAS A146T的H1112细胞和PAAD细胞中没有效果。有趣的是，敲低PAK1或PAK2都会增强XG7和MM.1S细胞对RAS抑制的敏感性，说明这两种蛋白都参与RAS T148的磷酸化。因此，我们使用重组PAK1和KRAS进行了体外激酶测定。我们发现PAK1可以直接磷酸化KRAS T148，而这种活性被PAK1/2抑制剂FRAX597所抑制（图6H）。尽管单独使用PAK1/2抑制剂FRAX597对依赖RAS的多发性骨髓瘤没有选择性毒性（补充图S6I），但我们假设它可以通过降低癌变RAS的水平与直接的RAS抑制剂产生协同作用。我们将FRAX597与RMC-6236联合使用，在大多数依赖RAS的多发性骨髓瘤和AML细胞系以及原发性多发性骨髓瘤肿瘤细胞中观察到协同毒性（图6I；补充图S6K）。值得注意的是H1112多发性骨髓瘤细胞是一个例外，其KRASA146V突变绕过了PAK1–LZTR1降解途径。我们在异位表达KRAS突变体的XG7细胞中验证了这种药物组合的机制。该组合在表达KRASG12D的细胞中有效，但在表达绕过PAK1调控的KRASG12D+T148D磷酸模拟物的细胞中无效（图6J）。最后，我们使用MM.1S异种移植模型在体内评估了PAK1/2和RAS抑制剂组合的效果。虽然单药低剂量的FRAX597无效，但RMC-6236有轻微的效果，而组合使用则显著抑制了肿瘤生长，且没有明显的毒性（图6K；补充图S6L）。

讨论

我们发现了一个调控RAS蛋白稳定性的机制，其中PAK1对T148位点的RAS磷酸化抑制了PP1C介导的去磷酸化以及随后的LZTR1依赖的降解（图6L）。这一发现为RAS生物学增加了新的翻译后调控层面，并揭示了A146突变的先前未知功能。我们的研究结果表明，T148位点的磷酸化调控在包括多发性骨髓瘤、AML和GCB DLBCL在内的多种血液系统恶性肿瘤中普遍存在，这表明PAK1/2的抑制可能是这些癌症的关键治疗靶点。T148位点的磷酸化可能优先保护KRAS和NRAS免受降解。这一发现似乎与结肠癌模型中的研究结果相反，在结肠癌模型中，GSK3B在T144和T148位点的磷酸化被发现可以降低突变RAS的表达（53, 56）。然而，我们也发现抑制GSK3B会增加RAS的水平（补充图S6A），并且T144A突变在多发性骨髓瘤中略微增加了RAS的稳定性（图2B和C）。我们认为，T148位点的磷酸化在多发性骨髓瘤细胞中起主导的调控作用。这种差异可能反映了细胞类型的特异性调控机制，可能与结肠癌中占主导地位的WNT/APC/GSK3B轴等不同的上游信号通路有关（57）。这些观察结果表明，血液系统恶性肿瘤的独特生物学特性决定了RAS调节的不同的方式。在血液系统恶性肿瘤中，PP1C和LZTR1对RAS的优先调控可能是由多种因素造成的。一种可能性是RAS信号在细胞内的定位不同。我们之前已经证明，RAS在多发性骨髓瘤中通过溶酶体激活mTORC1（21）。由于LZTR1主要定位于高尔基体（58），高尔基体与内体之间的转运（59）可能使RAS暴露于LZTR1，因此需要T148位点的磷酸化来保护RAS。实际上，与LZTR1相关的蛋白质富含与囊泡转运相关的蛋白质（补充图S3G），我们还观察到LZTR1和KRASG12D之间的PLA点主要集中在细胞质中（图3H）。另外，去泛素化酶（DUB）表达的差异也可能导致这种组织特异性。我们发现多发性骨髓瘤中的RAS稳定性低于结肠或胰腺细胞（图4G、J和K），但这种稳定性可能通过过表达恶性肿瘤浆细胞中不表达的DUB来提高。例如，据报道DUB USP18可以降低RAS的表达并抑制小鼠的肺部肿瘤生长（60），但在多发性骨髓瘤患者中未表达（45）。有趣的是，这项研究发现敲低USP18会导致RAS从质膜重新分布到内膜隔室。也许这种重新分布使LZTR1更容易接触到RAS。我们的发现还表明KRAS A146突变具有双重作用。除了它们已知的促进GDP/GTP交换的功能（46）外，我们还证明这些突变还可以保护RAS免受LZTR1介导的降解。鉴于LZTR1在血液系统恶性肿瘤中作为RAS调节器的作用增强，这种双重功能可以解释为什么A146突变在血液系统恶性肿瘤中普遍存在，而在胰腺和其他许多上皮癌中很少见（1）。支持这一观点的实验表明，在造血干细胞中条件性表达KRASA146T会诱导类似KRASG12D的髓系增生状态，但未能有效驱动胰腺上皮肿瘤或结肠隐窝增生（46）。从机制上讲，A146突变可能阻碍LZTR1接触到相邻的K147位点（61），从而保护RAS免受泛素化和后续降解。同样，T148位点磷酸化产生的负电荷也可能保护K147。值得注意的是，多发性骨髓瘤中未观察到KRAS K147突变（45），尽管最近的一项KRAS突变筛选发现了K147突变的致癌潜力（bioRxiv 2024.10.22.618529）。可能是因为突变A146或K147都能保护RAS免受LZTR1依赖的降解，而只有A146突变同时增强了GTP的循环，提供了强大的致癌驱动因素。最后，我们确定PAK1和PAK2是RAS蛋白稳定性的关键、以前未被发现的调节因子。PAK1和PAK2已知是RAC1和CDC42的下游效应器（62），并且可以靶向MAP激酶、NF-κB和PI3K信号通路（63）。PAK1和PAK2在调控RAS稳定性中的作用揭示了一个潜在的治疗靶点。我们证明PAK1/2抑制剂可以下调RAS表达，并增强RAS通路抑制剂的效应。我们提出，特定的PAK1抑制剂可以通过限制与PAK2抑制相关的靶向毒性来提高这种协同效果。鉴于目前的RAS抑制剂耐受性有限，结合使用PAK1抑制剂来抑制RAS活性并降低RAS蛋白水平可能是一个强大的策略，以增强治疗效果并防止耐药性的产生。

