在类风湿性关节炎中，DNA甲基化的表观遗传重塑调节了滑膜巨噬细胞与类纤维母细胞滑膜细胞的相互作用

《Autoimmunity Reviews》：Epigenetic remodelling of DNA methylation shapes synovial macrophage–fibroblast-like synoviocytes crosstalk in rheumatoid arthritis

**摘要**
巨噬细胞和类成纤维细胞滑膜细胞（FLSs）是类风湿性关节炎（RA）滑膜微环境中的关键细胞组成部分，它们共同构成了一个致病性生态位，驱动免疫浸润、滑膜增生和关节破坏。在生理条件下，巨噬细胞有助于维持滑膜免疫平衡和基质稳态。然而，在RA中，巨噬细胞与FLSs之间的相互作用失调会放大炎症信号传导，促进侵袭性表型，并通过自我强化的反馈机制持续引发慢性滑膜炎。这些过程与表观遗传重塑密切相关，而表观遗传重塑可能先于疾病的临床表现出现。在RA中，异常的DNA甲基化模式会重新编程与疾病相关的基因表达网络，涉及DNMT介导的甲基化、TET介导的主动去甲基化以及UHRF1的维持，从而影响疾病易感性、炎症持续性和组织侵袭性。此外，DNA甲基化还与其他调控层（包括RNA甲基化和组蛋白修饰）协同作用，塑造巨噬细胞与FLSs之间的相互作用的时间和空间异质性。因此，有必要探索新的治疗方法。针对DNA甲基化以调节炎症反应和侵袭性功能已在癌症治疗中显示出临床效果，并为特异性靶向滑膜巨噬细胞与FLSs之间的相互作用提供了可能性。因此，针对DNA甲基化驱动的巨噬细胞与FLSs之间的相互作用进行靶向治疗，可能是预防和治疗RA的一种有前景的方法。

**1. 引言**
类风湿性关节炎（RA）是一种全身性自身免疫疾病，其特征是慢性滑膜炎、侵袭性滑膜增生和进行性骨关节破坏。与骨关节炎（OA）相比，RA滑膜以大量免疫细胞浸润和类成纤维细胞滑膜细胞（FLSs）的扩张为特征，巨噬细胞和FLSs构成了持续引发局部炎症和促进关节损伤的核心致病模块[1],[2]。RA滑膜不仅处于激活的炎症状态，还经历了细胞组成、空间组织和细胞间通讯网络的深刻重塑[3],[4]。机制上，组织驻留巨噬细胞稳态的破坏以及巨噬细胞与FLSs之间相互作用的不平衡越来越多地被认为是RA早期滑膜病变建立和持续的原因[4],[5],[6]。这使得研究巨噬细胞与FLSs之间的相互作用机制变得尤为重要，这可能有助于RA的早期检测和治疗。在RA中，长期慢性炎症可以介导某些基因的表观遗传修饰[7],[8],[9]。其中，DNA甲基化是一种经典的表观遗传修饰方式，它可以通过免疫细胞介导滑膜组织重塑和疾病进展。具体来说，表现为DNA甲基化重编程，将持久记忆传递给应激敏感基因，并深刻影响组织在回忆过程中的适应性[10]以及组织驻留细胞的自主行为[11]。这为解释DNA甲基化重编程如何驱动RA疾病进展提供了新的视角。DNA甲基化（包括由DNA甲基转移酶（DNMTs）家族介导的5-甲基胞嘧啶（5mC）的甲基化和由Ten-eleven转位（TETs）家族蛋白主导的5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的甲基化）通常在基因启动子区域的CpG岛中富集，并与基因转录调控相关[14],[15]。与骨关节炎患者的 peripheral blood 相比，RA患者的 peripheral blood 中的 CpG 岛处于低甲基化状态[16]，并且多达1046个DNA甲基化位点与RA相关[17]。这些差异甲基化位点可以调节mRNA表达，形成干扰素诱导的基因相互作用网络[17]，并增加RA患者 peripheral circulation 中的炎症[18]。值得注意的是，RA患者 peripheral blood 和滑液中的单核细胞DNA甲基化不同，显示出组织异质性并与疾病活动性相关[19]。在RA患者的滑膜组织中，DNA甲基化处于局部高甲基化状态，这与关节肿胀程度尤其相关，特别是在RA-FLSs中。这种机制涉及在DNA甲基化和基因表达水平上免疫反应和细胞黏附通路的失调[20],[21]。RA中的DNA甲基化整合了炎症信号、代谢改变和分化信号，建立了持久的病理记忆，从而影响免疫细胞和基质细胞的命运决定和功能维持[22],[23]。现有证据表明，DNA甲基化在RA的临床诊断、预后生物标志物筛查以及体内和体外靶向治疗中显示出初步应用价值。与其他类型的关节炎相比，RA相关DNA甲基化的变化可以在早期阶段就被检测到[24],[25]。改变的甲基化位点可以预测疾病亚型和患者生存率[26]。类似异常也在RA相关并发症中报告过，包括间质性肺病，其中它们与单核细胞和肺泡巨噬细胞的基因表达失调密切相关[27]。与传统的抗炎治疗不同，最新研究发现，修改白细胞介素1受体拮抗基因（IL1RN）启动子的DNA甲基化状态足以改变人类髓系细胞的命运并改变细胞对炎症和致病刺激的反应[28]。因此，靶向特定DNA甲基化事件以直接调节免疫和炎症反应的潜力为干预RA的表观遗传修饰提供了原理证明。重要的是，靶向DNA甲基化调控因子或与疾病相关的甲基化位点已在动物模型和体外研究中显示出抑制炎症、限制滑膜侵袭性和减轻骨损伤的潜力[29],[30],[31]。RA患者 peripheral blood 中的差异DNA甲基化与甲氨蝶呤反应相关[32]，并且具有细胞特异性[33]。在接受阿达利姆单抗[34]和肿瘤坏死因子抑制剂（TNFi）[35]治疗的RA患者中也报告了类似发现。这些发现表明，异常DNA甲基化不仅是RA的显著分子特征，也是一个具有疾病分层和治疗干预潜在价值的靶点[36],[37]。然而，目前对RA中DNA甲基化如何在时间和空间维度上重塑巨噬细胞与FLSs之间相互作用的理解仍然 fragmented。随着单细胞组学、空间转录组学和高分辨率甲基组谱技术的快速发展[36],[38],[39]，现在可以重新评估DNA甲基化在RA中的细胞类型特异性作用。在此基础上，我们讨论了DNA甲基化如何调节巨噬细胞与FLSs之间的相互作用，并驱动滑膜微环境的失衡，并概述了其作为RA患者早期预警、预后评估和精准干预工具的潜在临床价值。

