经过改造的CRISPR技术，可用于在单分子水平上进行核酸成像

《Biotechnology Advances》：Engineered CRISPR for nucleic acid imaging at the single-molecule level

摘要
在单分子水平上准确且动态地可视化核酸对于阐明细胞过程、定义与疾病相关的分子机制以及推进分子诊断至关重要。传统的成像方法常常缺乏在复杂生物系统中所需的灵敏度、特异性或时空分辨率。工程化的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）技术利用Cas蛋白和导向RNA的高可编程性，将核酸成像从重复和非重复的基因组位点扩展到了序列变异的区分和个人RNA的成像。本文综述了主要的工程策略，包括Cas蛋白标记、导向RNA支架修改以及纳米材料或蛋白质辅助的信号放大平台。我们进一步讨论了其在活细胞追踪、空间核酸分析和细胞动态实时监测中的生物医学应用。通过研究这些平台背后的生化和工程原理，我们为基于CRISPR的核酸成像策略提供了合理设计的框架，并指出了克服复杂生物环境中持续存在限制的关键考虑因素。总体而言，这些进展使工程化的CRISPR成像成为一种可编程的空间分辨核酸分析工具；然而，将其更广泛地应用于临床相关样本将需要严格验证其定量稳健性和样本兼容性，并结合标准化的成像工作流程。

1. 引言
准确可视化并追踪核酸对于阐明复杂的细胞过程、表征分子相互作用以及推进分子诊断至关重要。在生物分析方法中，单分子检测已成为实时解析分子动态的强大策略，范围从马达蛋白活性和酶动力学到DNA复制、转录和染色质组织（Kim等人，2024b；Wan等人，2021）。在典型的单分子荧光检测中，目标通过直接或间接的荧光团标记转化为可检测的光学信号。全内反射荧光和共聚焦荧光显微镜等技术可以检测到来自单个分子的信号。然后可以使用荧光强度、荧光寿命、光谱特性和分子计数等可观测参数对这些信号进行定量表征。在单分子水平上的可视化能够分辨离散的分子事件，揭示通常被集合平均效应掩盖的动态异质性和瞬态中间体。尽管有这些优势，传统成像技术仍面临三个根本性限制：（i）由于光漂白、荧光团的光稳定性有限以及与长时间或高频采集相关的光毒性，时空分辨率受到限制（Lelek等人，2021；Zheng和Lavis，2017）；（ii）成像通量，特别是在多重测量中，受到光谱串扰和光学分辨率的限制（Kikuchi等人，2023）；（iii）信号保真度受到背景干扰、自发荧光以及不完整或非特异性标记的影响，可能导致信号丢失或假阳性检测（van Gulik等人，2023）。这些限制降低了瞬态分子事件和低拷贝数核酸目标（包括转录因子结合和非编码RNA定位）测量的灵敏度、定量准确性和可靠性。荧光原位杂交（FISH）通过与其他寡核苷酸探针的杂交实现核酸的序列特异性定位（Moter和G?bel，2000）。FISH已经促进了众多生物学和生物医学发现（Wang等人，2024），并且也被广泛用于临床诊断（Chrzanowska等人，2020）。诸如fiberFISH（Ersfeld，2004）、高通量探针合成（Wang等人，2016）、单分子FISH（smFISH）（Raj等人，2008）和DNA seqFISH+等 advancements大大扩展了FISH的应用范围。值得注意的是，smFISH展示了单分子核酸成像的一个重要特点：可以从多个探针的综合荧光中分辨出单个RNA分子，而不仅仅是来自单个荧光团的信号。因此，在解释单分子读数时应该区分报道基因的多重性和目标的多重性。然而，当前的FISH技术仍存在几个固有限制。对于DNA目标，双链DNA（dsDNA）的变性要求使得实验工作流程复杂化，而传统FISH所需的固定和渗透过程排除了活细胞成像的可能性（Cui等人，2016）。这些限制凸显了需要结合高空间精度和灵敏度以及动态监测核酸能力的成像策略。

在过去十年中，规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关（Cas）系统通过提供可编程且高度特异性的工具来改变序列特异性核酸成像（Xia等人，2025）。通过使用单导向RNA（sgRNAs）指导催化无活性的Cas变体（例如dCas9）定位到特定的DNA序列（这些序列靠近原间隔序列（PAMs）附近），这些系统实现了精确的序列特异性靶向（Wang等人，2019）。dCas蛋白与荧光报告基因的融合使特定DNA或RNA序列的动态可视化成为可能（Chen等人，2013），随后在导向RNA设计和信号放大模块（如SunTag）方面的创新提高了成像灵敏度和多重检测能力（Sun等人，2020）。与FISH等传统核酸成像方法相比，基于CRISPR的成像在三个主要方面具有关键优势：（i）活细胞兼容性——基因编码的CRISPR系统允许在活细胞中动态追踪目标分子（Chen等人，2013；Harish等人，2023；Khan等人，2019；Yang等人，2024）；（ii）可编程性和多重性——CRISPR系统可以使用不同的sgRNAs精确靶向多个基因组位点（Li等人，2023）；（iii）单核苷酸区分——基于CRISPR的靶向可以区分单个基因组位点上的单核苷酸变异（SNVs）（Wang等人，2022；Zhang等人，2018）。鉴于CRISPR成像平台中目标结构和信号生成机制的多样性，我们区分了四种实验相关的成像模式：（i）重复基因组位点成像；（ii）非重复基因组位点成像；（iii）序列变异区分；（iv）单个RNA成像和追踪（图1）。

2. 核酸成像的基本挑战
尽管在高分辨率核酸可视化方面取得了进展，基于CRISPR的成像仍受到几个基本挑战的制约（图2）：（i）有限的时空分辨率：传统荧光团的光稳定性和亮度不足限制了活细胞成像的时间长度，从而阻碍了动态分子事件（如转录因子结合、染色质运动）的追踪（Wu等人，2022；Zheng和Lavis，2017）。更高的激发强度和更快的采集速度可以提高空间或时间采样率，但代价是增加光漂光和光毒性。这种权衡限制了定量活细胞测量的持续时间和采样频率，并对光子高效标记和成像策略提出了更高的要求（Icha等人，2017；Laissue等人，2017）；（ii）成像通量不足：重叠荧光团的光谱串扰和衍射效应阻碍了多个分子目标的多重可视化，特别是在密集的亚细胞结构（如染色质域）中（Kikuchi等人，2023；Zhanghao等人，2025）。在多组分CRISPR成像系统中，递送效率、细胞内运输和组分计量比也会影响标记效率和细胞间的重复性。这些限制在多组分和多重系统中变得更加重要（Geng和Pertsinidis，2021）；（iii）信号保真度低：低光子输出和高背景噪声（如非特异性结合、自发荧光和光散射）降低了信号保真度，从而降低了检测准确性和特异性，特别是对于低丰度和低拷贝数目标（Hariri等人，2022；Zhang等人，2024）。在PAM依赖的目标搜索过程中，染色质的可接近性、导向蛋白与目标的互补性以及结合动力学决定了目标结合复合物的比例及其停留时间。即使报告基因的亮度足够，导向RNA的不稳定性也会进一步降低标记效率（Knight等人，2015；Ma等人，2018；Sternberg等人，2014）。定量成像还要求标记对目标或正在研究的生物过程的影响最小。因此，适当的靶向结构应与目标丰度、定位和功能的实验验证相结合（Xia等人，2025）。在临床和转化医学环境中，这些障碍更加明显。目标可能以低拷贝数存在，嵌入在异质组织中，被强烈的自发荧光掩盖，或在疾病细胞和正常细胞群体中分布不均。对于癌症生物标志物检测、病毒RNA可视化、DNA甲基化分析和空间分子诊断等应用来说，在复杂样本中表现出强大的性能至关重要。相关样本包括血液衍生样本、组织切片、活检样本和常规固定的临床样本。

3. 工程化CRISPR技术用于核酸成像
工程化的CRISPR系统提供了几种互补策略来应对这些限制：（i）提高分辨率和追踪能力：结合多荧光团信号放大和最小化空间阻碍的设计与超分辨率技术可以实现<20纳米的精度，从而在活细胞中持续进行高分辨率的动态过程成像（Khan等人，2017；Sun等人，2020）；（ii）增强多重检测能力：正交配体-蛋白质对与不同的荧光报告基因（例如CRISPRainbow）的结合能够同时可视化多个基因组位点，同时减少光谱串扰（Ma等人，2016）；（iii）信号保真度优化：可以使用响应目标的放大和背景抑制策略来提高信号保真度，例如通过依赖识别的荧光激活、报告基因降解或荧光猝灭（Chen等人，2024；Han等人，2023b；Sun等人，2020）。从临床角度来看，这些特性对于区分真正的疾病相关分子信号与背景荧光、检测罕见突变等位基因或病毒基因组以及实现空间分辨率生物标志物的定量解释尤为重要。总之，这三个挑战代表了基于CRISPR的定量核酸成像的关键技术障碍。克服这些障碍需要Cas蛋白工程、导向RNA工程以及功能模块整合方面的协同进步。更重要的是，临床应用需要这些工程进展与常规样本制备、组织保存、多重生物标志物检测板、定量图像分析和标准化诊断工作流程兼容。在接下来的部分中，我们将讨论如何调整工程化CRISPR方法以应对这些挑战，并实现在重复和非重复基因组位点、序列变异以及不同生物学背景下的高分辨率可视化。**使用荧光报告基因工程化Cas效应器**

