深海贻贝细胞培养中的内源性节律与分子时钟特征解析

《EMBO REPORTS》：Endogenous rhythms in deep-sea mussel cell culture and molecular clock characterization

尽管生物节律对生命至关重要，深海长期被视为无节律的例外。然而，在缺乏昼夜线索但受潮汐驱动的大西洋中脊热液喷口（水深?1700 m），贻贝Bathymodiolus azoricus展现出潮汐节律以及出乎意料的昼夜节律。内源性时钟是否驱动这些周期仍未有答案。本研究报道了B. azoricus细胞培养在恒定条件下的内源性昼夜节律：尽管自然环境以潮汐节律为主导，分离的细胞仍显示昼夜振荡。利用含E-box基序的per基因上游基因组区域进行报告基因检测，提示功能性转录-翻译反馈环路（transcription–translation feedback loop, TTFL）即使在深海也参与昼夜节律计时。在贻贝中，BazPeriod缺乏自主抑制活性但可调节BazCry2。由于BazPeriod本身呈潮汐振荡，这可能解释单一内源性时钟如何同时产生潮汐和昼夜节律。该工作也凸显了 vastly unexplored 深海环境中高度时间敏感的生物学。

【研究背景与问题】深海占海洋总体积90%以上，长期被认为是寒冷、黑暗且无节律的环境。然而热液喷口虽无昼夜光线线索，却受潮汐驱动，形成高度动态但可预测的化学景观。生态关键种深海贻贝Bathymodiolus azoricus分布于大西洋中脊840–3350 m深处，前期研究表明其在?1688 m自然栖息地以潮汐节律（12.4 h）为主导，同时存在显著的昼夜节律信号；而在实验室12:12光暗循环下则主要表现为昼夜节律并保留潮汐节律。在无已知昼夜循环的深海出现弱昼夜信号、在无潮汐信号的实验室出现潮汐信号，提示这些节律可能由一个或两个内源性时钟驱动。但内源性时钟是否驱动这些周期此前未被验证。研究人员据此提出假设：B. azoricus核心昼夜钟基因可能构成TTFL，且其外周组织可能存在潮汐和/或昼夜时钟，并利用原代细胞培养在组织层面探究深海贻贝时钟机制。

【研究方法概述】研究人员从Lucky Strike热液喷口（约?1700 m）采集B. azoricus，在实验室常压下长期维持并建立足、鳃、外套膜等多组织原代细胞培养；对足细胞培养在恒定黑暗条件下进行48 h时间序列转录组测序（SMART-Seq3）并以RAIN算法检测节律性转录本；通过RT-qPCR检测BazCry2和BazPer表达；克隆核心时钟基因，基于三种深海贻贝基因组比对鉴定per上游保守增强子区块并构建荧光素酶报告载体，在果蝇S2细胞中进行异源荧光素酶报告检测与定点突变；通过Western blot和免疫细胞化学评估BazPER对BazCRY2蛋白稳定性及核定位的影响。

【研究结果】（1）实验室长期维持体系的建立：首批贻贝在实验室最长存活12天；改进系统后，2023年采集的贻贝在150 L水族箱中经红色滤光片遮蔽白光，剩余个体在实验室存活13个月，表现健康并偶有移动、规律开壳和伸足，显著拓展了该物种的实验室研究能力。（2）B. azoricus细胞培养的建立：测试足、鳃、外套膜、外套膜边缘、消化腺和肌肉解离细胞及4、8、25 °C培养温度，足细胞最为可行，呈圆形、直径3.8 ± 0.2 μm，可黏附于孔板底部；培养身份经PCR及测序确认，两株培养物维持超过3.5年。（3）足细胞培养转录组中可检测到昼夜节律：恒定条件下每4 h采样连续2天，RAIN鉴定出157个昼夜节律转录本，其中66个此前在深海或实验室鳃RNAseq中已被鉴定为节律性、40个 specifically 为昼夜或昼夜节律性；随机置换检验（10,000次 bootstrap）中实际数据集始终优于随机数据，无一随机数据集达到≥157个昼夜转录本，强烈支持游离运行细胞培养中存在昼夜节律转录本及深海贻贝细胞中的昼夜时钟；GO富集显示大分子/肽/酰胺生物合成、基因表达调控、结构组织和自噬等35个术语显著富集。潮汐范围鉴定出109个转录本，但相对随机无显著富集。（4）B. azoricus昼夜时钟基因具有功能：在三种深海贻贝基因组中鉴定出per上游两个含CACGTG E-box的保守区块（Block 108和Block 118），并从B. azoricus克隆相应区域；S2细胞荧光素酶检测显示BazClock和BazBmal可激活含Block 118的构建体，Block 108单独无激活作用；定点突变表明E-box-like 1对转录激活至关重要，突变该基序即 abolish 荧光素酶信号。（5）BazCry2为主要转录抑制因子并受BazPer和BazTim调节：BazCry2剂量依赖性显著抑制荧光素酶激活，而BazPer、BazTim、BazCry1单独或组合均无抑制/激活作用；BazPer与低浓度BazCry2共转染显示协同抑制，表明BazPer可调节BazCry2的抑制；BazTim则阻断BazPer介导的额外抑制。Western blot显示BazPER显著稳定BazCRY2蛋白；免疫细胞化学定量表明BazCry2与BazPer共转染时BazCRY2核/质信号比值升高，提示BazPER促进BazCRY2核内稳定或核输入/滞留。

【讨论与结论】讨论部分指出，将?1700 m深海贻贝在常压下维持超过1年对该物种属前所未有，死亡率主要集中于第一个月，反映减压和运输的急性应激，此后趋于平稳，提示深海动物对持续表面压力具有更大的耐受可塑性。足细胞转录本中昼夜节律占2.8%，与深海海底比例（2.5%）相近；核心时钟基因未被RNAseq捕获，与其在鳃中本就低表达一致。潮汐节律缺失可能源于培养条件：BazCry2在培养前足组织和培养细胞中均可检测，而BazPer仅在组织中检测到，提示潮汐节律细胞可能未在培养中存活，或潮汐表达机制在当前培养条件下不活跃。荧光素酶实验表明B. azoricus时钟基因相互作用可能在TTFL框架内运作但具有物种特异性修饰；Cry2作为主要剂量依赖性抑制因子，与帝王蝶、小鼠和等足类相似，而BazPer单独不抑制、可增强BazCry2抑制、BazTim可拮抗BazPer效应，与磷虾和帝王蝶观察一致。鉴于per而非cry2转录本在自然和实验室条件下呈潮汐变化，研究人员提出BazPer通过调节BazCry2，可在单一细胞内根据BazPer/BazCry2相对丰度使时钟在昼夜与潮汐信号间切换，或潮汐与昼夜调控环路在不同细胞中运作，该模型可兼容Enright单时钟假说与Naylor双时钟假说。研究结论译为：研究表明深海贻贝组织培养展现出显著的细胞自主昼夜转录周期，鉴于其栖息地以潮汐而非昼夜循环为主导，这一发现出乎意料；利用B. azoricus增强子的异源检测提示BazPer可调节BazCry2——贻贝细胞时钟的主要抑制因子；高CRY2浓度和/或TIM存在可使PER影响可忽略，而较低CRY2浓度则允许PER影响核心环路动态，鉴于per转录本在自然和实验室中呈潮汐节律尤为值得关注；这可能指示昼夜时钟如何以组织自主、不依赖神经系统的方式在周期之间切换；总体而言，该生态关键深海物种的工作为探索生命如何适应极端条件开辟了新途径，在这些环境中正确的时间安排决定生死。