**2. RA巨噬细胞和FLSs中的DNA甲基化**
5mC信号强度与参与甲基化过程的DNMTs和TETs家族基因的转录水平相关[40],[41]。临床研究表明，在1794名80岁及以上的个体中，大约三分之一的人有突变，这些突变与生存率下降有关[42]。其中，DNA甲基转移酶3alpha（DNMT3A）和ten-eleven转位2（TET2）的突变与RA相关，这种特定的突变模式可以区分髓系肿瘤的发病风险和炎症相关疾病[42]。DNMT3A和RA之间的特定基因型和血清阳性状态强调了DNA甲基化在RA诊断中的重要价值。此外，DNA甲基转移酶3 beita（DNMT3B）基因的-283C/T多态性已被证实是与RA关节破坏相关的遗传标志物[44]。因此，RA中不同组织和细胞来源（尤其是巨噬细胞和FLSs）中的DNA甲基化与疾病之间的关系值得深入探索。

**2.1. 滑膜巨噬细胞中的DNA甲基化**
在炎症模型中，DNA甲基化可以通过破坏线粒体稳态将代谢损伤转化为持续的先天免疫激活[45],[46]。DNA甲基化主要涉及DNMTs家族、TETs家族以及具有PHD和环指结构域1（UHRF1）的读取蛋白，这些因子共同建立、维持、解释和重塑DNA甲基化状态[47],[48]。在LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞中，DNA甲基转移酶1（DNMT1）通过增强TFAM（转录因子A，线粒体）启动子的甲基化来抑制TFAM的表达，从而导致线粒体功能障碍、细胞质mtDNA释放和cGAS（环腺苷酸-AMP合成酶）-干扰素基因刺激因子（STING）通路的激活[49]。DNMT1敲低可以恢复TFAM表达并减弱mtDNA依赖的cGAS–STING信号传导，而TFAM沉默或cGAS重组则逆转了这些保护作用[49]。此外，DNMT3A和TET2在TFAM调控区域与RBPJ和ZNF143合作以维持mtDNA完整性；失去这些因子中的任何一个都足以诱导I型干扰素反应，进一步支持DNA甲基化和去甲基化通路共同维持巨噬细胞中线粒体-先天免疫稳态的观点[50]。尽管这些发现主要来自炎症模型，但它们为理解RA患者滑膜巨噬细胞如何获取和维持持续促炎状态提供了重要的机制框架。DNA甲基化还参与调节巨噬细胞极化及其细胞间通讯[45],[46]。在白细胞介素4（IL4）诱导的巨噬细胞中，lncRNA Dnmt3aos高度表达，可以通过调节DNMT3A水平来塑造交替激活的表型，从而改变极化相关基因的甲基化状态[51]。在细胞间通讯方面，脂多糖（LPS）暴露促进DNMT相关mRNAs包装成细胞外囊泡并转移到受体细胞中，导致旁分泌甲基化改变和炎症基因的沉默[45]。此外，SIRT1/2和DNMT3B的协同作用以及UHRF1介导的巨噬细胞迁移抑制因子转录调控表明，DNA甲基化网络可能通过转录因子和相关分泌因子轴进一步影响巨噬细胞与FLSs之间的炎症通讯[50],[52],[53],[54]。除了平衡DNMT介导的甲基化外，TET家族介导的5mC氧化（5hmC）在巨噬细胞炎症调节中也起着关键作用。TET蛋白以Fe（II）和α-酮戊二酸依赖的方式依次将5mC氧化为5hmC、5fC和5caC，从而生成活性或被动DNA去甲基化的中间体[9],[55],[56]。其中，TET2通常起到抑制炎症的作用：TET2缺陷的巨噬细胞对LPS的反应增强，并通过let-7adf–Lin28a/Sdha–琥珀酸轴放大白细胞介素6（IL6）的表达[57]。相比之下，tet甲基胞嘧啶双加氧酶3（TET3）的作用似乎更具情境依赖性。一方面，TET3过表达与几种慢性炎症相关疾病中的致病性巨噬细胞状态维持有关[58]。另一方面，在单核细胞分化水平上，miR-150/TET3轴调节非经典单核细胞的丰度，其扩张与RA相关的骨破坏和肺部并发症有关[59],[60],[61]。这些观察表明，TET3在RA相关的单核细胞-巨噬细胞系统中可能发挥双重作用，这取决于谱系背景和组织微环境。总体而言，DNA甲基化和去甲基化并不简单地决定促炎或抗炎巨噬细胞状态；相反，通过协调线粒体稳态、代谢途径、分化轨迹和细胞间通讯，它们共同塑造了RA滑膜中巨噬细胞的持续致病表型。