荧光蛋白（FP）标记的CRISPR系统是最早和最广泛用于活细胞中基于CRISPR的核酸成像的方法之一。早期的dCas9-FP系统在成像重复性基因组位点方面特别有效，因为多个相邻的目标位点可以支持足够的局部报告基因积累，从而实现清晰的可视化。这些方法主要包括将Cas效应器与FP融合以及通过标签介导荧光报告基因的招募。这些方法共同提供了多种可遗传编码或模块化的标记架构，用于活细胞成像，并且已经逐步优化以解决信号强度、报告基因大小和背景荧光的问题。

3.1.1. 与荧光蛋白融合
直接将dCas蛋白与荧光蛋白融合是一种广泛使用的Cas工程策略，用于核酸成像，已经实现了与绿色荧光蛋白（GFP）、蓝色荧光蛋白（BFP）、红色荧光蛋白（RFP）、tdTomato和mCherry（Chen et al., 2013; Khan et al., 2017; La et al., 2021）等报告基因的结合。这种遗传编码的架构消除了额外的化学修饰步骤，使得可以实时追踪与核酸相关的过程，包括染色质重塑、转录调控和信使RNA（mRNA）动态。然而，早期的CRISPR-FP系统（图3A）通常会产生较弱的目标相关信号、较低的信噪比（SNR），以及来自未结合或离靶报告基因的显著荧光，尤其是在应用于非重复性核酸序列时。这些限制促使人们开发了多价信号放大策略，以增强目标相关亮度、信号持久性和目标与背景的对比度。一个典型的例子是CRISPR-Sunspot（图3B），其中dCas9与24×通用不可抑制的4（GCN4）肽阵列融合，该阵列可以招募多个单链可变片段（scFv）-荧光团复合物，从而增加目标相关荧光（Sun et al., 2020）。这种工程化的招募架构使得可以在活细胞中进行单分子RNA成像。然而，相对较大的scFv-GFP报告基因复合物可能会改变结合动力学，增加空间阻碍，并引入报告基因解离的伪影，从而降低定量准确性。因此，评估报告基因放大效果时不仅应考虑荧光增强效果，还应考虑其对目标结合行为和观察到的生物学过程的影响。后续设计采用了更亮且更光稳定的单体荧光蛋白，如mNeonGreen，以增加光子输出和信号持久性，同时减少聚集相关伪影（Abudayyeh et al., 2017; Tian et al., 2023b; Yang et al., 2019）。

**图3. 使用荧光报告基因工程化Cas效应器。**
(A) CRISPR-GFP：dCas蛋白直接与GFP融合。
(B) CRISPR-Sunspot：dCas9–24×GCN4招募多个scFv-FP单元以实现多价信号放大。
(C) smLiveFISH：CRISPR-Csm复合物与dCsm3-GFP结合，可以追踪单个内源性mRNA分子。
(D) CASFISH：dCas9-HaloTag与合成荧光染料结合，用于无变性固定细胞DNA标记。
(E) CRISPR-TRAP-tag：dCas13与Tat肽阵列融合，招募荧光RNA适配体以实现放大RNA成像。用BioRender.com创建。

**多亚基Cas复合物提供了一种替代的蛋白质工程策略，可在保持可编程RNA识别能力的同时增加目标相关荧光。**例如，单分子活细胞荧光原位杂交（smLiveFISH）（图3C）使用III-A型CRISPR-Csm复合物，该复合物组装在经Cas6处理的CRISPR RNA（crRNA）上，使多个GFP标记的Csm3亚单位能够标记单个目标RNA。smLiveFISH显示与smFISH信号有大约85%的共定位（Xia et al., 2025）。这种多价标记架构增加了目标相关信号积累，并支持在活细胞中观察RNA动态。尽管如此，它需要大量的crRNA，至少需要六个crRNA才能实现可检测的标记，大约需要24个crRNA才能实现明显的目标与背景区分。尽管有了这些进展，但荧光蛋白-Cas组装体的较大尺寸仍然是一个主要限制，因为这种组装可能会干扰天然的核酸-蛋白质相互作用。此外，荧光蛋白报告基因通常比优化的合成染料具有更低的光子输出和光稳定性。

从转化生物学的角度来看，FP融合的dCas系统目前更适合于机制研究和活细胞疾病模型，而不是直接用于临床诊断。它们的遗传编码报告基因特别适合监测活细胞疾病模型、类器官、感染模型和纵向药物反应测定中的动态核酸事件。然而，它们较大的分子尺寸、持续性的荧光、需要在细胞内表达的要求以及对内源性相互作用的潜在干扰，限制了其在临床样本中的应用。因此，未来的工程应优先考虑紧凑型Cas变体、更亮且更光稳定的报告基因、可诱导或瞬时表达系统，以及将活细胞核酸成像与临床可解释读数连接的标准化定量流程。

3.1.2. 标签辅助的荧光标记
与直接荧光蛋白融合相比，标签辅助策略使用肽标签或RNA适配体来招募合成染料、荧光蛋白或荧光报告基因，可能减少空间阻碍，并实现模块化的信号工程。Cas9介导的荧光原位杂交（CASFISH）（图3D）使用带有合成染料（如JF549和JF646）的HaloTag功能化的dCas9来可视化目标基因组位点（Deng et al., 2015）。通过实现与合成染色的共价标记，34-kDa的HaloTag在报告基因选择方面提供了更大的灵活性，并且相对于传统的FP融合能够提高光稳定性和多重检测能力（Frei et al., 2022）。CASFISH能够在固定细胞中快速、无变性地成像基因组位点。最初是用重复性基因组元件展示的，包括着丝粒周围、着丝粒和端粒序列，而非重复性基因组区域也可以使用平铺的sgRNA集合进行可视化。尽管如此，CASFISH仍然仅限于固定样本，因此无法追踪活细胞中的动态事件。相比之下，CRISPR-TRAP-tag（图3E）使用dCas13或较小的人类CRISPR-Cas启发式RNA靶向系统（CIRTS）蛋白与10× Tat肽阵列融合。随后招募荧光RNA适配体，形成三层蛋白质-肽-适配体放大模块，据报道其大小小于40 kDa（Tang et al., 2023）。

荧光RNA适配体系统进一步扩展了工程化CRISPR成像的可用光谱和化学多样性（Chen et al., 2024; Chen et al., 2019）。像Pepper和Broccoli这样的适配体可以嵌入引导RNA骨架，并与相应的荧光剂配对，生成目标相关荧光（Chen et al., 2024; Yang et al., 2024; Zhang et al., 2024）。由于小分子荧光剂比荧光蛋白组装体小得多，这些系统可能减少空间阻碍，并在多色RNA成像中提高目标与背景的对比度（Tang et al., 2022）。尽管这些荧光剂独立于CRISPR开发，但它们扩展了RNA可视化的光谱和时间维度。红色偏移的mSquash/DFHBFPD对与Broccoli/DFHBI-1T具有正交性，使得在活细胞中进行双色RNA成像成为可能，而波长选择性光激活提供了对报告基因荧光的额外时空控制（Yin et al., 2025）。这些进展强调了报告基因的正交性和条件荧光激活作为基于CRISPR的RNA成像中多重荧光报告基因的重要设计标准。然而，CRISPR整合的荧光适配体系统需要外源荧光剂和仔细设计的引导RNA骨架。它们的性能可能受到RNA折叠、细胞内稳定性和染料渗透性的限制，以及在长时间成像期间的非特异性荧光的影响。为了抑制未结合报告基因的荧光，degron基础的报告基因工程利用了内源性泛素-蛋白酶体系统（UPS）将报告基因稳定性与适配体结合，从而生成目标相关荧光开关。Wu等人开发了Tat肽衍生的degron（tDeg），这是一种双功能模块，包含一个来自人类免疫缺陷病毒（HIV）Tat的RNA结合域和一个Arg-Arg-Arg-Gly degron基序。该模块作为蛋白质降解开关：未结合的FP-tDeg报告基因通过蛋白酶体迅速降解，而适配体结合则掩盖degron并稳定报告基因（Wu et al., 2019）。基于这一原理，CRISPR/Pepper-tDeg平台被开发为一种低背景基因组DNA成像的荧光策略。在该平台中，Pepper适配体被嵌入sgRNA骨架中，以招募FP-tDeg报告基因到CRISPR结合的基因组位点。未结合的FP-tDeg报告基因通过泛素-蛋白酶体系统迅速降解，从而实现背景荧光降低超过90%。在目标位点，FP-tDeg报告基因与目标结合的dCas9-sgRNA复合物内的Pepper适配体结合，稳定报告基因并促进局部荧光积累。将目标依赖的报告基因稳定与未结合报告基因的降解相结合，同时抑制背景荧光并提高目标与背景的对比度。该系统使用包含两个Pepper插入片的单个sgRNA实现了非重复性基因组位点的成像，其信噪比比常荧光CRISPR/MS2-MS2涂层蛋白（MCP）系统高出约五倍。这种设计减少了需要大量引导RNA平铺或高度重复的骨架阵列的需求（Chen et al., 2024; Zhang et al., 2024）。与此同时，像SunRISER这样的混合放大架构结合了MS2修饰的引导RNA骨架和SunTag介导的报告基因招募。这种混合架构增加了目标相关荧光，并支持在活细胞和模式生物中长时间追踪单个mRNA分子（Guo and Lee, 2022）。后续的优化拓宽了这种架构在不同细胞环境中的应用范围（Hu et al., 2023）。这些系统共同展示了如何利用模块化工程来平衡报告基因大小、信号强度、背景抑制和活细胞兼容性。与直接荧光蛋白融合相比，标签辅助标记为转化核酸成像提供了更加模块化的框架，因为合成染料、荧光适配体和degron调节的报告基因在亮度、光稳定性和背景抑制方面提供了更大的灵活性。这些属性对于成像低丰度转录本、非重复性基因组位点和疾病相关RNA物种特别有价值。然而，临床应用需要改进染料的生物相容性、高效的细胞内递送、标准化的探针设计以及在患者来源的细胞或组织样本中的验证。

