基于钙网蛋白（Calreticulin）的马萨诸塞州白纹伊蚊（Culex restuans）RT-qPCR内源性对照的开发

《Insects》：Development of a Calreticulin-Based Endogenous Control for Use in Culex restuans RT-qPCR Assays in Massachusetts

吸血节肢动物及其相关病原体在全球范围内的流行率正日益上升。在治疗手段有限的情况下，预防是降低疾病负担的首要策略。逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）已成为许多实验室的标准检测方法，但该方法存在若干缺陷。样本质量下降、RNA制备失败以及反应抑制剂的存在均可导致假阴性结果，因此需要引入阳性对照。现有的对照方法依赖于在扩增反应中加入外源性核苷酸，可能无法反映样本的实际质量。纳入检测蚊子内源性mRNA转录本的试验可确保样本质量足以支持下游病原体RNA的扩增。在本研究中，研究人员应用cDNA末端快速扩增（RACE）技术，从采集于美国马萨诸塞州的白纹伊蚊（Culex restuans）中获得了全长钙网蛋白（calreticulin）cDNA序列。随后，研究人员利用新发现的cDNA序列设计了跨越钙网蛋白基因第一个外显子-外显子连接处的引物和探针，从而在RT-qPCR试验中实现特异且准确的RNA转录本检测。该试验在提取的蚊子RNA池中检测到了钙网蛋白转录本的存在。该方法可进一步拓展至其他相关蚊种，并经过广泛验证后，有望作为内源性对照应用于虫媒病毒监测。

虫媒病毒（arbovirus）所致疾病在全球范围内持续扩张，仅虫媒病毒每年即造成数亿例感染和高达70万例死亡。在治疗手段有限的背景下，准确的监测与检测工具对于公共卫生机构集中防控资源至关重要。RT-qPCR因其高灵敏度和高特异性已成为虫媒病毒RNA检测的核心方法，但样本RNA降解、提取失败及反应抑制剂等因素可导致假阴性结果。现有外源性对照（如质粒或装甲RNA）仅能覆盖扩增步骤，无法反映样本中病原体RNA的完整性和质量；而常用的核糖体RNA（rRNA）内源性对照因DNA与RNA序列相同，难以排除基因组DNA污染的干扰。为此，研究人员以钙网蛋白（calreticulin）基因为候选靶标，该基因在物种间进化保守、表达稳定且含有内含子，可用于设计跨越外显子-外显子连接处的引物和探针，从而实现RNA特异性检测。研究人员从美国马萨诸塞州Palmer采集白纹伊蚊（Culex restuans），利用RACE技术获取钙网蛋白全长cDNA序列（GenBank登录号PZ334400），并据此设计TaqMan RT-qPCR引物和探针，跨越第一个外显子-外显子连接处，建立内源性对照检测方法，并在个体蚊、蚊池及西尼罗病毒（WNV）阳性样本中进行了验证。研究结论表明，该基于钙网蛋白转录本的内源性对照可有效指示RNA提取和扩增的成功与否，且不扩增基因组DNA，为虫媒病毒监测中减少假阴性结果提供了概念验证。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：利用CDC小型灯光诱捕器和产卵诱捕器采集蚊子并以形态学检索表进行物种鉴定，通过ITS1/ITS2四引物PCR进行分子确认；使用RNeasy Mini Kit提取总RNA，并以SMARTer RACE 5′/3′试剂盒进行5′-和3′-RACE cDNA合成；采用Touchdown PCR和半巢式PCR（snPCR）扩增钙网蛋白片段，经Oxford Nanopore技术测序后以Sequencher软件组装全长cDNA；通过BioEdit比对28种已知蚊种钙网蛋白基因组序列定位第一个内含子；利用gBlock?合成片段优化引物和探针浓度，并在Agilent MX3000P qPCR系统上建立TaqMan RT-qPCR试验；采用马萨诸塞州常规詹姆斯敦峡谷病毒（JCV）监测存档的48份Cx. pipiens/restuans蚊池和1份Culex spp.蚊池进行检测，并以26份其他蚊种蚊池、7份单蚊样本、18份蜱池及草、小鼠和人核酸评估特异性；利用6份经细胞培养和RT-qPCR确认的WNV阳性Cx. restuans蚊池进行模拟降解实验（RNase/DNase处理及稀释系列）。样本队列来源为马萨诸塞州Palmer采集的蚊虫及CAES提供的WNV阳性样本。

研究结果如下：

3.1 RACE反应：5′-RACE和3′-RACE产物分别约为1.1 kb和1.5 kb，内引物产物较外引物短约50 bp，无模板对照无条带，小鼠心脏总RNA阳性对照产生预期长度条带，证实RACE扩增特异性良好。

3.2 测序：通过5′-和3′-RACE获得白纹伊蚊钙网蛋白全长cDNA，5′-RACE产物985 bp，3′-RACE产物1490 bp，拼接后 consensus 序列2053 bp，开放阅读框（ORF）1227 bp，编码409个氨基酸，起始密码子ATG，终止密码子TAA；观察到4个多态性位点对应两个等位变异，重叠区外另有14个多态性位点；第一个内含子位于起始密码子下游88至89 bp之间，全长110 bp（GenBank登录号PZ334401）。