**2.2. 滑膜FLSs中的DNA甲基化**
RA FLSs表现出稳定的DNA甲基化异常，这些异常不仅反映了慢性炎症暴露，还直接促进了凋亡抵抗、迁移和侵袭行为以及持续的促炎分泌表型[62],[63],[64],[65]。作为维持DNA甲基化的因素，RA滑膜中UHRF1的表达与DAS28评分、CRP水平、Th17细胞积累和FLSs的凋亡抵抗呈负相关[66]。功能研究进一步表明，UHRF1的丧失增强了FLSs的凋亡抵抗，并上调了炎症介质（如CC motif趋化因子配体20（CCL20）的表达，最终加剧了小鼠的关节损伤[66]。相比之下，与DNA去甲基化相关的酶TET3及其产生的5hmC在RA滑膜组织和滑膜来源的FLSs中显著增加[29],[67]。肿瘤坏死因子-α（TNFα）刺激进一步增加了FLSs中的TET3表达和5hmC水平，并增强了它们的迁移能力；这种效应伴随着迁移相关基因（包括CXCL8和CCL2）转录水平的增加，至少部分依赖于TET3活性[67]。此外，TET3通过在MTRNR2L2启动子处促进5hmC积累发挥促炎作用，而TET3单倍不足在CAIA模型中改善了关节炎表型[29],[67]。DNA甲基化轴还与药物干预和非编码RNA介导的调控密切相关。血小板衍生生长因子（PDGF）和白介素1β（IL1β）可诱导成纤维细胞（FLSs）进入G2/M期并发生形态重塑，同时降低LBH的表达；甲氨蝶呤（MTX）能逆转这些变化并恢复DNMT1和LBH/p53相关通路，这表明其治疗效果可能部分依赖于重建DNA甲基化稳态[68]。此外，骨髓间充质干细胞衍生的囊泡通过传递miR-21来缓解实验性关节炎，这一机制与Ten-eleven转位1（TET1）/krüppel样因子4（KLF4）轴的调节有关[69]。另一个受到广泛关注的通路是miR-152–DNMT1网络：在胶原诱导的关节炎（CIA）模型中，miR-152的表达下调伴随着DNMT1的上调，而miR-152表达的恢复会抑制DNMT1，解除对分泌型frizzled相关蛋白1（SFRP1）和SFRP4的抑制，并抑制Wnt信号通路，从而限制FLSs的增殖[70]。甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）可能在这一过程中与DNMT1相互作用，表明甲基化“写入”和“读取”之间存在功能耦合[71]。然而，miR-152、SFRP1/4和增强子Zeste同源物2（EZH2）是否形成一个完整的因果反馈循环仍有待进一步验证[71][72]。

除了甲基化调节酶本身外，许多受DNA甲基化控制的靶基因也直接影响类风湿性关节炎（RA）FLSs的病理功能。与骨关节炎（OA）FLSs相比，RA-FLSs中C-X-C基序趋化因子配体12（CXCL12）启动子内的CpG位点发生低甲基化，导致CXCL12的基础表达升高，而去甲基化处理进一步增加CXCL12的表达，表明启动子低甲基化可能通过诱导基质金属蛋白酶（MMP）的表达来促进关节破坏[62]。相反，在RA患者和辅助诱导的关节炎（AIA）模型的FLSs中，肿瘤抑制因子磷酸酶和tenisin同源物（PTEN）的表达下调，这种降低与DNMT1表达增加和DNA甲基化增强有关。TNFα会进一步增加RA-FLSs中的PTEN甲基化，而去甲基化剂5-aza-dC可以抑制FLSs的激活和炎症介质的释放，并减轻体内爪子肿胀[63][65]。相比之下，TPN2的情况似乎更为复杂。尽管TPN2在RA患者的滑膜组织和动物模型中常高表达，并且与FLSs中的凋亡抵抗和自噬增加有关，但尚无共识认为其在FLSs中的差异表达直接受DNA甲基化调控[64][65]。这种不一致性可能反映了物种差异、组织异质性和细胞纯度的变化，表明其甲基化状态和功能相关性应在单细胞水平或纯化的FLSs群体中进行重新评估。

总体而言，FLSs中的异常DNA甲基化可以通过UHRF1、DNMT1和TET3等上游调节因子重新塑造细胞状态，同时通过CXCL12和PTEN等关键下游位点直接驱动炎症、侵袭性和抗凋亡表型。因此，针对这些表观遗传节点的细胞类型特异性靶向可能为中断RA患者的侵袭性滑膜程序提供新的治疗机会。为此，我们总结了关于RA滑膜FLSs和巨噬细胞中DNA甲基化修饰酶的相关研究，为通过DNA甲基化调节RA的病理过程提供了思路（表1）。