**3.2. 用荧光探针工程化引导RNA骨架**
工程化引导RNA骨架以招募或激活荧光报告基因已成为基于CRISPR的核酸成像的核心策略，可以实现活细胞或固定样本中基因组位点和RNA转录本的可编程可视化。引导RNA工程提供了替代广泛Cas蛋白修饰的方法，因为报告基因招募、信号激活和放大可以在RNA骨架内编码。在基于Cas9的系统中，sgRNA的内在茎环结构为整合报告基因结合基序或招募荧光报告基因提供了灵活的框架。这些工程化的骨架通过与染料标记的寡核苷酸杂交、招募荧光RNA结合蛋白、激活荧光报告基因或组装信号放大模块来产生光学信号。由于引导RNA序列和骨架结构共同决定了目标识别和报告基因招募，这些工程化的CRISPR平台非常适合需要突变区分、低背景信号生成和多重目标检测的应用。这一设计原则将可编程的CRISPR识别与序列变体、病毒RNA、甲基化相关序列和其他疾病相关核酸特征的空间可视化相结合。

**3.2.1. 分子信标整合**
一种代表性的荧光策略利用sgRNA骨架的结构灵活性来整合分子信标（MB）目标序列，从而在杂交到互补序列时产生目标相关的开启荧光。MB是含有荧光团-淬灭剂对的茎环寡核苷酸探针，这种F?rster共振能量转移（FRET）机制可以显著提高信噪比，使MB非常适合检测复杂细胞环境中的低拷贝数目标（Tyagi and Kramer, 1996）。通过将MB目标序列（MTS）嵌入sgRNA的茎环2中，CRISPR-MB系统（图4A）能够实现实时荧光激活，同时对Cas9-sgRNA结合的干扰最小。据报道，将其插入茎环2比插入四环结构或3′末端具有更有利的杂交动力学和更低的背景荧光。然而，功能性sgRNA中可用的插入位点数量有限，限制了每个CRISPR复合物可以招募的分子信标数量。尽管如此，未完全淬灭或非特异性打开的信标造成的残余荧光仍可能影响复杂样本中单个核酸目标的可靠检测（Wu et al., 2018）。为了解决这些问题，随后开发了双报告基因和双FRET引导RNA设计。通过在sgRNA骨架中加入两个光谱协调的分子信标目标序列，这些设计支持比率测量或内部参考成像，部分补偿了光漂白、探针浓度差异和环境波动。这些双报告基因设计需要仔细优化sgRNA折叠、信标可访问性、荧光团间距和发夹稳定性，以最小化自发的探针打开和假阳性荧光（Mao et al., 2019）。这种模块化方法还与RNA靶向的Cas13系统结合，实现了无需扩增的病毒RNA可视化，包括无需逆转录或聚合酶链反应（PCR）扩增即可检测埃博拉病毒RNA（Shan et al., 2019）。尽管这些基于MB的系统可以提供高信噪比和灵活的报告基因设计，但它们也存在一些限制，包括高合成成本、探针稳定性有限以及在活细胞中的递送效率低下。这些限制促使人们开发了基于多价报告基因招募或骨架介导信号放大的替代引导RNA工程策略。在临床转化应用中，MB整合的CRISPR系统在无需扩增的情况下成像病毒RNA、罕见转录本和低拷贝核酸生物标志物方面具有特别大的潜力，因为它们的激活响应可以减少未结合探针的荧光干扰。其诊断价值将取决于提高探针在生物液体中的稳定性、增强其进入完整细胞和组织样本的能力，以及建立定量信号分类的标准阈值。

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**图4. 带有荧光探针的引导RNA支架设计。**
(A) CRISPR-MB：dCas9与MB和SL2-sgRNA-MTS（MB目标序列位于茎环2处）结合。这些组件形成复合物，靶向基因组位点，在结合时激活MB的荧光。
(B) CasSABER：一种携带桥接序列的sgRNA招募由PER生成的串联探针，通过荧光成像链进行杂交来可视化。
(C) CasPLA：CRISPR引导的邻近连接和滚环扩增用于可视化线粒体DNA中的SNV。
(D) CRISPRainbow：dCas9与PP7/boxB修饰的sgRNA及其相应的荧光融合蛋白（PCP-3 × mNeonGreen和N22 × 3RFP）结合。使用BioRender.com创建。

**3.2.2 多价探针组装**
除了荧光分子信标设计外，多价引导RNA支架还可以招募多个寡核苷酸探针、RNA结合蛋白或荧光报告蛋白，以增加与目标相关的信号强度并支持多重核酸成像。例如，CasSABER（图4B）在sgRNA的茎环区域加入了一个42个核苷酸的桥接序列，以招募信号放大寡核苷酸组装体，用于成像低拷贝数或非重复基因组位点。该桥接序列招募由PER产生的串联探针，从而可以通过单个引导RNA实现目标位点的可视化。然而，固定的PER探针序列限制了核苷酸水平的序列分辨能力，因此无法可靠地区分单核苷酸变异（SNV）（Li等人，2023年）。为了实现空间分辨的SNV检测，CasPLA（图4C）将Cas9/sgRNA识别的邻近效应与邻近依赖性连接和滚环扩增（RCA）结合。当两个CRISPR复合物结合到适当间隔的目标位点（<20个核苷酸）时，它们的邻近性会引发依赖连接的信号放大；而序列不匹配会导致任一结合事件受阻，从而抑制信号产生。据报道，该设计可以通过基于局部RCA的信号放大实现选定的线粒体DNA（mtDNA）SNV的单分子分辨率可视化，并随后扩展到核基因组中的单拷贝位点成像。这种依赖于序列不匹配的邻近信号抑制机制能够区分和空间可视化选定的线粒体DNA点突变（Zhang等人，2018年）。

多重CRISPR成像还进一步利用了正交RNA适配体支架，以招募光谱不同的荧光报告蛋白到多个基因组位点。增加适配体的拷贝数和组合正交适配体-蛋白质对可以增强与目标相关的信号积累和光谱多样性。代表性的RNA-蛋白质对包括MS2-MCP、PP7-PP7包膜蛋白（PCP）和boxB-N22，这些可以整合到引导RNA支架中，用于多价报告蛋白的招募和多重成像（Shao等人，2016年；Wang等人，2020年）。CRISPRainbow（图4D）将MS2、PP7和boxB适配体模块与其相应的荧光标记RNA结合蛋白结合，生成光谱可区分的引导RNA标签。该系统能够在活细胞中同时成像六个不同的染色体位点，并能区分相距5 kb到2 Mb的相邻基因组位点。通过组合正交RNA适配体-蛋白质对，CRISPRainbow扩展了CRISPR成像到多重基因组位点的成像（Ma等人，2016年）。相关的dCas9-MCP报告系统也已适配用于监测结核分枝杆菌中的基因表达（Laudouze等人，2024年）。然而，单拷贝的发夹结构通常无法提供足够的信号放大，以稳健地可视化非重复位点。CRISPR-Sirius通过结合八个MS2或PP7适配体重复序列以及优化过的连接子来增加报告蛋白的招募，以最小化二级结构干扰。工程化的引导支架的稳定性提高了细胞内引导RNA的丰度和标记效率，表明当引导RNA的稳定性受限时，仅靠报告蛋白的多个拷贝可能不够。尽管如此，长的重复RNA支架可能会发生错误折叠、重组或影响核内运输（Ma等人，2018年）。此外，荧光激活RNA适配体提供了一种不依赖蛋白质的信号生成方式。例如Mango和Broccoli适配体可以与相应的小分子荧光剂结合，生成荧光，无需荧光RNA结合蛋白（Cawte等人，2020年）。为了扩大报告蛋白的选择范围，Casilio使用了Pumilio和FBF（PUF）结构域与荧光蛋白融合，并将Pumilio结合位点（PBSs）整合到sgRNA支架中（Cheng等人，2016年）。Casilio可以在每个sgRNA中加载超过40个PBS基序（Clow等人，2022年），从而实现单引导RNA对非重复位点的成像，这一任务以前需要多个sgRNA，并支持使用工程化的多价PUF结构和独特的识别代码实现三色多重成像（Zhang和Song，2017年）。