方法

细胞培养

多发性骨髓瘤和腺癌细胞系在含有5% CO2的潮湿环境中，于37°C下在Advanced RPMI培养基（Invitrogen）中培养，培养基中添加了4% FBS（四环素测试过，R&D Systems）、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺（Invitrogen）。HEK293FT和HEK293T细胞在DMEM（Invitrogen）中培养，培养基中添加了10% FBS（四环素测试过，R&D Systems）、1%青霉素-链霉素和1% L-谷氨酰胺（Invitrogen）。使用MycAlert Mycoplasma Detection Kit（Lonza Bioscience）定期监测细胞是否受到支原体污染，并通过16个拷贝数变异位点的短串联重复DNA指纹分析进行验证（64）。本研究中使用的所有人类细胞系列表见补充表S5。

抗体

本研究中使用的所有抗体列表见补充表S5。

生成mNG稳态表达细胞

合成的KRAS基因片段（Twist Bioscience）通过Gibson组装技术克隆到pBMN-mNG (mNeonGreen)-8 × GS linker-IRES–LYT2中（New England Biolabs；补充表S6）。具体步骤为：将150 ng的KRAS基因片段与1 μL的SnaBI线性化载体和4 μL的2× NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs）混合，在50°C下孵育1小时。将组装好的质粒转入Escherichia coli Stbl3细胞中进行扩增。序列验证的mNG构建体用于在293T细胞（ATCC）中进行逆转录病毒感染。HEK293T细胞过夜接种后，使用Opti-MEM（Gibco）和TransIT-293（Mirus）以2:1:1的质粒比例转入序列验证的mNG构建体以及辅助质粒pHIT60和pHIT/EA6 × 3*。转染后24小时收集病毒上清液，然后通过旋转感染（2,500 rpm，30°C下1小时）将病毒转导到多发性骨髓瘤细胞中。转染后去除病毒上清液，更换为新鲜培养基。转导后的多发性骨髓瘤细胞培养3天后，用含有0.5% FBS的PBS中的抗-Lyt2抗体（BioLegend；1:1,000稀释）进行染色。随后使用Sony MA900细胞分选仪对细胞进行分选，以获得稳定的mNG–KRAS表达细胞系。