表1. DNA甲基化修饰酶在RA中的作用。

| 特征 | 基因 | 常用缩写 | 甲基化过程 | 信号通路 | 生物过程 | 参考文献 |
|-----------------|-----------|------------------|------------------------------------------------------|----------------------------------|-----------------------------|
| 编写器 | DNMT1 | ↑ | TFAM启动子的甲基化 | ↑；TFAM基因表达下降 | [49] |
| | | | TFAM–cGAS–STING信号通路 | 线粒体功能障碍 | ↑；I型干扰素反应 |
| | | | LBH的甲基化 | ↑ | [68] |
| | | | LBH/p53相关通路 | ↑ | |
| | | | FLSs进入G2/M期及形态重塑 | ↑ |
| | | | SFRP1/SFRP4的甲基化 | ↑ | [70] |
| 读取器 | UHRF1 | ↑ | SFRP1/SFRP4网络的调控 | ↑ | [70] |
| | | | DNMT3A对TFAM调控区域RBPJ和ZNF143的作用 | ↑ | [50] |
| | | | mtDNA–cGAS–STING信号通路 | I型干扰素反应 | [50] |
| | | | SIRT1/2与DNMT3B的协同作用 | ↑ | [50][52][53][54] |
| | | | UHRF1/ICBP90的协同作用 | ↑ | [50][52][53][54] |
| | | | CIA小鼠中UHRF1的表达下降 | ↓ | [66] |
| | | | DAS28评分、CRP水平、Th17细胞积累和FLSs的凋亡抵抗 | ↑ | |
| | | | TET1的甲基化 | ↑ | [69] |
| | | | miR-150/TET3轴 | ↑ | [59][60][61] |
| | | | KLF4的甲基化 | ↑ | |
| | | | IL6的甲基化及IL6基因的抑制 | ↑ | [57] |
| | | | Let-7adf–Lin28a/Sdha–琥珀酸轴 | ↑ | [57] |
| | | | TET3的甲基化 | ↑ | |
| | | | MTRNR2L2启动子的甲基化 | ↑ | |
| | | | CXCL8和CCL2的表达 | ↑ | [29][67] |
| 2.3. 血浆和滑液中的cfDNA | | | 利用组织特异性和细胞类型的差异，异常比例的cfDNA可用于检测细胞死亡和预测个体健康问题，尤其是自身免疫性疾病 | [73][74][75] | |
| | | | RA患者的关节间隙狭窄与DUSP22所有位点和启动子区域的DNA甲基化显著下降相关，因此cfDNA成为RA的一个有前景的非侵入性生物标志物 | [76] | |
| | | | RA患者滑液和血浆中的总cfDNA水平显著高于OA患者，表明RA滑液中的cfDNA对两种与RA相关的细胞系（人单核细胞系和原代细胞）具有强烈的促炎作用 | [77] | |
| | | | RA患者cfDNA的特定分子模式主要表现为富含CpG位点的序列富集。这些富集的CpG位点在RA患者中处于低甲基化状态，并在体外和体内触发强烈的炎症反应 | [77] | |
| | | | cfDNA与阳离子内源性肽（如LL37）形成免疫复合物，阻止cfDNA接触催化位点，并通过形成三元复合物（LL37-DNA-DNase I）使DNase失活 | [78] | |
| | | | cfDNA作为循环系统中的移动目标，在全身免疫、滑膜组织的局部免疫和细胞通讯中发挥重要的生物学作用 | | |
| | | | 关于这一病理过程，已经开发出一些新材料，如水凝胶纳米药物（NiH）和使用抗炎（M2型）巨噬细胞衍生的外泌体作为载体的修饰化合物 | [79][80] | |
| | | | 这些材料可以通过细胞通讯和物质运输传递到炎症关节部位，实现靶向治疗的目的 | | |
| | | | 目前关于RA血浆和滑液中cfDNA相关DNA甲基化的研究有限，其潜在机制和功能仍不清楚 | |
| 2.4. 基于DNA甲基化的表观遗传相互作用网络 | | | | | |
| 2.4.1. DNA甲基化与m6A的双向耦合 | | DNA甲基化和m6A修饰通过共享的调节因子和代谢依赖的酶电路形成双向相互作用网络，共同影响基因转录和细胞命运 | [81][82] | |
| | | | DNA甲基化和m6A修饰已在RA中被证实具有表观遗传重编程作用 | [17][83][84][85] | |
| | | | 5mC和m6A在RA中的直接相互作用仍是一个未解之谜 | | |
| | | | RNA m6A的形成与DNA去甲基化共同调节癌细胞中染色质的可及性和基因转录 | [86] | |
| 2.4.2. DNA甲基化–组蛋白修饰相互作用网络 | | | | | |
| | | | 全基因组亚硫酸盐测序分析显示，甲基化和未甲基化模式与DNMT3A和TET1等甲基化调节酶的结合位点以及特定的组蛋白修饰状态有显著重叠，并与与甲基化和基因表达相关的体细胞QTLs相交 | [26][88] | |
| | | | 组蛋白标记可以直接指导DNA甲基化酶的招募和激活 | | |
| | | | 在维持甲基化过程中，DNMT1通过其BAH1结构域识别H4K20me3，并与H3K9me3和组蛋白泛素化共同作用于异染色质，从而在LINE-1等重复元素上保持甲基化，维持基因组稳定性 | [89][90] | |
| | | | 在新甲基化过程中，DNMT3A和DNMT3B与非催化辅助因子DNMT3L和DNMT3B共同作用，它们的酶活性和核小体结合模式受H3K4me0、H3K36me3及核小体表面的修饰的严格调控 | [91][92] | |
| | | | Dnmt3a–Dnmt3L复合体可以同时识别H3K4me0和H3K36me3，而DNMT3A1的UDR基序与H2AK119ub相互作用，进一步表明DNMTs依赖多价组蛋白读取来决定其基因组定位 | [92] | |
| | | | PWWP和ADD结构域对H3K4me0K36me3的识别可解除DNMT3B的自抑制状态并促进DNA甲基化活性 | [93] | |
| | | | 这些发现表明抑制性或结构性组蛋白标记不仅与DNA甲基化共定位，还直接决定DNA甲基化发生的位置和效率 | |
| | | | 这种相互作用还扩展到DNA去甲基化和活性染色质状态的建立 | | |
| | | | H3K9me1/2去甲基化酶KDM3B在转录水平上维持TET1的表达；当Kdm3b缺失时，通常经历完全去甲基化的位点会滞留在5hmC中间状态，从而阻止POU5F1与多能性相关基因结合并抑制其激活 | [94] | |
| | | | TET2和TET3在活跃启动子区域与O-连接N-乙酰葡萄糖胺转移酶（OGT）共定位，它们促进组蛋白O-糖基化，并通过HCF1介导的SET1/compass复合体维持H3K4me3水平和转录活性 | [95][96] | |
| | | | 因此，DNA去甲基化不应被视为简单的甲基标记去除过程，而应视为与活性组蛋白修饰协同作用以建立和维持开放染色质状态 | | |
| | | | OGT还可以对TET3进行O-糖基化并促进其核输出，从而抑制TET3介导的5hmC形成，表明去甲基化途径受代谢敏感性修饰的反馈调控 | | |
| | | | 这些发现表明不同的表观遗传修饰通过写入、读取和擦除的相互依赖过程共同塑造RA滑膜细胞的病理转录状态 | | |