尽管多价支架可以提高与目标的亮度，但广泛的重复插入可能会促进重组、RNA错误折叠和聚集，或影响核内运输。因此，需要系统地优化适配体的身份、拷贝数、连接子组成和支架稳定性。对于转录核酸成像，多价探针组装可以将低拷贝分子事件转化为可检测的信号，这对于成像非重复位点、罕见突变等位基因和空间受限的疾病生物标志物至关重要。邻近依赖性平台（如CasPLA）特别适用于突变分辨率成像，而CasSABER和CRISPRainbow类型的系统则支持信号放大的或多重空间分析。未来的工程应平衡报告蛋白的多个拷贝与引导RNA的稳定性、目标的可及性、样本兼容性和定量解释能力，特别是在活检标本、循环肿瘤细胞和病原体感染样本中。

**3.3 带有功能模块的CRISPR平台工程**
虽然Cas蛋白和引导RNA的工程显著推进了基于CRISPR的核酸成像技术，但在实际应用中通常需要额外的功能模块来提高报告蛋白的亮度、组分的递送、组织穿透性、信号放大和定量读取能力。纳米材料、酶、解旋酶和辅助蛋白结构域通过提高光稳定性或递送效果，以及将CRISPR识别与光学、酶促、电学或纳米级信号转导机制相结合，提供了互补的工程方法。因此，带有功能模块辅助的CRISPR平台特别适用于转录核酸成像和分子诊断应用。最近对体内CRISPR生物传感的分析进一步表明，序列识别、信号放大、细胞内递送和传感器动态是生理环境中分析性能的相互依赖的决定因素（Li等人，2025b）。

**3.3.1 纳米材料辅助的CRISPR平台**
将纳米材料与CRISPR识别相结合，可以增强核酸检测和成像的灵敏度、光稳定性和空间读出能力。与传统的荧光团和荧光蛋白相比，量子点（QDs）、金纳米簇和DNA纳米结构等纳米材料可以提供高亮度和光稳定性、延长的信号持久性，或可编程的纳米级组织（Herrera-Ochoa等人，2022年；Li等人，2018年）。CRISPR-纳米材料混合物结合了Cas蛋白的可编程核酸识别能力和纳米材料的光学、电学、磁性或递送特性。Cas蛋白可以直接与纳米粒子结合，或者通过肽标签、引导RNA支架、适配体桥接或亲和相互作用与纳米级报告蛋白结合，从而将报告蛋白定位到DNA或RNA目标上。这些混合系统实现了高精度的病毒核酸映射。例如，一种双标签策略将dCas9与硫辛酸连接酶受体肽（LAP）和生物素受体肽（BAP）基序融合，实现了与光谱不同的QDs的正交结合（图5A）。这种标记系统能够在感染细胞中可视化潜伏的HIV DNA，同时提高病毒基因组信号的光稳定性和光谱分辨能力。标记有QD625和QD525的dCas9复合物的核定位效率分别为59.7%和58.4%（Ma等人，2017年）。类似的dCas9引导的量子点平台被用于追踪伪狂犬病病毒在感染和细胞内的运输（Yang等人，2020年）。在Vero细胞中的活细胞成像显示了病毒附着、以0.452 ± 0.136 μm/s的速度通过微管运输，以及随后的核内进入。除了病毒基因组成像外，CdSe量子点还被探索作为CRISPR-Cas9递送和活体系统中的光学追踪工具（Yeo等人，2024年）。CdTe量子点报告蛋白还与Cas12a或Cas13a目标识别结合，用于荧光病毒核酸检测，目标依赖性的报告蛋白切割恢复了量子点的荧光（Li等人，2018年）。然而，镉相关的细胞毒性限制了活细胞和临床应用，因此推动了表面钝化、PEG化以及无重金属量子点的开发。

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**图5. 功能模块辅助的CRISPR平台。**
(A) 双色QD标记：dCas9带有LAP/BAP基序，通过Diels-Alder环加成与TCO2-QD625结合，通过streptavidin-biotin相互作用与biotin-streptavidin（SA）-QD525结合，实现多重DNA检测。
(B) CRISPR-PDNC：DNA纳米冠介导的CRISPR/Cas9在线粒体中的递送，用于微RNA成像。
(C) InCasRD：一种RNA纳米花组织Cas13a工程化的crRNA复合物和圆形荧光报告蛋白，限制目标触发的跨切割，以增强局部荧光放大和序列分辨的RNA成像。
(D) sgGOLDFISH：一种高特异性的Cas9变体和一个故意设计的不匹配引导RNA优先切割其中一个等位基因。Rep-X介导的局部链暴露随后允许寡画探针杂交，实现对野生型和突变DNA序列的空间区分，而无需全基因组变性。使用BioRender.com创建。

碳量子点（CQDs）可能是一种比含镉量子点更具生物相容性的替代品。CQD-聚乙烯亚胺（PEI）-聚乙二醇（PEG）纳米复合物可以与CRISPR-Cas9核糖核蛋白结合，促进细胞内和核内递送，并提供光学信号以追踪组分分布（Zhai等人，2022年）。CQD可能会提高细胞存活率并相对于含镉量子点减少背景荧光，尽管它们的中等量子产率（约32%）可能限制了对超低丰度目标的检测。基于金的纳米结构提供了额外的机会来提高检测灵敏度和目标特异性信号转导。磁性金纳米粒子（MGNP）平台与CRISPR/Cas13a结合，实现了等温、无扩增的miRNA检测，并报告了单分子分析灵敏度（Kim等人，2024a）。然而，依赖于表面固定的探针限制了该平台在细胞内成像中的适用性。一种相关的CRISPR-Cas13a系统将固态纳米孔与金纳米粒子（AuNP）标签结合，通过电迁移信号实现了飞摩尔级别的RNA定量（Liu等人，2022年）。除了基于金属的系统外，DNA纳米结构还实现了空间精确性和细胞内靶向。一种称为蛋白递送纳米冠（PDNC）的DNA纳米探针选择性地将CRISPR-Cas9递送到线粒体中，用于微RNA检测，并通过总内反射荧光（TIRF）显微镜（Zhao等人，2022年）。然而，预定义的架构可能会限制其对不同目标的适应性，因此开发了具有可调几何形状和报告蛋白化学计量的可重构DNA纳米结构。最近的纳米结构辅助设计进一步利用空间组织来调节CRISPR介导的信号放大。InCasRD（图5C）将RNA纳米花与Cas13a工程化的crRNA复合物和圆形荧光报告蛋白结合，限制目标触发的跨切割在纳米结构内，以增强局部信号放大和信噪比（Zhao等人，2026年）。在这种配置中，纳米结构为CRISPR信号转导提供了定义明确的纳米级环境，而不仅仅是作为分子组装的支架。除了局部信号放大外，CRISPR-纳米材料混合物还可以将可编程的目标识别与细胞内递送或治疗诊断功能相结合。根据Cas变体和实验设计的不同，Cas蛋白可以作为基因组编辑器、可编程靶向模块或纳米级成像系统中的定位组件（Mikheikin等人，2017年）。纳米材料封装的CRISPR核糖核蛋白可以改善细胞内递送，尽管免疫原性、内体逃逸和组织特异性积累仍然是重要的转录考虑因素（Li等人，2018年）。CRISPR驱动的单微马达（Cas-DSM）平台将dCas9与磁性荧光报告蛋白结合，实现了病毒RNA的检测，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）RNA，并报告了单分子分析灵敏度（Chen等人，2023年）。将细胞器靶向递送与CRISPR介导的信号转换相结合，进一步实现了非侵入性的体内突变相关信号检测。CasUber使用基于DNA纳米花的Cas12a纳米传感器来识别肿瘤相关的线粒体DNA突变，并生成可被肾脏清除的荧光生物标志物，通过尿液荧光来报告肿瘤进展和转移（Li等人，2025a）。对于转录核酸成像，纳米材料可以提供更明亮或更持久的光学信号、多模式读出和集成递送或治疗诊断功能，这些是仅使用荧光蛋白难以实现的。这些特性可能使纳米材料辅助的CRISPR平台特别适用于检测病毒核酸、循环肿瘤来源的核酸、甲基化特征和复杂标本中的细胞内疾病相关RNA。