CRISPR KRAS稳定性筛选

XG7和RPMI 8226细胞稳定表达Cas9，并且异位表达mNG-KRASG12D，按照上述方法用Brunello sgRNA文库进行三次转导。转导后，用1 μg/mL的嘌呤霉素选择细胞，并用100 ng/mL的多西环素诱导Cas9表达。细胞扩增7天后，收集5 × 10^7个细胞作为基线（输入）样本。剩余的约8 × 10^7个细胞用含有0.5% FBS的PBS中的抗-Lyt2抗体（BioLegend；1:1,000稀释）在冰上染色20分钟。然后洗涤细胞，用含有0.5% FBS的PBS将细胞重新悬浮至约2 × 10^7个细胞/mL的浓度，并使用Sony MA900细胞分选仪分离出表达mNG–KRAS的细胞群的上层和底层5%，每份约得到2 × 10^6个细胞。根据制造商的协议，使用QIAamp DNA FFPE Advanced Kit（QIAGEN）从分离的细胞群中提取基因组DNA。CRISPR文库扩增

来自CRISPR筛选的基因组DNA通过嵌套PCR策略进行处理。在第一轮中，从基因组DNA中扩增了sgRNA序列，随后进行第二轮PCR以添加与Illumina兼容的测序接头。每轮PCR使用Ex Taq DNA聚合酶（Takara）进行18至20个循环。扩增产物通过2% E-Gel SizeSelect琼脂糖凝胶（Invitrogen）进行大小筛选，并使用Qubit dsDNA高灵敏度测定法（Thermo Fisher Scientific）进行定量。最终文库使用Illumina NextSeq 2000和NextSeq 1000/2000控制软件（v1.2.036376）进行测序。多路测序数据使用DRAGEN（v3.7.4，Illumina）进行解复用，并使用Bowtie2（v2.2.9）将测序读段与参考sgRNA文库对齐。PCR引物序列和详细协议见文献(65)。

CRISPR分析

使用DESeq2算法（66）估算每个实验中mNG-KRAS–high样本与mNG-KRAS–low样本以及输入样本之间的sgRNA读数对数倍数变化（log FC）。在针对77,441个基因的引导序列中，有9,919个（13%）因在大量关键基因实验中的表现不佳而被剔除（共49,67个实验）。对于每个基因，将其相关引导序列的对数比率取平均值以估算基因水平上的log FC。对于每个细胞，这些基因水平的log FC通过减去其分布的众数（用R函数“density”估算）并进行归一化，然后除以该众数的均方根偏差来得到。进一步分析使用Microsoft Excel v16.63.1进行。

KRAS磷酸突变体、PPP1R2、PP1C和LZTR1的合成基因片段（Twist Bioscience）通过Gibson克隆技术（New England Biolabs；补充表S6）克隆到pBMN-BioID2-10x linker-LYT2载体中。基因片段（150 ng）与1 μL SnaBI切割的BioID-2载体和4 μL 2× NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix（New England Biolabs）混合，并在50°C下孵育1小时。组装后的载体被转入Stbl3细胞中进行扩增。经过序列验证的BioID2构建体与辅助质粒pHIT60和pHIT/EA6×3*以2:1:1的比例共同包装到293T细胞（ATCC）中制成逆转录病毒。转化后的多发性骨髓瘤细胞用抗Lyt2（小鼠CD8）磁珠（Thermo Fisher Scientific）进行纯化。当获得超过95%的Lyt2阳性细胞池后，细胞扩增约2周至数量达到40 × 10^6个。在裂解前一天，向BioID2-KRAS、BioID2-PPP1R2、BioID2-PP1C或LZTR1-BioID2携带细胞中加入终浓度为50 μmol/L的生物素。细胞在含有生物素的条件下孵育16小时，然后在含有1 × 10^7个细胞的RIPA缓冲液中（含有1% NP-40、0.5%脱氧胆酸盐、50 mmol/L Tris、pH 7.5、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Na3VO4和1 mmol/L NaF）中裂解10分钟，随后在4°C下以14,000 g离心20分钟清除上清液。接着加入30 μL预洗过的streptavidin琼脂糖珠（Thermo Fisher Scientific），样品在4°C下旋转2小时。孵育结束后，样品用1× RIPA缓冲液、1× PBS和1× 50 mmol/L HEPES洗涤两次，然后储存在?80°C以备后续质谱分析。所有BioID2实验均重复三次。