综上所述，RA滑膜中异常的DNA甲基化可以通过UHRF1、DNMT1和TET3等上游调节因子重塑细胞状态，同时通过CXCL12和PTEN等关键下游位点直接驱动炎症、侵袭性和抗凋亡表型。因此，针对这些表观遗传节点的细胞类型特异性靶向可能为中断RA患者的侵袭性滑膜程序提供新的治疗机会。我们总结了关于RA滑膜FLSs和巨噬细胞中DNA甲基化修饰酶的相关研究，为通过DNA甲基化调节RA的病理过程提供了思路（表1）。这些群体表现出高水平的CD40表达，即使在临床发作之前，也显示出一种混合转录特征，这种特征表现为炎症激活和组织驻留相关程序的共存[6]，这表明它们可能代表了从稳态巨噬细胞向病理性巨噬细胞转化过程中的早期中间状态。HBEGF+炎症性巨噬细胞亚群在类风湿性关节炎（RA）组织中富集，并由局部成纤维细胞和TNFα介导[101]，而HBEGF+成纤维细胞在RA的缓解中起作用[102]，这突显了炎症环境中的细胞间相互作用可以重新配置这两种细胞类型并促进RA的进展。在体外滑膜组织实验中，用于治疗RA患者的大多数药物都针对HBEGF+炎症性巨噬细胞；然而，在某些情况下，这些药物可能会使它们进入一种并不意外缓解炎症的状态[101]。有趣的是，LYVE1+CD206+组织驻留巨噬细胞网络位于血管周围微环境中，并与成纤维细胞和血管细胞共存[4]。功能上，LYVE1+巨噬细胞在体外表现出调节和抗炎表型[4]，并能在体外诱导滑膜成纤维细胞的修复反应[3]。尽管这种稳态网络在活动性RA中受到破坏，但在对糖皮质激素相关DMARDs（csDMARDs）反应良好的患者中可以恢复[4]。更重要的是，提高巨噬细胞中的LYVE1水平并减少TGFβ的分泌可以抑制A549细胞的上皮-间充质转化以及HFL1细胞的成纤维细胞-肌成纤维细胞转化，从而显著减少CIA-ILD小鼠的肺纤维化[103]。这些发现强调了LYVE1+巨噬细胞亚群在RA及其并发症中的治疗潜力。此外，外周单核细胞是RA中滑膜巨噬细胞的重要来源。在滑膜组织中，从RA单核细胞分化而来的巨噬细胞保持促炎M1样表型，并与疾病活动（DAS28-CRP）呈正相关，而从M-CSF分化而来的巨噬细胞则失去这种表型并与DAS28-CRP呈负相关[104],[105]。细胞外基质蛋白tenascin-C（一种Toll样受体4 (TLR4)激动剂）可以重新编程单核细胞对后续威胁的反应，同时诱导对再刺激的抑制和增强反应，这与关键表观遗传节点处允许性复合物水平的升高以及内源性训练基因中双等位基因修饰位点的形成有关[106]。这些发现突显了在“无菌”炎症性疾病中先天性的重编程如何导致慢性炎症和表观遗传重塑。髓系sirtuin 6 (Sirt6) 是巨噬细胞表型转化和迁移反应的关键决定因素[107],[108]，并调节巨噬细胞-成纤维血管生成细胞（FLSs）的相互作用[109]。体内实验表明，与野生型小鼠相比，Sirt6缺陷小鼠的关节炎更为严重，且巨噬细胞在滑膜膜中的积累更多[109]。缺陷的髓系Sirt6表达增加了巨噬细胞产生的化学吸引因子向滑膜细胞迁移的潜力[109]。已经证明，巨噬细胞在巨噬细胞-FLSs共培养系统中可以激活FLSs[110]。有趣的是，将中性粒细胞来源的自身或异体微囊泡（MV）输送到巨噬细胞和滑膜成纤维细胞的共培养系统中可以直接对抗经典巨噬细胞的激活并促进TGFβ的释放，从而防止FLSs的进一步激活[110]。这种治疗效果也在关节炎小鼠模型中得到验证，为调节巨噬细胞和滑膜细胞之间的持续炎症提供了新的机会。此外，FLSs可以特异性上调补体C3，激活巨噬细胞上高度表达的C3受体C3aR1，从而通过C3a-C3aR1信号通路介导FLSs和巨噬细胞之间的功能性相互作用[1]。有趣的是，C3a来源于FLSs诱导的巨噬细胞中增强的I型干扰素反应；阻断C3a-C3aR1信号通路可以减少巨噬细胞中的干扰素-β分泌，从而影响FLSs的激活[1]。晚期RA似乎具有由CXCL10驱动的炎症特征和扩大的TREM2+巨噬细胞-浆细胞生存微环境。特别是，IFNγ-CXCL10-CXCR3轴可能成为难治性RA的潜在治疗靶点[111]。为了模拟RA滑膜微环境中复杂的细胞通信途径，研究人员通过共培养系统表明，激活的RA-FLSs分泌IL1，通过自分泌信号增强GM-CSF的释放，在巨噬细胞中诱导IL1β表达，并促进RA滑膜炎的持续[112]。这些发现提供了证据，表明FLSs介导的途径作用于巨噬细胞。因此，巨噬细胞-FLSs之间的细胞相互作用对于调节RA的发病机制非常重要，值得重点关注和深入探索（见图1）。

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图1. 巨噬细胞-成纤维细胞相互作用驱动滑膜组织中的炎症和关节损伤。病理级联通过四个关键阶段进展：① 细胞相互作用：LPS/IFNγ激活的巨噬细胞亚群（包括SPP1+MT2A+和IL-1β+CCL20+细胞）与FLSs相互作用；LYVE1+巨噬细胞参与调节FLSs的通信，具有抗炎表型。② 增殖-侵袭性可塑：这种相互作用触发Sirt6相关的表型转变，使成纤维细胞进入高度增殖和侵袭性状态。③ 促炎介质释放：转化的成纤维细胞分泌一系列细胞因子和趋化因子。④ 炎症放大：这些介质的局部积累加剧了炎症反应，最终导致严重的关节病变。