3.3 逆转录qPCR：探针靶向跨越外显子1和2连接处的30 bp区域，起始于起始密码子下游69位；引物和探针最佳浓度均为100 nM；个体白纹伊蚊RNA提取物显示清晰的指数扩增曲线，Ct值范围16.48至19.93，DNA提取物无扩增曲线，证实RNA特异性；所有蚊池均显示阳性扩增信号，Ct值范围21.89至30.91，平均Ct为25.41，无模板对照无Ct，阳性对照Ct为19.93；蚊池大小与Ct的Spearman相关系数ρ=?0.23（95% CI：?0.49至0.06），无显著相关性（p=0.112）；特异性测试显示除白纹伊蚊外，Cx. pipiens和Cx. salinarius分别以Ct值17.67和29.37扩增，其余样本（包括Cx. erraticus和Cx. territans）均未扩增；标准曲线基于gBlock?系列稀释（1.568×10⁹至1.568×10¹拷贝/反应），线性范围1.568×10⁸至1.568×10²拷贝/反应，r²=0.996，扩增效率91.9%，标准曲线Y=?3.533*log(X)+38.43，最低定量限为1.568×10²拷贝/反应，1.568×10¹拷贝/反应仍可检测但呈非线性。

3.4 病毒阳性样本模拟降解实验：稀释系列显示宿主和病毒RNA在Ct值高于30时均可检出，1000×稀释时宿主RNA仍可扩增而病毒RNA不可检出，10000×稀释时宿主RNA不可检出；RNase处理样本钙网蛋白和WNV均无Ct值，DNase处理样本两者均有Ct值，证实试验的RNA特异性。

讨论部分总结：该RT-qPCR试验作为控制白纹伊蚊RNA质量的概念验证具有良好前景，目标用途为成年雌蚊，因该性别和生命阶段对人类健康构成风险。钙网蛋白基因因其普遍性、必需性和外显子-外显子连接结构而成为理想靶标。既往对埃及伊蚊（Aedes aegypti）的研究表明钙网蛋白在吸血和未吸血雌蚊的唾液腺、中肠、卵巢和脂肪体中稳定表达，但登革病毒感染后唾液腺中钙网蛋白表达显著升高。使用跨越外显子-外显子连接处的探针作为内源性对照并非全新概念，但迄今蚊虫样本的内源性对照尚未应用此方法确保RT-qPCR扩增的RNA特异性，也未利用钙网蛋白基因。研究首次从白纹伊蚊中生成全长钙网蛋白基因序列，并通过测序确认内含子位置。该内源性对照在个体蚊和蚊池提取物中均表现符合预期，Ct值差异可能归因于蚊池大小和组成以及采集、鉴定和储存过程中处理方法的差异；蚊池大小并非最大影响因素，混合蚊池的组成无法辨别可能抵消了蚊池大小的影响。特异性测试显示Cx. pipiens和Cx. salinarius亦可扩增，但这并不影响该试验的使用，因其并非设计为物种特异性TaqMan试验；同属的Cx. erraticus和Cx. territans未扩增，未来可对这些物种钙网蛋白进行测序以揭示引物和探针退火位置的碱基组成差异。标准曲线基于gBlock?而非RNA，因此评估的是PCR扩增组分而非逆转录过程中的变异，报告的定量限应解释为扩增步骤的分析性能而非完整RNA检测流程的灵敏度。该试验可在1.568×10⁸至1.568×10²拷贝的线性范围内检测合成gBlock?片段，1.568×10¹拷贝虽可检测但超出线性范围。40个循环内显示清晰扩增曲线和正常RFU值的Ct值可解释为阳性结果，Ct值高于35的结果建议做三次重复以确认一致性扩增。WNV阳性蚊池验证显示该试验在病毒RNA存在时仍可扩增宿主RNA，1000×稀释时病毒RNA不可检出而宿主RNA仍可检出，RNase处理使两者均不可检出，DNase处理两者均可检出，证实RNA特异性。未来拟开发多重格式，但需在常规虫媒病毒监测中应用前验证灵敏度和Ct值变化特征；由于成本效益考虑，大多数qPCR试验使用FAM报告染料，后续迭代需更换染料以适用于多重检测。本研究未评估该内源性对照在常规监测中可能遇到的污染物条件下的表现，但Xu等在蜱样本中证明相同设计的试验可检测导致假阴性的提取失败或抑制性污染。

研究结论翻译：本研究证明了一个概念验证，即内源性mRNA转录本可用于控制RNA质量而无需外源性掺入对照，其优势在于可在实验室处理前确保样本质量。既往方法利用rRNA和内 exon 靶标，而本研究设计的独特之处在于跨越外显子-外显子连接处的探针，提供RNA特异性而不扩增DNA。研究人员对白纹伊蚊应用RACE技术生成全长钙网蛋白cDNA序列，作为开发跨越外显子-外显子连接处RT-qPCR探针的基础。所开发的试验成功检测了所有测试样本中白纹伊蚊的钙网蛋白转录本而未扩增DNA。在常规病原体监测中部署该试验并确定具体局限性尚需进一步验证。利用已建立的工作流程，研究人员希望将该试验扩展至检测该地区其他蚊种的钙网蛋白转录本。