对于KRAS、PPP1R2、PP1C或LZTR1 BioID2蛋白的消化及其TMTpro标记，每个样品与含有50 μL 50 mmol/L HEPES、pH 8的捕获珠结合后，用含有以下成分的消化缓冲液处理：10 mmol/L TCEP、40 mmol/L氯乙酰胺和15 ng/μL胰蛋白酶/LysC（来自EasyPep试剂盒，Thermo Fisher Scientific）。样品在37°C下避光孵育过夜。消化完成后，将175 μL每种溶液转移到新试管中，并加入10 μL 10 μg/μL TMTpro试剂（Thermo Fisher Scientific）在25°C下孵育1小时并摇晃。多余的TMTpro用50 μL 5%羟胺和20%甲酸处理10分钟后，合并各组样本。结合后的 Samples用EasyPep mini柱（Thermo Fisher Scientific）按照手册说明进行清洗。洗脱的肽段在高速真空干燥机中干燥。

对于整体细胞蛋白的消化及其TMTpro标记，每个细胞沉淀物在500 μL EasyPep裂解缓冲液中裂解，并用1 μL通用核酸酶（Thermo Fisher Scientific）处理。蛋白质浓度用BCA方法测定，每个样本取10 μg进行消化。样品用裂解缓冲液调整至总量为100 μL，并加入含有以下成分的消化缓冲液：10 mmol/L TCEP、40 mmol/L氯乙酰胺和15 ng/μL胰蛋白酶/LysC，然后在37°C下避光孵育过夜。之后向样品中加入10 μL 10 μg/μL TMTpro 18-plex标记（Thermo Fisher Scientific），再在25°C下孵育1小时。多余的TMTpro用50 μL 5%羟胺和20%甲酸处理10分钟后，合并各组样本。样品用EasyPep mini柱按照手册说明进行清洗。洗脱的肽段在高速真空干燥机中干燥。

对于BioID2实验的LC/MS分析，肽段重新悬浮在50 μL 0.1% FA溶液中，然后用Dionex UltiMate 3000 RSLC和Orbitrap Eclipse（Thermo Fisher Scientific）进行双重分析，该仪器配备Easy-Spray离子源。溶剂A为0.1% FA的水溶液，溶剂B为0.1% FA的80% ACN溶液。加载泵在运行前6分钟以7 μL/分钟的流速运行，随后将流速降至2 μL/分钟以连接捕获柱（Acclaim PepMap 100 C18 HPLC柱，内径3 μm，长度2 cm）和分析柱（Easy-Spray C18 HPLC柱，内径2 μm，长度25 cm）。梯度泵的流速为300 nL/分钟，第一个6分钟的运行中使用5%至7% B的线性梯度，接下来的83分钟使用7%至30% B的梯度，30分钟使用30%至50% B的梯度，4分钟使用50%至95% B的梯度，最后7分钟保持95% B的梯度。所有MS注射均使用TopSpeed方法，每个CV的循环时间为3秒，包含以下参数： spraying电压为2,200 V，离子转移温度为300°C。MS1扫描在Orbitrap中进行，分辨率为120,000，AGC为4e5 ions，最大注射时间为50毫秒，质量范围为350至1,600 m/z；MS2扫描在Orbitrap中进行，分辨率为15,000，AGC为1.25 e5，最大注射时间为22毫秒，HCD能量为38%，分离宽度为0.4 Da，强度阈值为2.5 e4，MS2选择时使用2至6的电荷强度。对于细胞蛋白质组的LC/MS分析，全局细胞肽段重新悬浮在50 μL 0.1% FA溶液中，并两次加入5 μL到Dionex UltiMate 3000 RSLC中，然后连接到Orbitrap Eclipse上进行分析。溶剂组成和柱配置与前面部分相同。梯度泵的流速为300 nL/分钟，第一个6分钟的运行中使用5%至7% B的线性梯度，接下来的83分钟使用7%至30% B的梯度，30分钟使用30%至50% B的梯度，4分钟使用50%至95% B的梯度，最后7分钟保持95% B的梯度。所有MS注射均使用TopSpeed方法，每个CV的循环时间为3秒，包含以下参数： spraying电压为2,200 V，离子转移温度为300°C。MS1扫描在Orbitrap中进行，分辨率为120,000，AGC为4e5 ions，最大注射时间为50毫秒，质量范围为350至1,600 m/z；MS2扫描在Orbitrap中进行，分辨率为15,000，AGC为1.25 e5，最大注射时间为22毫秒，HCD能量为38%，分离宽度为0.4 Da，强度阈值为2.5 e4，MS2选择时使用2至6的电荷强度。多发性骨髓瘤细胞被接种到15孔的m-Slide Angiogenesis ibiTreat培养皿（Ibidi）上，并在37°C下静置30分钟以使其附着在表面。随后，细胞用4%的甲醛（Electron Microscopy Sciences）在室温下固定20分钟，然后用PBS（Gibco）清洗。细胞在-20°C的冷甲醇中通透20分钟，再用PBS清洗，最后在室温下用Duolink Blocking缓冲液（Sigma）封闭30分钟。一抗在Duolink Antibody Diluent（Sigma）中稀释，并在4°C下过夜孵育。之后，细胞用含有0.05% Tween-20的TBST清洗两次（每次4分钟），然后加入适当的Duolink二抗（Sigma），并按照制造商的说明进行稀释和混合。通过添加5 mg/mL的与Alexa Fluor 488（Thermo Fisher Scientific）结合的小麦胚芽凝集素来标记细胞膜，细胞在37°C下孵育1小时，之后用含有0.05% Tween-20的TBST清洗两次（每次5分钟）。PLA的连接和扩增步骤按照Duolink in situ Detection Reagents Orange试剂盒（Sigma）的说明书进行。PLA完成后，细胞被固定在含有4’,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；Abcam）的Fluoroshield mounting介质中。图像使用Leica Application Suite X v4.5.0.2531在Leica Stellaris 5共聚焦显微镜上获取。用于展示的图像是用NIH ImageJ/FIJI软件v2.9.0/1.53t（68）处理的。