3.2. DNA甲基化通过巨噬细胞-FLSs相互作用驱动滑膜炎的慢性化
单细胞转录组研究表明，RA滑膜炎不是由单一细胞群体驱动的，而是由滑膜巨噬细胞和FLSs之间高度动态和空间有序的相互作用引起的。在稳态滑膜中，COL3A1+ Mp髓系巨噬细胞亚群和一组表达CX3CR1的组织驻留巨噬细胞共同形成一个具有保护功能的膜状屏障结构[113],[114]。通过紧密连接，该屏障将关节腔与炎症浸润物物理隔离[113],[114],[115]。相比之下，招募的单核细胞来源的巨噬细胞更倾向于采取促炎表型，并积极参与关节炎炎症[101],[115],[116]。这一概念进一步得到遗传模型的支持：在HUPO小鼠中，驻留巨噬细胞的维持受损，导致炎症单核细胞占据滑膜微环境，这些炎症单核细胞无法有效分化为稳态驻留巨噬细胞，最终促进慢性关节炎。相反，保留Flip的单核细胞可以补充驻留巨噬细胞池并抑制疾病进展[115]。因此，滑膜驻留巨噬细胞屏障的破坏可能代表了启动病理性巨噬细胞-FLSs相互作用的早期事件。在发炎的滑膜中，巨噬细胞不仅在数量上积累，而且在功能上也重新编程为促侵袭性的“教育者”。例如，HBEGF+炎症性巨噬细胞在RA组织中富集，并通过EGFR信号促进FLSs的侵袭性，从而导致软骨和骨骼破坏[101]。同样，瓜氨酸化或丙二醛-乙醛修饰的纤维蛋白原可以刺激巨噬细胞释放可溶性因子，进一步诱导FLSs的激活和侵袭性表型的获得[116]。在ACPA相关RA中，经典单核细胞和C1Q+巨噬细胞扩增，并表现出增强的细胞间通讯和代谢活性，表明单核细胞-巨噬细胞轴可能为局部炎症提供持续输入[117]。更重要的是，巨噬细胞衍生的细胞外陷阱可以激活RA-FLSs中的DNA传感器cGAS，从而触发PI3K-Akt信号通路并促进肿瘤样生物行为，而cGAS抑制剂RU.521可以逆转这种效应[2]。这种相互作用不是单向的：来自RA-FLSs的exosomes可以通过PTX3和PSMB5促进巨噬细胞迁移，而富含miR-124的FLSs exosomes则具有相反的效果，表明FLSs也可以通过囊泡介导的通信调节巨噬细胞的招募和定位[118]。巨噬细胞-FLSs相互作用可以维持慢性滑膜炎，因为FLSs建立了异常稳定的炎症信号表观遗传记忆。在TNFα诱导的280个炎症基因中，这些基因在巨噬细胞中的表达仅是短暂的并迅速被抑制，而在RA-FLSs中则持续激活，其表达动力学更接近慢性滑膜炎的临床进程[119]。其中一部分基因被定义为FLSs维持基因（FSGs），其相关的调控元件在TNFα刺激后保持持续的H3K27乙酰化和染色质可及性，并富含NF-κB、干扰素调控因子（IRFs）和激活蛋白-1（AP-1）的结合位点[119]。抑制BET蛋白可以有效阻断这种持续的转录程序[119]。这些发现表明，巨噬细胞提供的初始炎症输入可以被FLSs异常激活的染色质状态“锁定”，从而将急性炎症转化为自我持续的慢性滑膜炎。总体而言，巨噬细胞似乎参与了炎症的启动和放大，而FLSs通过稳定的转录和表观遗传重编程维持病理状态。因此，针对这种双向相互作用网络，特别是EGFR、cGAS和BET依赖的转录程序，可能提供更有效的策略来中断持续的滑膜炎和组织破坏（见图2）。

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图2. DNA甲基化驱动的巨噬细胞-FLSs相互作用介导RA中的滑膜病理。异常DNA甲基化是驱动RA中炎症巨噬细胞和FLSs之间病理相互作用的核心机制。级联反应始于巨噬细胞，其中DNMT1/3?A-和TET2介导的TFAM过度甲基化导致线粒体功能障碍。随后的线粒体DNA胞质泄漏激活cGAS-STING通路，触发促炎和含DNMT-mRNA的细胞外囊泡的释放。作为关键的细胞间信使，这些巨噬细胞来源的因子刺激相邻的FLSs，引发深刻的表观遗传重编。具体来说，FLSs内的DNA甲基化动态改变——以TET3驱动的5hmC富集和DNMT1/UHRF1调节的5mC变化为特征——上调基质金属蛋白酶和趋化因子。这种重塑使FLSs进入高度侵袭性、抗凋亡和增生性表型。

3.3. 表观遗传重塑驱动滑膜中的代谢重编程
代谢重编程和表观遗传重塑在RA中紧密耦合，共同驱动免疫失衡和滑膜病理的进展。在细胞亚群水平上，RA中的CX3CR1+巨噬细胞亚群的表达受到氧化磷酸化的损害，其数量随着RA进展而增加[120]。这一亚群通过线粒体转移破坏巨噬细胞稳态，并通过Cd74/MIF和GAS6/MERTK轴削弱巨噬细胞屏障功能[120]。基因表观遗传景观的变化与营养转运蛋白相关，代谢途径可用于识别RA特异性靶点，包括关键的溶质转运蛋白、酶和转录因子[121]。到目前为止，SMR已经确定了129个CpG位点（75个基因）、28个转录本和9个与RA风险显著相关的蛋白质[122]。其中，七个糖酵解相关基因（PKD1、SLC2A4、ALAS1、ALDH7A1、LRFN3、PFKFB2和PYGB）在甲基化、表达和GWAS数据集中显示出一致的变化[122]，提供了DNA甲基化调节参与RA中代谢重编程相关差异表达基因的直接证据。此外，细胞代谢底物也可以影响DNA甲基化酶及其甲基化水平。例如，体外研究表明脂多糖处理可以诱导异柠檬酸表达，后者与共底物α-酮戊二酸竞争性地结合TET2结合位点，从而抑制巨噬细胞中的TET2催化活性并降低5hmC水平[123]。这一过程在RA巨噬细胞与破骨细胞之间的相互作用中得到了证实[9]。虽然目前缺乏直接将DNA甲基化对能量代谢的调控与RA中巨噬细胞-FLS通信联系起来的研究，但在癌症中已经广泛确立DNA甲基化通过代谢-表观遗传轴影响疾病进展，并具有治疗潜力[124],[125],[126]。这为RA的“肿瘤样微环境”中的滑膜侵袭和免疫浸润提供了新的治疗见解[127]。

