基于图像的单细胞转录组学原位解析浆细胞克隆性

《Nature Methods》：In situ profiling of plasma cell clonality with image-based single-cell transcriptomics

　　

基于图像的单细胞转录组学能够在完整组织中识别多种细胞类型。然而，在适应性免疫中，V(D)J重组在同一类型的细胞中产生独特的免疫受体，导致这些方法尚未定义的重要功能变异。研究人员在此引入B细胞受体多重错误鲁棒荧光原位杂交（BCR-MERFISH），该方法基于V基因使用情况结合转录组分析来测量浆细胞克隆性。研究人员证明，BCR-MERFISH能够在细胞培养以及具有受限或天然浆细胞多样性的小鼠中准确识别V基因使用情况。随后，研究人员利用BCR-MERFISH阐明微生物群依赖性变化对小鼠肠道中浆细胞丰度、克隆多样性及公共克隆型使用的影响，以及浆细胞克隆沿小鼠回肠的非均匀分布。鉴于组织背景是浆细胞动态变化的重要调节因素，研究人员预期BCR-MERFISH可能为广泛的免疫学问题提供新的见解。

论文解读：BCR-MERFISH——基于图像的单细胞转录组学原位解析浆细胞克隆性

一、研究背景与科学问题

B细胞和T细胞凭借其免疫受体的序列多样性而具有识别多种抗原的非凡能力。B细胞通过V(D)J重组和体细胞超突变在其B细胞受体（BCR）中产生大规模的序列变异，且由于B细胞分化为浆细胞，这种多样性被延续至分泌型抗体库中。携带高度相似BCR序列的B细胞被视为克隆，组织中B细胞克隆性的变化可反映B细胞应答状态。基于测序的方法（如批量或单细胞BCR测序，BCR-seq）已能有效表征克隆性变化，并将高克隆多样性与健康免疫监视和组织稳态相关联，将低克隆多样性与感染、自身免疫和癌症相关联。

然而，许多B细胞行为具有局部性，涉及不同组织背景下的特定细胞间相互作用。例如，生发中心中滤泡辅助性T细胞、滤泡树突状细胞与生发中心B细胞之间的相互作用调控特定克隆的选择和克隆扩增。在疾病状态下，B细胞与滤泡辅助性T细胞或树突状细胞的异常相互作用与免疫耐受破坏和自身抗体产生有关。这些功能中细胞相互作用和组织背景的重要性推动了能够提供B细胞克隆性空间分辨测量的技术发展。现有的空间转录组方法（如Spatial V(D)J、SPTCR-seq、Stereo-XCR-seq、Slide-TCR-Seq、VisiumHD和AIR-SPACE）虽可同时表征转录组表达和BCR或T细胞受体（TCR）序列特征，但其分辨率多为多细胞水平，受物理分辨率限制（10–50 μm）或需要空间聚合稀疏RNA测量，因此仅能推断免疫细胞周围的局部环境，无法实现单细胞水平的重链和轻链配对。因此，仍需要能够在直接表征免疫受体序列特征的同时进行基因表达分析的空间分辨方法。

二、研究内容与主要结论

研究人员在此提出BCR-MERFISH（B细胞受体多重错误鲁棒荧光原位杂交），这是一种单细胞空间方法，可同时测量浆B细胞克隆性和周围组织的转录组。BCR-MERFISH将MERFISH对数千种mRNA的原位表征扩展至浆细胞克隆性测量，通过靶向重链和轻链的V基因片段实现。研究人员证明该方法在细胞培养、具有受限BCR库的小鼠以及野生型小鼠中均能准确鉴定V基因。随后利用BCR-MERFISH绘制了无特定病原体（SPF）或无菌小鼠肠道中浆细胞的丰度、位置和相对克隆性，证明了微生物群在浆细胞多样性中的作用，并揭示了回肠沿线的克隆分布存在出乎意料的空间斑块性。该方法能够同时提供浆细胞克隆性测量并绘制周围组织中的细胞类型和状态图谱，有望成为多种组织背景下适应性免疫相互作用研究的有效工具。

三、关键技术方法

研究人员开发了两种互补策略以应对V基因高度同源性的挑战。第一是同源感知的FISH探针设计算法，通过相似性树将高度同源的基因组织为可靶向的基因群组，将188个免疫球蛋白重链可变区（IGHV）基因和102个免疫球蛋白κ/λ可变区（IGKV/IGLV）基因分别归为80个VH和68个VKVL可靶向群组。第二是同源抗性编码方案，为各群组分配固定汉明权重（Hamming weight）的唯一二进制条形码，残留同源性导致的交叉结合会产生更高汉明权重的碰撞条形码，仍可用于区分B细胞克隆。研究还纳入了七个重链恒定区（Fc）探针以区分类别转换重组。数据来源于SPF小鼠和无菌小鼠的回肠组织切片及皮肤引流淋巴结，并辅以配对组织的BCR-seq验证。