内源性RAS的敲除

sgRAS（AGATATTCACCATTATAGG，Twist Bioscience）被亚克隆到pLKO.1-puro-GFP载体中。慢病毒包装和sgRAS的转导按照上述方法进行。简而言之，sgRAS载体使用辅助质粒pPAX2（Addgene 12260）和pMD2.g（Addgene 12259）以4:3:1的比例在293FT细胞（Invitrogen）中包装。转染后24小时收集293FT细胞的上清液。稳定表达mNG-KRASG12D或KRASG12D/T148A的多发性骨髓瘤细胞在30°C下以2,500rpm的速度转染90分钟，并补充新鲜的完全培养基。用0.5 μg/mL的嘌呤霉素筛选转染的多发性骨髓瘤细胞，然后用100 ng/mL的多西环素诱导Cas9表达，随后进行Western blot分析。

PLA图像分析

PLA点的数量使用自定义宏脚本计算，该脚本可在https://github.com/janwisn/EIB_PLA_Analysis获取。PLA评分是通过将每个样本中计数的PLA点数与对照样本中计数的平均PLA点数进行归一化来确定的，对照组样本的PLA点数设为100。箱线图显示了包含90%数据的PLA评分中位数；异常值以点的形式显示。统计比较使用Prism软件通过单因素ANOVA和Dunnett post hoc检验进行。

FACS分析

对于FACS分析，突变RAS异构体与mNeonGreen基因片段（Twist Bioscience）连接，并用抗CD8抗体（1:2,000，BioLegend，目录号#100724）染色，如之前描述的那样（67）。通过在冰上用抗CD8抗体染色2 × 10^5个细胞20分钟（FACS缓冲液：PBS加2% BSA）来测量多发性骨髓瘤中的突变RAS表达。细胞用FACS缓冲液清洗两次，然后重新悬浮在250 μL的FACS缓冲液中。这些细胞在Beckman Coulter CytoFLEX上使用CytExpert软件进行分析，并通过FlowJo v10进行数据分析。