4. DNA甲基化靶点的临床转化前景
4.1. 靶向DNA甲基化
异常DNA甲基化是驱动RA患者滑膜炎持续性和细胞功能障碍的重要表观遗传机制。因此，靶向DNA甲基化调控酶已成为干预滑膜微环境重塑的重要策略。此外，DNA去甲基化剂decitabine (DAC) 可以显著抑制炎症并恢复免疫稳态[30],[49],[128]。在关节炎模型中，DAC诱导转录因子IRF8的基因内CpG岛的去甲基化，从而恢复其表达和抑制功能，并重塑包括抗炎巨噬细胞、调节性T细胞和组织保护性FLSs在内的多个关键细胞群体的分化轨迹[30]。这一过程伴随着炎症抑制程序的恢复，如滑膜巨噬细胞中的MerTK、Trem2和Cx3cr1；调节性T细胞中的Foxp3；以及滑膜FLSs中的Pdpn和Fapα，最终促进关节稳态的重建[30]。除了直接针对DNMTs相关过程外，代谢-表观遗传相互作用在RA中也起着重要的调节作用。来源于炎症巨噬细胞的免疫调节代谢物itaconate在RA患者的血清和滑膜液中显著升高[9]。研究表明，itaconate可以抑制DNA去甲基化酶TET2的活性，从而限制过多的破骨细胞激活，抑制关节炎进展，并减轻骨骼破坏[52]。这些发现表明，针对代谢依赖性表观遗传酶的调控可能是治疗类风湿性关节炎（RA）患者骨侵蚀的新起点[9]。一些研究还揭示了其他DNA甲基化相关调控因子在滑膜炎症中的作用。例如，UHRF1参与了RA-FLS中的负反馈抗炎机制，其药理学调节可以抑制滑膜炎症的进展[66]。在THP-1细胞中，DNA甲基化激活剂布地奈德可以降低S100家族、IL8和TNFα等炎症相关基因的表达，而DNA甲基化抑制剂RG108则具有相反的效果[129]，这进一步支持了DNA甲基化状态在调控炎症转录程序中的重要作用。除了传统的表观遗传药物外，还有几种已批准的抗风湿药物和天然产物也有可能通过DNA甲基化相关机制发挥作用。TNFi的治疗可以恢复RA中的血液甲基化稳态，这与先天性和适应性免疫系统细胞的特定生物途径中的甲基化变化有关[35]。MTX可以通过NF-κB或AP-1介导的自分泌IL1信号通路促进RA-FLS中CSF2的表达和细胞周期相关基因的上调，表明它可能参与炎症转录网络的重塑[112]。此外，多种天然化合物也被视为潜在的表观遗传调节剂。例如，橄榄油中最丰富的倍半萜醇之一——橄榄油苷可以通过调节DNMT1和DNMT3的表达以及整体DNA甲基化水平来减弱IL1β诱导的促炎反应并逆转相关的DNA甲基化变化[130]。来自柑橘类植物的黄酮苷类化合物hesperidin通过缓解DNMT1对SFRP2的抑制、下调β-连环蛋白表达以及抑制Wnt信号通路来限制RA-FLS的异常增殖[131]。值得注意的是，一些化合物不仅影响表观遗传调控，还进一步干扰巨噬细胞与FLS之间的相互作用。

总体而言，针对DNA甲基化相关酶及其上游代谢和信号调控网络的干预措施为RA的治疗提供了超越传统抗炎疗法的新视角。未来的研究仍需确定不同细胞类型中表观遗传修饰酶的时空功能，并结合靶向递送和多组学分析，以提高这些策略的选择性、可重复性和转化潜力。

4.2. 临床转化挑战及潜在解决方案
4.2.1. 滑膜微环境相互作用的无体重建模型
RA靶向疗法临床转化的一个主要障碍是传统无体系统难以准确再现滑膜微环境。传统的二维培养模型无法重现滑膜组织的空间结构、细胞异质性或动态炎症信号，从而限制了对巨噬细胞与FLS相互作用系统性的研究。近年来，先进的无体平台显著改善了滑膜微环境的建模，并越来越多地用于解析致病性巨噬细胞与FLS的相互作用以及评估治疗效果。基于胶原/藻酸盐混合水凝胶的滑膜芯片（SOC）模型已被证明可以重建人类滑膜衬里的结构和免疫特征。当与CD14+单核细胞衍生的M2c巨噬细胞共培养时，FLS中的连接蛋白（如ZO-1和CLD5）以及免疫调节标记物（如TREM2和VSIG4）的表达得以恢复[132]。该模型通过模拟RA滑膜衬层中成纤维细胞样滑膜细胞与巨噬细胞样滑膜细胞之间的相互作用，为研究滑膜炎症提供了可靠的无体模型。通过整合微流体、三维培养和灌注流的血管化SOC系统，无体滑膜模型的病理相关性得到了进一步增强[133]。该平台能够稳定维持RA相关的炎症表型，包括IL6和IL8的分泌增加以及RA-FLS中cadherin-11、MMP-1、MMP-3和Ki-67表达水平的上调[133]。重要的是，SOC模型在评估celeastrol和gentianine等化合物的有效性和毒性方面也显示出良好的体内预测潜力，突显了其作为RA治疗临床前评价平台的价值[133]。除了基于芯片的系统外，基于球体的三维共培养模型也能够重建RA滑膜微环境的关键特征。由RA-FLS、内皮细胞和巨噬细胞组成的球体模型在VEGF/bFGF和血清刺激下会表现出球体扩张和巨噬细胞聚集等病理特征[134]。类似地，人类滑膜-软骨共培养模型也能准确捕捉体内软骨和滑膜衬里的功能和组成特征，并再现RA的多种关键病理特征[135]。与传统的啮齿类动物模型相比，这些人类化系统可能为评估治疗效果提供更大的转化相关性[135]。总体而言，这些无体平台将RA滑膜微环境研究从对孤立单细胞类型（如巨噬细胞或FLS）的观察扩展到对巨噬细胞与FLS之间交流以及更广泛的细胞间相互作用的组织水平分析。这些模型有望成为阐明RA体内发病机制和优化精准治疗策略不可或缺的工具。