**3.3.2 蛋白质辅助的CRISPR平台**
除了纳米材料整合外，CRISPR相关蛋白和外源融合蛋白的工程也提供了改善成像功能和单核苷酸区分性的额外途径。这些方法利用工程化的蛋白结构域或酶来改变局部目标的可及性、引入报告序列或启动下游信号生成，从而将CRISPR成像扩展到直接荧光标记之外。工程化的Cas蛋白和辅助解旋酶可以局部增加DNA的可及性，以便选择性探针杂交。单引导基因组寡画谱FISH（sgGOLDFISH）结合了合理的引导RNA设计、高特异性的Cas9变体、局部DNA切割和解旋酶介导的链暴露，以实现单核苷酸区分。在5′-鸟嘌呤延伸的sgRNA中故意引入了一个不匹配序列，该sgRNA与增强特异性的链球菌Cas9（eSpCas9）变体结合。这种配置使得野生型DNA的切割率约为40%，而含有SNV的DNA由于形成了双错配，其切割率低于5%，这是通过单链DNA断裂滴数字PCR技术确定的结果，从而实现了差异性的FISH标记（图5D）。sgGOLDFISH通过直接寡核苷酸杂交染色来标记切割位点两侧的1.5-kb区域，据报道其空间分辨率为617±92纳米，可以用于可视化点突变。该系统被应用于核内SNV的成像，包括与早老症相关的 lamin A/C (LMNA) 基因突变的研究，同时保留了基因组位点的空间背景信息。与最初用于线粒体DNA的CasPLA不同，sgGOLDFISH也可以用于核基因组目标（Wang等人，2022年）。蛋白质辅助的CRISPR平台可以将序列选择性的分子识别与疾病相关序列变异的空间分辨成像结合起来。sgGOLDFISH及相关系统能够提供点突变的空间分辨成像，并且通过保留核和组织背景信息，可以补充基于测序的诊断方法。然而，临床应用需要简化工作流程、确保与存档的临床样本兼容、降低酶处理的复杂性，并通过严格的基准测试来验证其有效性。

4. 工程化CRISPR成像的生物医学应用
工程化CRISPR成像将可编程的序列识别与上述各种核酸目标的空间读数结合在一起。通过改造Cas效应因子、导向RNA支架、荧光报告因子和辅助功能模块，这些平台支持在活细胞、固定细胞和组织样本中实现DNA和RNA的序列特异性成像。工程化CRISPR平台可以通过分子信标、荧光报告因子、多价荧光标记和信号放大模块来提高目标的可检测性和定位能力。这些策略可以在特定应用中支持对单个核酸分子的长时间跟踪或计数。与传统的荧光蛋白标记相比，一些工程化CRISPR设计具有更低的背景噪声、更好的信号稳定性、更强的光谱灵活性，以及对基因组位点和RNA转录本的空间分辨能力。除了用于机制研究外，单分子核酸成像在转化医学背景下特别有用，因为在这些情况下，疾病相关的DNA和RNA目标可能含量较低、空间分布不均匀，并且会被周围健康细胞的信号所掩盖。工程化CRISPR平台提供了可视化与癌症相关的基因组改变、病毒RNA动态、DNA甲基化异质性以及疾病相关RNA定位的能力，同时保留了细胞或组织的背景信息。因此，本节探讨了基于工程化CRISPR的核酸成像如何支持机制研究、空间分子病理学分析、治疗反应监测以及精准诊断平台的发展。

4.1. 用于活细胞成像的工程化CRISPR平台
4.1.1. 基因组DNA的动态成像
在活细胞中实时跟踪内源性DNA位点可以提供关于染色质组织、基因调控、DNA复制和DNA修复的空间和时间信息（Hwang等人，2024年；Viushkov等人，2022年）。工程化CRISPR/dCas9成像系统使用序列编程的sgRNA将荧光报告因子招募到原位的内源性染色体位点（Ding等人，2023年；Geng和Pertsinidis，2021年；Ma等人，2016年；Van Tricht等人，2023年）。早期的CRISPR成像在重复序列富集的基因组区域效果最佳，因为多个相邻的结合位点能够产生足够的局部荧光以实现持续的位置跟踪。这些研究使得能够可视化端粒动态和MUC4位点，包括有丝分裂期间姐妹染色单体上的重复MUC4区域，并确立了CRISPR成像作为监测活细胞中染色体组织的工具（Chen等人，2013年）。然而，这种对目标丰度的依赖限制了这些方法在低拷贝和非重复区域的应用，因为在这些区域报告中子的积累不足，影响到了位置检测和轨迹连续性。后续的发展重点在于提高位置的可检测性和跟踪连续性，同时减少背景荧光。CAS-LiveFISH（图6A）利用荧光标记的dCas9核糖核蛋白复合物直接可视化内源性基因组位点。该方法被用于基于特征性双峰信号识别人类乳头瘤病毒（HPV）整合位点，并量化活细胞中的MUC4位点位移（Geng和Pertsinidis，2021年）。然而，灵敏度仍然取决于每个位点招募的荧光蛋白数量。多价招募系统如SunTag可以通过增加目标相关的荧光和改善有丝分裂等动态过程中的基因组位点可视化来部分缓解这一限制（Albrecht等人，2024年；Morita等人，2024年；Tanenbaum等人，2014年）。此外，可编程的toehold mediated链位移电路可以在不需要人工操作序列的情况下控制Cas9活性和荧光产生，从而保留内源性基因组背景信息并减少背景荧光（Hao等人，2020年）。这些方法提高了位置的可见性，尽管更高的荧光强度并不一定意味着更高的染色质运动测量时间分辨率。

对于低拷贝和非重复的基因组位点，背景抑制尤为重要，因为微弱的位点相关信号可能会被弥漫的核荧光所掩盖。CRISPR/Pepper-tDeg的信号噪声比传统CRISPR/MS2成像高出约五倍，结合使用分裂荧光蛋白重构技术后，可以使用单个sgRNA可视化非重复位点如MUC4和IL1B（Chen等人，2024年）。fCRISPR进一步利用改进的光学对比度来功能性地研究基因组状态。除了相对于dCas9-GFP对照组提高约26倍的信噪比外，fCRISPR还允许同时可视化标记位点和53BP1相关的DNA损伤，从而实现定义基因组位点处双链断裂形成和修复的实时监测（图6B）（Zhang等人，2024年）。标记端粒的荧光强度也与端粒长度相关，提供了与位点相关基因组结构的定量读数。因此，背景抑制不仅提高了位点的可见性，还允许解释与结构和损伤相关的基因组信号。

然而，提高的可检测性并未完全解决基于Cas9的成像的可扩展性限制，特别是在非重复或多位点分析方面。Cas12a提供了一个替代方案，因为它自身的crRNA处理能力支持紧凑的crRNA阵列和来自单个转录本的多重靶向（Li等人，2024b）。目标响应的Cas12a传感器还通过别构控制激活功能来减少背景泄漏。发夹调控的激活链相对于线性激活剂提高了超过八倍的信噪比，并被用于可视化内源性目标并监测活细胞中的外源病毒基因组释放及其随后的复制相关信号积累（Li等人，2024b）。这种多重靶向能力对于非重复位点特别有用，因为可能需要多个引导序列来生成可追踪的信号。CRISPRdelight展示了这种扩展的靶向能力如何支持染色质调控的定量分析。使用工程化的Cas12a阵列，该系统能够可视化12个非重复基因组位点并定量追踪它们的空间动态（Yang等人，2024年）。在CCAT1位点，核层相关等位基因表现出更受限的运动和较低的新生转录活性，而位于核内部的等位基因则表现出更高的新生转录活性。热休克处理后，与核斑点相关的HSPH1位点比例增加到约20%，这些斑点相关的位点表现出更高的新生转录活性。这些观察表明，将CRISPR成像扩展到非重复基因组区域可以提供超出扩展目标覆盖范围的信息。这种成像能够在同一定量框架内检查核定位、染色质运动和转录状态。

活细胞CRISPR DNA成像已经从依赖重复序列的位点可视化发展到高对比度的非重复区域追踪、多重染色体分析以及功能读数的整合。信号生成和导向阵列处理的改进逐渐扩展了可追踪的基因组目标范围，而最近的应用越来越多地将位点移动性和核定位与转录或损伤相关状态联系起来。尽管如此，目标的可访问性、报告因子的占用情况、导向序列的特异性以及可用结合位点的数量仍然限制了定量解释，尤其是在低拷贝位点的情况下。因此，标准化的轨迹分析、目标身份的正交验证以及与染色质和转录状态独立测量的整合对于跨平台和生物系统的基因组动态比较非常重要。

4.1.2. RNA的动态成像
单个RNA分子的细胞内运输、翻译、加工和降解是基因表达的空间和时间调控的核心。即使来自同一基因的转录本也可能占据不同的亚细胞区室，在不同时间表现出不同的运动模式并在不同功能状态之间转换。尽管smFISH能够敏感地定位单个RNA分子，但它需要化学固定，从而无法直接分析它们的时间轨迹（Femino等人，1998年；Safieddine等人，2023年）。因此，活细胞CRISPR成像提供了一个补充框架，将转录本身份与单RNA水平的分子移动性、亚细胞重分布和翻译动态联系起来（Xia等人，2025年）。早期的RNA靶向CRISPR系统表明，无需引入大量的RNA报告因子阵列即可监测内源性转录本的定位，尽管成像性能仍强烈依赖于目标丰度和报告因子背景。例如，基于RNA靶向的Cas9 (RCas9) 和dCas13的系统能够可视化β-actin mRNA向应激颗粒的重分布以及长非编码RNA (lncRNA) NEAT1在寄生斑点内的动态定位（Abudayyeh等人，2017年；Yang等人，2019年）。CRISPR/Cas9介导的敲入技术也被用于CRISPR介导的内源性lncRNA追踪和免疫沉淀系统（CERTIS）中，以可视化内源性NEAT1并探究其相关蛋白组（Chen等人，2020年）。这些研究将CRISPR成像的范围从细胞质mRNA扩展到了膜内核区室中的调节性非编码RNA和RNA组织。然而，直接招募荧光蛋白可能会产生大量的背景荧光，因此最适合相对丰富的转录本。相比之下，基于敲入的策略如CERTIS需要基因组修饰，不适用于需要保持完全未修饰的内源性转录本的情况。

