CD44v3 介导的 TrkA 过表达耐药机制及联合疗法治疗三阴性乳腺癌脑转移的研究

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Targeting CD44v3 rescues Entrectinib response in brain metastasis of triple negative breast cancer overexpressing TrkA

　　

尊敬的编辑：

原肌球蛋白受体激酶A（TrkA，由基因NTRK1编码）在实体瘤中经常过度表达，包括乳腺癌，并且与不良预后和治疗耐药性相关。虽然FDA批准的Trk抑制剂（如Entrectinib）对NTRK基因融合表现出显著的疗效，但它们在Trk过度表达的肿瘤中的活性有限

我们研究了跨膜糖蛋白CD44变体3（CD44v3）的假设，先前已显示它与TrkA的细胞外亮氨酸富集区相互作用，它通过促进TrkA在低NGF条件下的活性，并以TrkA依赖的方式促进下游信号传导（包括RhoA的激活）来促成这种耐药性。我们使用过度表达TrkA的三阴性乳腺癌（TNBC）MDA-MB-231细胞（这些细胞具有转移潜力）来评估CD44v3对TrkA信号传导的贡献及其作为脑转移联合治疗的潜力。

临床数据库分析显示，与无微转移的患者相比，NTRK1在具有微转移病灶的患者中的表达更丰富（见图1a）。该小组之前的研究表明，亲本MDA-MB-231细胞在这个模型中具有转移性，而TrkA的过度表达进一步增强了转移，特别是向脑部的转移。此外，虽然在克隆生测中亲本细胞被Entrectinib抑制（见图1b），但TrkA过表达细胞表现出明显的耐药性。在MDA-MB-231 HA-TrkA细胞中，Entrectinib减少了TrkA激酶结构域的磷酸化，但只有在浓度高出NTRK1融合阳性模型有效浓度的10倍以上时才有效，这表明在TrkA过表达的TNBC中存在维持TrkA信号传导的机制（数据未显示）。

图1

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靶向CD44v3可以恢复TrkA过表达的三阴性乳腺癌脑转移中对Entrectinib的反应。aNTRK1表达与微转移疾病之间的临床关联。通过免疫组化检测到的具有微转移的患者百分比，在NTRK1低表达组和NTRK1高表达组之间。bTrkA的过度表达与体外对Entrectinib的耐药性相关。使用逐渐增加浓度的Entrectinib处理的MDA-MB-231野生型和MDA-MB-231 HA-TrkA细胞的克隆形成实验（n = 3）。cCD44v3的C端区域在亚纳摩尔浓度的NGF条件下促进了TrkA的磷酸化。在MDA-MB-231 HA-TrkA细胞（n = 3）、BT-549 HA-TrkA细胞（n = 3）和过表达TrkA的COS-7细胞中，用scrambled肽对照（SP）或CD44v3衍生的肽P4（50 ng/mL，30分钟）以及不同亚纳摩尔浓度的NGF处理后，检测pTrkA、总TrkA和actin的Western印迹（pTrkA印迹下方显示了相对于总TrkA的密度定量）。dCD44v3 C端肽增强了Entrectinib对TrkA过表达TNBC模型中脑微转移的穿透效果。通过PCR检测人类β2-微球蛋白（hβ2M）评估具有可检测肺或脑微转移的小鼠百分比（每组6只）。由于各组之间的肺转移评分已饱和，因此该图表不允许定量比较肺转移负担，也不能用来推断器官特定的治疗效果

Western印迹分析显示，CD44v3的C端区域（称为P4）与MDA-MB-231和BT-549这些过表达TrkA的TNBC细胞系中亚纳摩尔浓度NGF条件下pTrkA的增加有关，这一点通过密度定量得到了证实（见图1c）。此外，pTrkA/HA-TrkA比率的密度定量显示，在1 nM NGF存在下P4时pTrkA显著增加（见pTrkA印迹下方）。在缺乏内源性CD44的COS-7过表达TrkA细胞中，只有在P4存在时才观察到磷酸化，这支持了该肽在亚纳摩尔浓度NGF条件下促进TrkA激活的结论。在我们的实验条件下，相当于30分钟NGF（16 nM）处理，Entrectinib抑制了NGF诱导的TrkA和Akt磷酸化，即使在P4存在的情况下也是如此（数据未显示），与这种信号状态仍然依赖于TrkA的解读一致。NGF增加了RhoA的活性，而Entrectinib或P4单独使用可以将RhoA活性恢复到对照组水平，而P4和Entrectinib的组合治疗则进一步降低了基础RhoA的活性（数据未显示）。总的来说，这些观察结果支持了CD44v3衍生的P4调节TrkA过表达TNBC细胞中TrkA依赖性信号传导状态的解读。更具体地说，这种信号传导似乎依赖于TrkA/CD44v3的结合（这被P4破坏）以及TrkA的磷酸化（这被entrectinib抑制）。

为了评估P4和Entrectinib在富NGF微环境中的转移效应，将MDA-MB-231 HA-TrkA细胞皮下移植到NOD SCID小鼠体内，这些小鼠发生了肺和脑转移。单独使用P4或Entrectinib对转移负担的影响有限，而Entrectinib和P4的组合使这种模型中的脑微转移穿透率降低了近80%（见图1d）。相比之下，所有组都检测到了肺转移病灶。由于肺转移的评估基于一个在组间饱和的二进制穿透评分，这些数据不允许定量评估肺转移负担，也不能用来推断器官特定的治疗效果。因此，当前结果表明这种模型中的脑微转移穿透率降低了，而需要进一步的研究，包括定量评估肺结节、监测原发肿瘤生长和进行纵向成像，以确定治疗效果是否在不同器官之间存在差异。对患者来源的脑转移进行单细胞转录组分析证实了CD44和RhoA在CD45阴性细胞中的表达较高，这些细胞对应于非造血成分，与健康脑组织相比（数据未显示），进一步支持了这一信号通路在脑转移中的临床相关性。

总的来说，这些发现揭示了一种涉及CD44v3的Trk抑制剂耐药机制。通过增强NGF/TrkA信号传导并调节TrkA激活的阈值和效率，来自CD44v3 C端区域的模拟肽调整了TrkA通路活性，并改善了这种脑转移临床前模型中对Trk抑制的反应。尽管本研究主要调查了Akt这一下游通路，但其他TrkA依赖的信号级联（如MAPK/ERK和PLCγ）也可能对观察到的表型有所贡献。这些发现支持TrkA-CD44v3轴是TrkA过表达TNBC的一个潜在治疗靶点，但需要进一步的研究来评估耐受性、器官特异性效应和体内反应的细胞基础。

统计分析使用学生t检验（两组）或单因素ANOVA后跟Tukey事后检验（超过两组）进行。数据以均值±SEM表示；统计显著性表示为

p < 0.05、p < 0.01、p* < 0.001、p < 0.0001。