四、研究结果

V基因群组的单细胞准确鉴定： 通过构建含多种VH基因的表达质粒并转染HEK293细胞，BCR-MERFISH显示87%的VH基因在至少一个细胞中被检测到，89%的转染细胞被匹配至包含的V基因，仅7%的光学模式被检测为碰撞事件，空白条形码和未使用V基因的检出率分别仅为0.3%和4.4%。VKVL基因的鉴定性能与之相当，VH和VKVL群组鉴定约90%的准确率复合后提示克隆群组配对鉴定准确率约为80%。

小鼠体内V基因群组的准确鉴定： 在携带预重排BCR的564Igi转基因小鼠回肠中，158个Fc阳性细胞中有146个（93%）被成功鉴定VH和VKVL群组，53%的浆细胞与564H相关、96%与564K相关，与FISH和BCR-seq结果一致。在野生型SPF小鼠回肠中，研究人员鉴定出23个VH基因群组、33个VKVL基因群组和98个浆细胞克隆群组，且BCR-MERFISH检出的V基因丰度与配对BCR-seq结果高度相关。在皮肤引流淋巴结中，BCR-MERFISH成功定义了IgM?、IgA?和IgG2?浆细胞的克隆性，并证实绝大多数浆细胞位于髓索区域。

肠道中微生物群依赖性浆细胞克隆多样性的图谱： 对两只SPF和三只无菌小鼠回肠切片分析显示，SPF小鼠的浆细胞丰度高于无菌小鼠。研究人员解码出SPF和无菌小鼠中分别有540和271种不同的VH–VKVL配对。虽然SPF小鼠中VH、VKVL和克隆群组的丰富度均高于无菌小鼠，但香农多样性指数（Shannon diversity index）大致相当。无菌小鼠中与公共克隆型相关的胚系V基因显著富集（无菌：24.8%，P = 6.5 × 10?31；SPF：5%，P = 1.0），表明派尔集合淋巴结（Peyer's patches）中的公共克隆型可能也分布于回肠浆细胞区室。

浆细胞克隆群组沿黏膜轴的均匀分布： 对两只小鼠的长段回肠条带分析中，共成像301,911个细胞，其中6,830个为浆细胞，鉴定出434个独特克隆群组ID。浆细胞富集于绒毛中部，与Ccl25的空间分布一致，但克隆群组在各组织邻域和单个绒毛尺度上均充分混合，表明在健康肠道中浆细胞克隆性不参与局部组织定位。

浆细胞克隆群组沿回肠长度的非均匀分布： 将回肠条带分为近端、中部和远端区域后，研究人员鉴定出57个在特定区域显著富集的克隆群组ID。例如，IGHV1-G/IGKV8-24（克隆15）和IGHV1-G/IGKV1-88（克隆35）富集于近端回肠，IGHV1-G/IGKV9-119（克隆10）和IGHV1-G/IGKV8-21（克隆11）富集于中部回肠，IGHV1-G/IGKV12-49（克隆14）富集于远端回肠。局部共现分析进一步揭示了多种克隆群组具有特定的成对空间共富集现象，例如克隆11和克隆21的细胞倾向于与其同克隆细胞相邻分布，形成沿回肠的斑块状分布。第二条条带中虽涉及不同克隆群组，但观察到相似模式，提示这种克隆性的空间斑块性可能是健康小鼠IgA分布的普遍特性。

五、讨论与结论

BCR-MERFISH相对于现有空间克隆性追踪工具具有多项互补优势：相对于Confetti等显微方法，BCR-MERFISH可区分的克隆数量更多且无需遗传修饰；相对于空间捕获类方法，具有高分子检测效率、真正的单细胞分辨率以及高成像通量支持的大规模细胞表征能力。然而，BCR-MERFISH目前存在局限性：其提供的BCR序列定义有限，不包含D或J使用情况或CDR3序列，而这些对于精细克隆谱系重建和抗体生成及抗原亲和力测定均属重要信息。研究人员指出，未来可通过与BCR-seq或空间捕获方法联用以将完整序列定义与空间位置关联，也可通过信号放大方法将BCR-MERFISH扩展至表达水平较低的初始B细胞或T细胞的TCR检测。研究结论表明，BCR-MERFISH及其未来扩展可能为从正常组织到疾病状态等多种背景下的适应性免疫研究提供新途径。