对于动态成像而言，保留内源性RNA序列和组织结构尤为重要，因为转录本的定位和移动性与RNA-蛋白质相互作用及亚细胞调控状态密切相关。CRISPR-Sunspot实现了对低丰度内源性mRNA分子的成像和追踪，并将荧光点转化为转录动态的定量测量。在U2OS细胞中，对HBG1 mRNA的单粒子追踪显示其扩散系数为0.0147±0.0025 μm2/s，并揭示了受限的、定向的、双向的运动轨迹。同一研究还观察到了神经元树突中的内源性Camk2a mRNA，其中单个荧光点表现出前向、反向、双向和静止的运动状态（Sun等人，2020年）。然而，仅增加信号强度不足以解析快速的RNA运输，因为定量追踪还依赖于时间采样和最小化的标记干扰。smLiveFISH（图6C）通过CRISPR-Csm介导的未修饰内源性RNA标记来满足这一需求（Colognori等人，2023年；Xia等人，2025年）。该系统能够追踪单个内源性NOTCH2和MAP1B转录本。每秒10帧的成像分辨率可以解析出异质性的NOTCH2轨迹和MAP1B的定向运输。这种能力将RNA定位分析扩展到了动态过程中，能够在短时间内分辨出不同的运输状态。尽管如此，稳定的成像仍需要大量的crRNA tiling，这使得转录本的可访问性和crRNA的占用成为影响成像性能的重要因素。

RNA的移动性与转录本的功能状态密切相关，翻译为分子运动和RNA功能提供了直接联系。使用SARS-CoV-2 E mRNA作为模型转录本，CRISPR/dCas13成像被用于监测活Vero细胞中单个病毒mRNA的翻译动态（Tian等人，2023b）（图6D）。翻译依赖性的荧光衰减显示翻译速率为2.4–4.5个密码子/秒，平均为3.3±0.5个密码子/秒，提供了个体mRNA翻译异质性的定量读数。核糖体占用率的实验性干扰进一步改变了转录本动态。环己亚胺诱导的核糖体停顿将平均mRNA速度降低到0.20±0.13 μm/s，而嘌呤霉素诱导的翻译终止将其增加到0.43±0.21 μm/s。二硫苏糖醇（DTT）引起的翻译抑制也使平均mRNA速度增加了0.44±0.22 μm/s。这些测量结果定量地将翻译状态与RNA的移动性联系起来，将活细胞CRISPR成像技术从单纯的转录本追踪扩展到对空间和功能动态的联合分析。尽管如此，多组分标记体系本身在解释天然RNA动力学时仍可能成为干扰因素。活细胞RNA成像还可以根据单个细胞的生化状态来解析目标表达。针对腺嘌呤/嘧啶缺失内切酶1（APE1）的Cas12a成像技术使得能够在肿瘤细胞中选择性地可视化miRNA，从而将序列特异性的RNA检测与疾病相关细胞状态的区分结合起来（Liu等人，2025年）。活细胞CRISPR RNA成像技术已经从序列特异性的转录本定位发展到对RNA运输和功能状态动态的定量研究。现在，通过测量扩散、定向运输、应激响应的再分布以及翻译动力学，可以全面了解RNA在空间和时间维度上的行为。然而，这些测量结果容易受到RNA结构、标记物的占用情况以及标记诱导的干扰的影响，尤其是在成像复合体本身可能影响运输或翻译过程的情况下。高频率采集引入了一个额外的光照依赖性限制，因为在长时间活细胞追踪过程中需要平衡时间分辨率与光漂白和光毒性。因此，对转录本身份的正交验证、对标记诱导干扰的系统评估以及标准化轨迹分析对于跨不同RNA种类和生物学背景的定量比较非常重要。

4.2. 用于固定细胞成像的工程CRISPR平台
虽然活细胞成像能够捕捉核酸动态，但基于固定细胞和组织的成像技术在保存样本中对于高对比度显示基因组组织和转录本分布仍然非常重要。固定处理可以延长采集时间、重复洗涤步骤、信号放大以及多重标记，从而补充从活细胞成像中获得的时间信息（He等人，2022年）。这种成像技术在临床应用中尤为重要，因为活检组织、细胞学样本、循环肿瘤细胞以及经过福尔马林固定和石蜡包埋（FFPE）处理的组织通常在固定后进行分析。工程CRISPR平台可以整合到分子病理学工作流程中，既能保留组织结构，又能可视化基因组位点和RNA转录本，并通过互补的免疫荧光技术评估蛋白质标记物。

4.2.1. 基因组DNA成像
固定细胞DNA成像可以保持染色质结构，并能够在空间上保存完好的样本中对基因组位点进行高对比度分析。虽然固定处理会阻止直接观察分子动态，但它消除了由于目标移动引起的模糊现象，并避免了由于采集过程导致的光毒性，从而支持对选定DNA目标的长时间定位和计数。在分子病理学中，工程CRISPR成像技术可以提供关于拷贝数改变、病毒整合位点、端粒异常、染色体排列以及疾病相关序列变异的空间信息。这种对细胞背景的保留可以补充基于测序的分析方法，尤其是在变异阳性细胞在异质性组织中较为罕见或空间分布受限的情况下。

工程CRISPR系统已经将固定细胞DNA成像的应用范围从重复和非重复的基因组位点扩展到了等位基因特异性和甲基化敏感性的检测。基于插入的策略，如CRISPR-Tag，通过紧凑的工程串联阵列实现了对单个位点的稳健标记，但由于需要对基因组进行修饰，这限制了它们在未经修饰的原始样本或临床样本中的适用性（Chen等人，2018年）。无变性方法通过在原位检测过程中保留染色体结构来解决不同的成像需求。CASFISH技术能够在不发生全局DNA变性的情况下可视化着丝粒、端粒和其他基因组区域，据报道目标标记可以在大约15分钟内完成（Deng等人，2015年）。除了缩短工作流程外，避免全局DNA变性还有助于保持相对的基因组结构，从而便于解释细胞核内位点的位置。RNA引导的内切酶原位标记（RGEN-ISL）进一步将这一原理扩展到了经过甲醛、乙醇和酸固定的样本中，使得能够同时分析重复DNA位点和通过5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）标记的复制位点或免疫荧光蛋白标记物（Ishii等人，2019年；N?ge?ková等人，2019年；Potlapalli等人，2020年）。因此，无变性标记的生物学效用不仅在于检测端粒或着丝粒，还在于将基因组结构与DNA复制和染色体相关的分子特征联系起来。

然而，当目标本身无法与背景可靠区分时，保持空间背景提供的信息是有限的。这一限制在低拷贝数和非重复序列中尤为明显，因为这些序列在端粒或卫星DNA处缺乏信号冗余。在Casilio发射序列的可编程成像（PISCES）和CRISPR-Sirius中开发的相关信号增强策略表明，多重报告分子的招募和稳定的引导支架可以大幅扩展可检测基因组目标的范围（Clow等人，2022年；Ma等人，2018年）。CasSABER技术将信号放大的检测扩展到了固定细胞中的非重复位点。经过多轮分支后，荧光强度分别增加了约20倍、27倍和34倍，从而能够可视化MUC4、HTT和FAM20C基因组区域。经过迭代扩增后，使用六个、三个或一个sgRNA时，分别在86%、84%和79%的细胞中检测到一个到四个基因组信号（Li等人，2023年）。多色成像进一步允许在同一细胞核内检查不同拷贝数的位点。这些结果表明，当信号放大能够将原本无法获取的低拷贝数序列信息转化为可空间计数的基因组信号时，它在生物学上是有价值的，而不仅仅是提高图像亮度。高对比度的CRISPR成像技术也已经被应用于微生物群体。CasPCR技术能够可视化沙门氏菌enterica细胞中的喹诺酮抗性基因，从而能够在混合群体中量化抗性细菌，并在来自家禽场的分离株中进行识别（Deng等人，2024年）。

