AXIN1组装体与微管的结合抑制Wnt/β-catenin信号

《EMBO JOURNAL》：Association of AXIN1 assemblies with microtubules inhibits Wnt/β-catenin signaling

　　

Wnt/β-catenin信号通路（Wnt/β-catenin pathway）在细胞增殖和分化中起关键作用。AXIN1是通路的关键抑制因子，在细胞质中充当β-catenin降解复合体（β-catenin destruction complex）的支架；通路激活需要AXIN1的膜募集以及DVL对AXIN1的抑制作用。在本研究中，研究人员发现Wnt信号与细胞骨架之间的相互作用，该作用由AXIN1通过带正电荷的结合位点直接结合微管（microtubules）所介导。微管相互作用范围从外周附着的AXIN1凝聚体到紧密束缚的纤维状组装体，后者受CK1依赖性磷酸化（CK1-dependent phosphorylation）抑制。微管结合使AXIN1支架聚合物更稳定、更静止，有利于降解复合体组装。同时，微管结合还拮抗DVL对AXIN1的抑制，如其对AXIN1蛋白相互作用和膜募集以及对β-catenin降解的影响所示。药理学或遗传学抑制内源性AXIN1的微管结合可在多种细胞系统中激活Wnt/β-catenin信号。此外，一种为竞争性阻断AXIN1与微管相互作用而设计的细胞渗透性肽能增强Wnt信号，并刺激Wnt信号依赖性成骨细胞分化。总之，AXIN1介导的β-catenin降解复合体在微管上的锚定抑制Wnt信号，提示该机制可作为药理学调控的靶点。

Wnt/β-catenin信号通路是进化上保守的调控细胞增殖与分化的核心通路。通路过度激活可驱动结直肠癌等恶性肿瘤，而活性降低则与阿尔茨海默病、骨质疏松等疾病相关。在静息状态下，细胞质中的支架蛋白AXIN1与APC、CK1α、GSK3等组装成β-catenin降解复合体（β-catenin destruction complex），促进β-catenin磷酸化并降解。Wnt配体刺激后，DVL将AXIN1招募至质膜受体处形成信号体，抑制降解复合体，从而稳定β-catenin。尽管质膜信号体的定位机制已较明确，但细胞质中降解复合体的亚细胞锚定方式仍不清楚。APC已被发现有微管结合位点，提示微管可能参与降解复合体的定位，但AXIN1是否直接结合微管以及该相互作用的功能意义尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究。

研究人员发现AXIN1通过C端带正电荷的碱性残基阵列直接与微管结合，该结合使AXIN1聚合物更稳定、更静止，从而促进β-catenin降解复合体组装，并拮抗DVL对AXIN1的抑制。破坏该相互作用可激活Wnt信号，且细胞渗透性肽R9-MTB可通过竞争性阻断该结合激活Wnt信号并诱导成骨细胞分化。研究揭示了微管锚定AXIN1作为Wnt通路抑制机制，提供了新的药理学干预靶点，可能为骨质疏松等疾病提供中等强度激活Wnt通路的策略。

研究人员主要运用了以下关键方法：利用U2OS、HEK293T、DLD1、SW480、T-REx及小鼠骨髓基质ST-2细胞系，通过免疫荧光和超分辨显微镜观察AXIN1与微管的共定位；通过微管结合蛋白沉降实验证明重组AXIN1蛋白与微管的直接结合；采用缺失突变和点突变鉴定微管结合位点，并利用CRISPR/Cas9对内源AXIN1进行基因编辑；使用荧光漂白恢复（FRAP）和活细胞成像分析AXIN1聚合物的动力学与运动性；通过TOP/FOP荧光素酶报告基因检测β-catenin依赖性转录活性；通过ST-2细胞碱性磷酸酶染色评估成骨分化。此外，还使用siRNA和药理学抑制剂干扰特定蛋白功能。

**The Wnt pathway-inhibitor AXIN1 interacts with microtubules**：研究人员发现，共表达胞质PGAM5或抑制CK1可使AXIN1由球状凝聚体转变为纤维状聚合物，该纤维与微管共定位，而微管解聚剂nocodazole或冷处理可消除纤维形成。超分辨显微镜进一步显示，AXIN1凝聚体也外周附着于微管。这表明AXIN1聚合物与微管存在物理关联。

**AXIN1 directly binds to microtubules through an array of basic residues**：通过缺失突变和序列比对，鉴定出AXIN1第714–741位氨基酸区域中的8个碱性残基为关键微管结合位点。微管结合蛋白沉降实验证明重组AXIN1蛋白可直接结合微管，而碱性残基突变（8A或8D）消除了该结合。DIX结构域介导AXIN1聚合，与微管结合协同形成纤维状组装体。

**AXIN1 condensates and fibrils are in a competitive equilibrium**：定量分析显示，AXIN1凝聚体和纤维的形成比例呈负相关。用1,6-己二醇破坏凝聚体可诱导纤维形成，而削弱微管结合则使平衡转向凝聚体。这表明两种多聚形式处于竞争性平衡状态。

**Microtubule-anchored AXIN1 polymers are more stable and stationary**：FRAP实验显示纤维状AXIN1的荧光恢复率显著低于凝聚体，表明分子交换减少。渗透冲击下纤维保持完整而凝聚体溶解。活细胞成像显示强微管锚定的凝聚体移动距离显著减小，且融合事件消失。因此，微管锚定增强了AXIN1聚合物的稳定性和静止性。

**Microtubule-anchoring of AXIN1 promotes Wnt pathway inhibition**：免疫荧光显示微管锚定的AXIN1纤维可招募β-catenin、APC、CK1α和GSK3β，并可检测到磷酸化β-catenin。DVL被排斥在纤维之外。微管结合缺陷的AXIN1突变体在DVL存在时表现出更强的膜募集、更弱的β-catenin降解能力和更低的通路抑制活性。破坏内源性AXIN1与微管的结合（nocodazole处理、CRISPR编辑或MTB竞争性过表达）可激活Wnt/β-catenin信号，而AXIN1敲除细胞中该激活效应减弱。

**An AXIN1 MTB peptide promotes Wnt signaling and osteoblast differentiation**：研究人员设计了细胞渗透性融合肽R9-MTB，其可竞争性阻断AXIN1与微管结合。R9-MTB处理DLD1和T-REx细胞可剂量依赖地激活Wnt信号，而微管结合缺陷的8D对照肽无效。在ST-2细胞中，R9-MTB增加活性β-catenin水平并诱导碱性磷酸酶表达，提示其促进成骨分化。

讨论部分指出，微管锚定通过增加AXIN1支架聚合物稳定性并拮抗DVL介导的膜募集，从而增强β-catenin降解复合体活性，抑制Wnt信号。该机制可能通过有丝分裂期间微管重排释放AXIN1而参与Wnt/STOP信号（Wnt-dependent stabilization of proteins）。此外，AXIN1微管结合位点的进化保守性和磷酸化调控支持其功能重要性。研究结论为：AXIN1介导的β-catenin降解复合体在微管上的锚定抑制Wnt信号，提示该机制可作为药理学调控的靶点。