4.2.2. 靶向滑膜微环境的纳米递送系统
鉴于RA滑膜中巨噬细胞极化异常、FLS的病理性激活以及炎症介质的持续局部积累，已经开发了多种纳米平台。与传统的全身给药方法相比，这些系统不仅有可能提高治疗效果，还能减少脱靶毒性。这些新型材料的跨学科整合有助于精确定位DNA甲基化位点并实现DNA甲基化导向治疗剂的靶向递送[136][137]。鉴于它们在靶向肿瘤DNA甲基化方面的有效性[138][139]以及在RA中的广泛应用[140][141]，纳米材料在针对RA表观遗传紊乱的靶向干预中展现出巨大潜力。一种代表性方法是利用巨噬细胞衍生的仿生载体来实现抗炎分子和传统药物的协同递送[140]。在这种情况下，编码白细胞介素10（IL10）和磷酸贝塔-甲基龙霉素钠的质粒DNA被共同封装到M2巨噬细胞衍生的外泌体中，从而显著增强了在炎症关节中的靶向积累和抗炎活性[140]。M2 Exo/pDNA/BSP联合递送系统的无体有效性归因于IL10质粒DNA和BSP的协同作用，它们共同减少了促炎细胞因子（包括IL1β和TNFα）的分泌，同时增加了IL10的表达，并促进了巨噬细胞从M1表型向M2表型的转化[140]。在CIA小鼠中，M2 Exo/pDNA/BSP表现出良好的关节积累效果、显著的治疗效果和良好的生物安全性，突显了其作为药物载体和免疫调节工具的双重潜力[140]。为了应对炎症滑膜中活性氧水平升高、局部酸中毒、血管渗漏增强以及CD44表达增加的问题，研究人员设计了具有双重靶向能力、对ROS/pH双重响应性和可调粒径的智能微球或胶束，以同时靶向M1巨噬细胞和异常激活的FLS[141]。优化的粒径使这些系统能够通过增强的血管外渗和随后的炎症细胞介导的隔离作用进入炎症关节（称为ELVIS效应[141]。在高ROS环境中，保护性表面层被去除，从而促进CD44介导的内吞作用进入目标细胞，随后在酸性细胞内释放药物[141]。体外和体内研究表明，这些纳米平台可以显著抑制促炎细胞因子的表达，逆转M1巨噬细胞的极化，抑制FLS的侵袭和迁移，并改善疾病进展[139]。总体而言，靶向滑膜微环境的纳米递送系统正从简单的增加局部药物暴露的方法发展成为一种多维度策略，能够同时纠正免疫失衡、抑制滑膜增生并防止组织损伤。这种方法突出了靶向药物递送和精准治疗在RA滑膜巨噬细胞与FLS复杂细胞相互作用环境中的独特优势。然而，其临床转化仍需要进一步验证长期生物安全性、组织分布特征和递送的稳定性。

5. 总结与展望
越来越多的证据表明，表观遗传失调是RA滑膜微环境失衡的主要驱动因素，其中DNA甲基化起着核心的调控作用。DNA甲基化不仅直接塑造FLS和巨噬细胞的功能状态，还与RNA甲基化和组蛋白修饰协同作用，重新编程炎症基因表达网络[7][142]。在此基础上，异常的巨噬细胞与FLS之间的相互作用进一步放大局部炎症；促进FLS的病理增生、侵袭性和组织破坏性；并加剧免疫失衡、滑膜增生和疾病的持续进展[1][143]。因此，靶向巨噬细胞与FLS之间的交流及其上游表观遗传调控电路成为抑制滑膜炎症、延缓RA进展的有希望的策略[144][145]。迄今为止，针对DNA甲基化依赖性调控和巨噬细胞与FLS相互作用的治疗干预已在体内显示出令人鼓舞的效果[30][146][147][148]。特别是纳米材料及相关递送平台的跨学科应用扩大了靶向治疗、降低毒性和提高疗效的可能性，为改善RA治疗的安全性和有效性提供了新的机会。此外，包括微流控装置、SOC平台、基于球体的模型和人类滑膜-软骨构建体在内的先进无体系统[133][135]，为解析复杂的多细胞相互作用、筛选治疗候选物和评估药物反应提供了更具生理相关性的实验环境[134][146]。这些模型不仅有助于分析炎症放大、组织破坏和细胞间相互作用的动态过程，还提高了临床前研究在预测人类疾病状态和治疗反应方面的价值[131][135]。总体而言，机制研究、无体建模和靶向递送技术的持续进步为RA表观遗传疗法的发展奠定了日益坚实的基础。然而，仍存在一些重要挑战。首先，RA中表观遗传改变与致病性细胞-细胞相互作用之间的因果关系及其时空特异性尚未得到系统定义。其次，患者之间、疾病阶段和组织组分之间的显著分子异质性可能限制了单一靶向策略的普遍适用性。此外，靶向递送系统的长期生物安全性、制造一致性和临床可用性仍需严格验证。未来的努力应集中于通过表观遗传干预打破巨噬细胞与FLS之间的炎症正反馈循环，并结合体内和体外模型与多组学分析，系统地绘制潜在的调控网络。同时，应更加重视在临床样本中验证表观遗传生物标志物，并推进新型靶向药物和精准递送平台的转化开发。机制见解、模型创新和治疗工程的整合可能最终实现RA患者的分层和精准医疗。

作者贡献声明
Yan Wang撰写了手稿。Tingting Deng和Cheng Xiao构思了这篇综述。Tong Shi、Hanyu Zhang、Jiaxi Zhang和Kai Zhang参与了与手稿相关的讨论。Chaoying Wen、Sicheng Su和Shuang Lv对手稿进行了修订。所有作者都阅读并同意了发表的手稿版本。

关于使用生成式AI的声明
作者声明在准备、撰写、编辑、数据分析或生成图表的过程中未使用任何生成式人工智能或AI辅助技术。