共免疫沉淀（co-IP）

对于co-IP，突变RAS异构体与mNeonGreen基因片段（Twist Bioscience）连接。多发性骨髓瘤细胞通过逆转录病毒转导并筛选出mNeonGreen表达的细胞。为了进行共免疫沉淀，20 × 10^6个细胞在含有50 mmol/L Tris（pH 7.5）、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L Na3VO4、5 mmol/L NaF和1 mmol/L AEBSF的裂解缓冲液中裂解。裂解在冰上进行10分钟，然后通过在4°C下以14,000 g离心20分钟来清除裂解物。收集上清液。裂解物分为两部分，向一部分加入25 μL的mNeonGreen-Trap琼脂糖（ChromoTek）以沉淀mNeonGreen标记的RAS结构域，而对照组样本加入25 μL的饱和控制珠子（ChromoTek）。裂解物在4°C下旋转2小时以允许结合。随后，珠子用CHAPS裂解缓冲液清洗三次。向每个样本中加入30 μL的2× Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad），然后在95°C下孵育5分钟。之后按照上述方法进行Western blot分析。

同co-IP，IP中突变RAS异构体与mNeonGreen基因片段（Twist Bioscience）连接。总共20 × 10^6个选定的多发性骨髓瘤细胞在PBS中的1% SDS缓冲液中裂解10分钟，然后进行30秒超声波处理/30秒休息。之后，样本在95°C下煮沸10分钟。裂解物从1% SDS稀释到0.1% SDS。随后根据以下方法进行mNeonGreen-Trap琼脂糖纯化和Western blot分析。

体外磷酸酶测定

XG7多发性骨髓瘤细胞通过逆转录病毒转导mNeonGreen-KRASG12D，并筛选出mNeonGreen表达的细胞。细胞（20 × 10^6个）在1% SDS中裂解10分钟，然后在95°C下煮沸10分钟。裂解物用1×裂解缓冲液（见上文）稀释到0.1% SDS，然后通过在4°C下以14,000 × g离心20分钟来清除裂解物，并收集上清液。向每个样本中加入25微升的mNeonGreen-Trap琼脂糖珠子（ChromoTek）以沉淀mNeonGreen标记的RAS结构域，而对照组样本加入25微升的饱和控制珠子（ChromoTek）。裂解物在4°C下旋转2小时以允许结合，然后珠子用CHAPS裂解缓冲液清洗三次。向每个样本中加入30 μL的2× Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad），然后在95°C下孵育5分钟。之后按照上述方法进行Western blot分析。

信号传导途径分析

途径分析使用ToppGene Suite中的ToppFun（https://toppgene.cchmc.org；参考文献69）进行。基因本体论（41）和生物过程分析使用LZTR1-BioID2数据集，如文中所述。

AlphaFold3蛋白质-蛋白质相互作用预测

蛋白质结构复合物使用AlphaFold3（44）进行预测。全长LZTR1（UniProt: Q8N653）、KRAS（UniProt: P01116）、CUL3（UniProt: Q13618）和配体GDP（Guanosine-5′-diphosphate）作为复合物预测的输入。突变体KRASG12D、KRASG12D+T148A和KRASG12D+T148D代表在148位点带有额外替代的全长KRAS蛋白。界面预测的TM-score直接来自AlphaFold3的预测结果，而预测的对齐误差（PAE）使用PAE Viewer（70）进行可视化。蛋白质复合物结构使用ChimeraX软件（71）进行可视化和分析。

细胞活力测定

多发性骨髓瘤细胞系以每孔2,000到10,000个细胞的密度在96孔板中重复三次培养，每种细胞系有三个独立的生物学重复实验。FRAX597和RMC-6236（Selleck Chemicals）溶解在DMSO中，并按指定浓度等体积稀释。细胞用化合物处理3至7天，3天后补充药物。孵育期结束时根据制造商的说明使用Cell Counting Kit-8（CCK-8；Selleck Chemicals）评估代谢活性。使用Tecan Infinite 200 Pro板读取器在450 nm处测量吸光度。

原代多发性骨髓瘤细胞

原代多发性骨髓瘤细胞来自两名患有复发性/难治性骨髓瘤的患者，这些患者的胸腔积液正在NIH临床中心进行常规抽取。该研究获得了机构审查委员会（NCT03966443）的批准，并根据赫尔辛基宣言从这些患者那里获得了用于科学研究的书面知情同意。多发性骨髓瘤细胞通过Ficoll-Paque（Cytiva）密度梯度离心在室温下以400 g离心40分钟，然后用PBS清洗两次，并重新悬浮在添加了4% FBS（四环素测试过，R&D Systems）和1×青霉素/链霉素/谷氨酰胺的先进RPMI培养基中。细胞在37°C和5% CO2的湿润培养箱中孵育。如果50 nmol/L的RMC-6236处理使细胞活力降低了至少25%，则将这些患者样本纳入研究。所有原代患者样本在分析前进行了去标识处理。患者特征在补充表S7中描述。