然而，仅凭位点检测无法区分遗传异质性，尤其是当生物学上的差异存在于目标序列本身时。sgGOLDFISH技术能够在固定细胞中对非重复基因组位点进行单核苷酸级别的区分，例如在MUC4（每细胞0.56个焦点对比0.07个焦点）和LMNA（每细胞1.17个焦点）之间（Wang等人，2022年）。在患者的Hutchinson-Gilford早衰症成纤维细胞中，该方法能够区分携带致病性LMNA c.1824C>T等位基因的细胞和经过突变校正的细胞，同时保留了突变位点的亚核定位信息。CasPLA技术通过实现对单个细胞和组织切片中选定的mtDNA SNVs的等位基因选择性可视化，进一步扩展了序列信息的应用范围（Zhang等人，2018年）（图7C）。野生型和突变型mtDNA被分别作为不同的空间点检测并在MCF-7和MDA-MB-231细胞中独立量化，从而可以在不进行群体平均的情况下评估异质性成分。该方法随后被应用于异种移植组织切片，证明可以在保持组织学背景的同时评估序列异质性。成像还捕捉到了通过隧道纳米管在细胞间的mtDNA转移，提示了线粒体异质性在细胞间传播的潜在途径。CasPLA技术还扩展到了对核基因组中单个拷贝KRAS位点的成像。

工程CRISPR平台也被用于基于甲基化的DNA识别，将序列编程的靶向与荧光或扩增为基础的表观遗传状态读数联系起来（Hwang等人，2024年；Smith等人，2025年）。甲基化敏感的转录增强传感技术在癌症相关样本中实现了亚飞摩尔级的甲基化目标检测（Han等人，2023a），而基于Cas12a的荧光平台则实现了对血液和组织样本中位点特异性甲基化生物标志物的多重分析（Ding等人，2025年；Li等人，2024a）。因此，生物学问题从识别位点上的序列转移到了确定该序列是否携带疾病相关的表观遗传状态。当甲基化等位基因仅占总DNA的一小部分时，这种区分尤为重要。甲基化敏感的限制性内切酶（MSRE）与CRISPR/Cas12a结合的检测技术实现了报告的分析灵敏度为1阿摩尔，相当于在10微升反应中检测到大约六个甲基化DNA分子，并能够在大量未甲基化DNA中区分出0.1%的甲基化DNA（Pataer等人，2024年）。当应用于基因组DNA时，同一研究在HeLa细胞和A549癌细胞中检测到了比293T细胞更高的RARβ甲基化水平，其中HeLa细胞的甲基化水平更高。这些结果表明，荧光读数不仅能揭示表观遗传状态的细胞类型依赖性差异，还能证明分析灵敏度。结合催化发夹组装（CHA）或重组酶聚合酶扩增（RPA）的相关MSRE-CRISPR策略进一步将位点特异性甲基化分析扩展到了复杂样本，并提高了对低丰度甲基化目标的区分能力（Ding等人，2024年；Lu等人，2024年）。这样的测量对于循环肿瘤DNA（ctDNA）尤其相关，因为在ctDNA中，肿瘤相关的甲基化分子可能在这种大量非肿瘤来源的细胞游离DNA的背景下以非常低的浓度存在。与批量甲基化分析相比，空间分辨的核酸成像可以揭示肿瘤内的表观遗传异质性，并识别组织样本或肿瘤来源的循环细胞制备物中罕见的甲基化阳性细胞群体。然而，进一步的临床应用需要在大型患者队列中进行验证，确保与常规活检和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的兼容性，并制定标准化的定量阈值用于诊断解释。

4.2.2. RNA成像
工程CRISPR RNA成像技术在固定细胞中可以在固定时保留转录本的定位，并支持转录位点、单个RNA分子以及RNA聚集体的空间映射和计数。固定细胞RNA成像在空间分子病理学中具有重要意义，因为转录本的数量、亚细胞定位和细胞类型特异性分布可以提供诊断或预后信息。从工程报告系统到内源性单RNA检测的转变逐渐扩展了从固定样本中可获得的生物学信息。TriTag提供了一个早期框架，用于在单个位点整合基因组位置、新生转录和蛋白质输出，揭示了基因和等位基因在转录活性方面的显著差异（Xu等人，2020年）。然而，它需要对基因组进行工程改造，这限制了其在未经修饰的生物或临床样本中的适用性。随后的CRISPR成像技术越来越多地转向对内源性RNA的直接检测，尤其是对于低丰度RNA而言，单个转录本的可检测性变得尤为重要。CRISPR-Sunspot（图7D）通过放大目标相关的荧光解决了这一灵敏度限制，实现了在单个分子水平上检测内源性mRNA（Sun等人，2020年）。在固定样本中，单个RNA检测的分析价值尤为明显，因为可以在保留细胞和组织学背景的同时量化转录本的数量。RCasFISH技术在固定细胞和FFPE乳腺癌组织中检测到内源性HER2 mRNA作为离散的点状结构，允许在单细胞水平上直接计数转录本的数量（Wang等人，2020年）（图7E）。在一个包含82个FFPE样本的队列中，有55个样本的RCasFISH检测结果与常规FISH和免疫组化的综合结果一致度为94.5%。在FISH检测结果不确定的样本中，平均每个细胞的HER2转录本数量介于43.3到101.4个点之间。因此，单RNA计数可以保留可能被分类诊断或群体平均测量所掩盖的定量异质性。它还将分子丰度与单个病理细胞联系起来。

单RNA检测还允许独立于转录本数量来量化RNA的定位。固定细胞验证结果显示，CRISPR-Csm成像显示NOTCH2点与smFISH信号有85%的共定位，在78%的转染细胞中检测到不同的细胞质点（Colognori等人，2023年；Xia等人，2025年）。空间测量进一步揭示了转录本特异性组织：NOTCH2 mRNA优先分布在核周区域，而MAP1B转录本则集中在细胞周围。这些分布表明，转录本丰度和空间组织代表了RNA调控的不同维度。即使在细胞中丰度相似的RNA，也可能占据明显不同的亚细胞环境。翻译过程的干扰进一步增加了P-体与MAP1B mRNA-DCP1A的共定位，这将转录本组织的改变与RNA相关区室的重塑联系起来。序列选择性RNA成像将固定细胞分析从转录本丰度和定位扩展到RNA序列异质性的空间评估。InCasRD能够快速成像肿瘤细胞中的survivin mRNA、miR-21和circ1785，并在肿瘤组织切片中区分表皮生长因子受体（EGFR）L858R变异和OTU去泛素化酶1（OTUD1）SNV（Zhao等人，2026年）（图7F）。由此产生的空间图谱勾勒出突变阳性区域和肿瘤边界，说明如何在保持组织背景的情况下评估RNA序列变异，而不仅仅是通过群体平均值测量来推断。然而，未来的工作应该建立标准化的RNA保存程序和自动化的RNA点检测方法。当可以检测到单个转录本时，还需要标准化的计数算法、阳性及阴性对照以及来自患者样本的验证数据集。

5. 结论与展望
除了基因组工程之外，CRISPR-Cas系统已经发展成为可用于观察活细胞、固定细胞和组织样本中核酸的可编程平台。通过系统地工程化Cas效应子、导向RNA、荧光报告基因和辅助功能模块，CRISPR成像已经从重复的基因组区域扩展到非重复和低拷贝位点、序列变异以及单个RNA分子（Albrecht等人，2024年；Chen等人，2013年；Li等人，2023年；Morita等人，2024年；Sun等人，2020年；Wang等人，2020年）。这些进步使得能够在保持单个细胞空间背景的情况下，对基因组组织、染色质流动性、转录本定位和运输、翻译以及病毒核酸动态进行定量分析（表1）。总体而言，工程化的CRISPR成像提供了一个独特的框架，将序列编程的分子识别与无法通过群体平均值测量获得的空间和时间信息联系起来。这篇综述总结了实现这些能力的分子工程策略，并强调了将它们进一步发展到稳健、定量且生物学信息丰富的核酸成像所需的考虑因素。

表1. 代表性工程化CRISPR成像平台的优点和局限性。

| Cas蛋白 | 方法 | 优点 | 局限性 | 目标 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 荧光蛋白标记的Cas效应子 | Cas9d | 较优的sgRNA设计可提高信号强度；无需外源序列插入 | 需要多个sgRNA以获得强信号；未结合的dCas9会产生背景 | 重复的基因组位点 |
| dCas9-mCherry | 95%纯度；双色成像；对细胞周期影响小 | 仅限于核内目标；耗时 | 重复的基因组位点 |
| CASFISH | 无变性且快速的固定细胞DNA成像；兼容多色标记 | 需要大量的sgRNA；限于固定细胞成像 | 重复和非重复的基因组位点 |
| CRISPR-Sunspot | 强信号放大；无需基因组修饰即可成像低丰度RNA | 复杂的sgRNA/PAM呈现寡核苷酸（PAMmer）设计；需要仔细的不匹配验证 | 单个内源mRNA |
| Cas13dPsp | 内源靶向；正交多色成像；微观时间分辨率；无需基因组插入 | 内源RNA转录本 |
| Cas13b-EGFp | 成像未经修饰的编码RNA；实时翻译跟踪；翻译速率为3.3个密码子/秒；使用抑制剂验证 | 光漂白校正；限于细胞质；多导向设计 | 单个mRNA分子 |
| CasFAS | 多色RNA成像；八倍Pepper基信号增强 | 复杂的组装；适配体稳定性有限 | 内源和病毒RNA |
| TRAP-tag | Tat肽阵列和荧光适配体；模块化设计；低丰度内源RNA | Tat阵列增加蛋白质大小；需要外源转激活响应（TAR）适配体表达 | 低丰度内源RNA |
| Cas12CRISPRdelight | 多路成像卫星DNA；48× crRNA阵列与hyperdLbCas12a组合 | 劳动力密集；可能影响邻近基因表达；脱靶crRNA结合 | 非重复和卫星基因组位点 |
| CsmsmLiveFISH | 追踪未经修饰的mRNA；多路crRNA排序（24×）；与smFISH有85%的共定位 | 复杂的阵列设计；与短非翻译区不兼容；干扰RNA折叠 | 单个内源mRNA |
| Fluorescent probe-integrated guide RNA | Cas9Molecular beacon（MB） | 无标签的dCas9基成像；光漂白寿命延长2.5倍；双色端粒/着丝粒成像，交叉干扰小于5% | 昂贵；不稳定；衰减率高 | 重复的基因组位点（端粒） |
| Dual-FRET MB | 更高的信噪比（2.4倍）；非重复的MUC4（3个sgRNA） | MB穿透力低；假阳性信号风险 | 非重复的基因组位点（MUC4） |
| RCasFISH | 改进的信噪比；快速的多路RNA成像；分辨率达到FISH的16倍 | 需要每个转录本16个MS2 sgRNA；要求无RNase条件 | 单个HER2 mRNA分子 |
| CasSABER | 单个sgRNA实现非重复位点成像；可调的PER长度 | 探针递送效率低；耗时；仅限固定细胞 | 非重复和单拷贝基因组位点 |
| CasPLAS | mtDNA SNP的空间可视化；双色 | 需要两个sgRNA | mtDNA SNP和单拷贝核位点 |
| CRISPR/Pepper-tDeg | 单个sgRNA实现非重复位点成像；实时双色跟踪 | 需要优化的FP-tDeg核表达；存在脱靶结合风险 | 重复和非重复的基因组位点 |
| CRISPRainbow | 最多六色的活细胞基因组位点成像 | 需要高度重复的目标区域 | 高度重复的基因组位点 |
| CRISPR-Sirius | 稳定的sgRNA；多色成像≥20拷贝位点 | 需要聚集的重复目标位点；遗传编码组件 | 低拷贝重复基因组位点 |
| Casilio | 单导向非重复位点成像；三色多路成像 | 需要多价PBS阵列和多组分表达 | 重复和非重复的基因组位点 |
| fCRISPR | 信噪比大约提高26倍；追踪基因组位点和双链断裂（DSB）修复 | 多组分表达；已证明可检测≥14个目标拷贝 | 重复和低拷贝基因组位点 |
| RGEN-ISL | 无变性；多色；兼容免疫染色 | 主要用于重复位点 | 重复的基因组位点（着丝粒） |
| Cas12dCas12a | 高信噪比；广泛的靶标可编程性；灵活的PAMmer设计 | 正交性限制；依赖crRNA | 内源RNA转录本 |
| MSRE1 aM | 甲基化DNA；双认证机制；单个HpaII位点足够 | MSRE位点少；脱靶效应 | 罕见的MSRE位点；特定位点的甲基化DNA |
| Cas13Cas13a/crRNA | 30分钟检测时间；4.5阿摩尔检测限；4-log动态范围；crRNA可编程适用于任何miRNA；RNA探针（FQ5U） | 活细胞成像困难；crRNA少于20个核苷酸时活性急剧下降 |
| Functional module-assisted CRISPR platforms | Cas9QD | 双色QD共定位（QD525/625）；单拷贝HIV前病毒（1.6±0.4/细胞） | 多步骤转染（6-12小时）；限于固定的HIV长端重复序列 |
| QD-PRV | 单病毒标记；非侵入性标记；与包膜有91.3%的共定位 | 每个病毒颗粒一个QD；长期跟踪受限 | 病毒基因组DNA（PRV） |
| Cas12/13QD | 一步水热QD合成；高信噪比（3.2）；多重DNA/RNA检测（530/608纳米） | 宽半高宽限制≥3-重检测；Cd2+抑制Cas活性 | DNA和RNA靶标 |

5.1. 用于多种成像应用的CRISPR策略工程
在工程化CRISPR成像中，一个核心考虑是没有任何单一的标记或信号增强策略适用于所有成像场景，因为信号强度、标记效率或时间分辨率的提高可能会带来背景、分子扰动、递送复杂性或成像持续时间的权衡。因此，工程策略的选择应基于生物学问题、目标丰度、样本类型以及所需的空间和时间分辨率。对于染色质或RNA动态的长期活细胞成像，低干扰标记、瞬时递送、光稳定的报告基因和高效的光子捕获对于在长时间观察中保持内源性分子行为尤为重要。相比之下，对于低拷贝、非重复或序列分辨的目标，高目标特异性和高效的分子识别转化为荧光成为主要的设计要求，这有利于多价报告基因的招募、荧光激活或空间限制的信号放大。固定细胞和组织成像则有不同的约束条件，包括目标的可访问性、样本依赖的背景、探针的渗透性以及与固定和处理程序的兼容性。这些不同的要求强调了需要根据特定应用的表现标准来评估工程化CRISPR成像平台，而不仅仅依赖单一的信号增强指标。

5.2. 定量成像的挑战与机遇
在工程化CRISPR系统能够在多种生物学背景下提供稳健且定量可比的核酸成像之前，仍存在几个挑战（图8）。首先，信号保真度是成像性能的基本决定因素，特别是对于低拷贝目标。不完美的导向-目标识别、Cas-报告基因复合物的非特异性积累、未结合报告基因的荧光以及工程化导向RNA的不稳定性都会降低信噪比并产生假阳性信号。进一步的改进可能来自基于序列和结构的导向设计、稳定的报告基因招募支架、具有改进目标分辨能力的工程化Cas效应子，以及将荧光生成限制在有效识别事件中的目标依赖性荧光系统。其次，细胞内实现必须平衡高效标记与对观察中的生物过程的最小干扰。可变表达、递送效率低、细胞内重新分布和目标占据时间延长都可能改变标记效率或分子动态。预先组装的核糖核蛋白复合物的瞬时递送、简化的成像架构和低负担的报告基因系统可能有助于减少这些效应，同时提高实验的可重复性。第三，光漂白和光毒性继续限制着纵向成像。更亮、更光稳定的报告基因、抑制背景的荧光策略以及高效的光子捕获应能延长观察时间并提高时间采样效率，同时减少光诱导的扰动。最后，不同CRISPR成像平台之间的定量分析标准化程度不足。图像采集、背景校正、分割、分子计数、轨迹分析和信号阈值的差异可能会限制实验和实验室之间的比较。人工智能（AI）和机器学习方法可以在分子和分析层面发挥作用，通过促进Cas和导向RNA的设计、分子定位和计数、细胞分割、轨迹提取以及空间模式识别来提供帮助。然而，它们的效用将取决于实验验证的预测、具有代表性的成像数据集、标准化的分析输出以及与适当参考方法的对比。

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图8. 工程化CRISPR基础核酸成像的挑战与展望。当前的CRISPR基础核酸成像在目标特异性、递送效率、导向RNA稳定性和定量重复性方面面临挑战。预计导向RNA工程、高效递送系统、AI引导的设计、光稳定报告基因和标准化分析的进步将提高CRISPR成像的特异性、稳定性和定量可靠性，特别是对于低拷贝基因组目标和天然细胞环境中的单个RNA分子。使用BioRender.com创建。

5.3. 临床转化的剩余障碍
尽管在灵敏度和定量性能方面取得了显著进展，但工程化CRISPR成像在临床相关样本中的验证仍不够充分。尽管已在原代细胞、异种移植切片和临床FFPE组织中证明了其可行性，但尚不清楚是否能够在异质患者来源的样本中保持定量性能，因为在这些样本中，组织组成、核酸完整性、固定和样本处理可能会显著影响目标的可访问性和信号恢复（Colognori等人，2023年；Sun等人，2020年；Wang等人，2020年；Xia等人，2025年；Zhang等人，2018年）。这些挑战也依赖于样本类型。在固定组织中，核酸保存、探针渗透性和固定依赖的目标可访问性会影响信号恢复，而活细胞成像则需要平衡标记效率与对天然染色质或RNA动态的潜在扰动。另一个障碍是缺乏定量标准化，因为图像采集、背景校正、分割、分子计数和分析阈值的变异性阻碍了不同平台和实验室之间的有意义比较（Tian等人，2023a）。因此，向临床转化的进步将需要标准化的工作流程和对照，以及与smFISH、RNAscope、传统FISH、免疫组化和基于测序的检测方法进行系统的基准测试，以确定CRISPR衍生测量的准确性和可重复性（Wang等人，2020年；Zhang等人，2018年）。最终，CRISPR成像的临床价值不仅取决于分析性能，还取决于其能否将分子身份与亚细胞定位、细胞间异质性、序列分辨的空间信息以及分子动态结合起来，提供超越现有分子检测方法的可靠和具有生物学信息量的测量结果。

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