异种移植实验

所有小鼠实验均获得了NCI动物护理和使用委员会（ACUC）的批准，并按照NCI ACUC指南和批准的方案进行。雌性NOD/SCID γ-链缺陷（非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷）小鼠从NCI Fredrick生物测试分部获得，用于6至8周龄时进行异种移植实验。小鼠被安置在特定的无病原体设施中，处于通风的微隔离器笼子里，光照时间为12小时，黑暗时间为12小时，温度为72°F，相对湿度为40%至60%。批准的方案允许肿瘤在任何维度上不超过20毫米；没有动物的肿瘤超过这些限制。MM.1S多发性骨髓瘤肿瘤是通过皮下注射10^6个细胞在PBS中建立的。当肿瘤体积达到平均值100 mm3时开始治疗。RMC-6236和FRAX597（MedChemExpress）在无菌过滤的20%（2-羟基丙基）-β-环糊精（Sigma）中制备，并每天口服给药一次（RMC-6236为5 mg/kg/day，FRAX597为3或3 mg/kg/day）。对于联合治疗组，药物以与单一药物相同的浓度和方案给药。每个治疗组包含五只小鼠。每隔一天通过测量两个正交方向的肿瘤大小来监测肿瘤生长，肿瘤体积按照以下公式计算：肿瘤体积 = （长度 × 宽度2）/2。

数据可用性

所有CRISPR筛选的分析数据提供在补充表S1中，所有CRISPR筛选的测序读取数据可在Gene Expression Omnibus中找到，访问号为GSE341488。本研究还分析了现有的公共数据：Chronos评分来自DepMap门户（https://depmap.org/portal/），使用23Q4数据发布。MS数据可在Mass Spectrometry Interactive Virtual Environment中找到，访问号为MSV000097703和MSV000102658。分析的蛋白质组学数据集提供在补充表S2和S3中。公共多发性骨髓瘤患者的RNA测序和WES数据来自MMRF-CoMMpass研究（IA17发布），可在https://research.themmrf.org获取。

作者披露

T. Oellerich报告称，在提交的工作之外，他从Gilead和Merck KGaA获得了资助和个人费用，以及从BeiGene、Bristol Myers Squibb、Roche、Regeneron、Janssen、Eli Lilly、Genmab、Kronos Bio和AbbVie获得了个人费用。M. Kocoglu报告称，在提交的工作之外，他从Janssen、Bristol Myers Squibb、Takeda、Poseida Therapeutics和Caelum Therapeutics获得了资助。其他作者没有披露任何利益关系。

作者贡献

L. Zhang：概念构思、数据管理、研究、初稿撰写、审稿和编辑。A. Bolomsky：概念构思、形式分析、研究。O.S. Al-Odat：形式分析、研究。C.K. VanWinkle：形式分析、研究。A. Battle：研究。P. Chakraborty：研究。R.J. Holewinski：数据管理、形式分析、研究。T. Andresson：形式分析、监督。B. H?upl：数据管理、形式分析、研究。T. Oellerich：资源提供、数据管理、形式分析、监督。E. Hill：资源提供。M. Kocoglu：资源提供。Q. Meng：软件开发、形式分析。J.D. Phelan：概念构思、审稿和编辑。J. Muppidi：形式分析、监督、研究、审稿和编辑。R.M. Young：概念构思、资源提供、数据管理、形式分析、监督、资金获取、研究、可视化、方法论设计、初稿撰写、项目管理、审稿和编辑。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）内部研究计划的支持。NIH作者的贡献被视为美国政府的工作成果。本文中的发现和结论仅代表作者的观点，不一定反映NIH或美国卫生与公众服务部的观点。作者感谢Lou Staudt博士、Dan Hodson博士、Constantine Mitsiades博士和Ji Luo博士的讨论以及Xin-Shuan Su博士提供的试剂。感谢MPI-NAT G?ttingen生物分析质谱组的Uwe Plessmann博士在样品制备和LC/MS测量方面提供的优秀技术支持。注意：本文的补充数据可在Blood Cancer Discovery Online（https://bloodcancerdiscov.aacrjournals.org/）上获取。