阴道微生态中益生菌干预对奶牛阴道菌群的影响：基于16S rRNA基因测序与培养联用的研究

《Veterinary Research Communications》：Characterization of the vaginal microbiota of dairy cows treated with probiotics

约50%的奶牛在产后发生子宫疾病，严重影响繁殖性能和经济收益。治疗通常以抗生素为基础，但替代方案亦在探索之中。本研究评估了阴道内补充乳酸菌（LAB）对阴道微环境的影响，重点关注微生物活力、pH及分类学组成。研究选用21头非妊娠、多胎次、非泌乳期且发情周期同步化的泽西奶牛。动物被随机分为两组：益生菌组（PRO；n=11）接受两枚含鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）的阴道胶囊，剂量为4.5×10¹⁰ CFU/胶囊；对照组（CTR；n=10）接受两枚不含LAB的阴道胶囊。PRO组中鼠李糖乳杆菌的回收率显著高于CTR组（p<0.0001）。CTR组与PRO组之间阴道pH无显著差异（p>0.05）。基于16S rRNA基因的微生物群分析显示，在属水平上CTR组与PRO组之间差异丰度无显著差异（q>0.05）。然而，采用配对设计的PERMANOVA分析揭示，组别×时间点模型对微生物群落组成具有显著影响（p=0.004）。本研究首次对接受益生菌LAB菌株治疗的奶牛的阴道微生物群进行了表征。在所测试浓度下，鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌未改变第14天前的阴道pH，也未在第4天或第7天显著改变单个分类单元的丰度；然而，配对分析检测到与治疗相关的显著群落组成变化。

研究背景方面，乳制品行业在全球营养供应和经济发展中具有重要地位，保障动物健康是维持乳品生产系统生产力和可持续性的基础。传统兽医实践侧重于疾病诊断和抗生素治疗，但该方式可能导致动物源性食品中的药物残留，并促进人畜共患病原体与人类相关微生物之间的交叉耐药性产生（ECDC et al. 2024）。因此，健康管理的理念已拓展至疾病预防、生产力提升和健康促进，涵盖动物福利、公共卫生和环境可持续性（Gunnarsson 2006）。在影响奶牛群生产力的关键因素中，繁殖健康尤为突出（Inchaisri et al. 2010）。据估计，约半数奶牛在产犊后发生子宫疾病，对繁殖力、产奶量和群体寿命产生负面影响（Sheldon et al. 2009）。相关经济损失显著，近期研究显示，综合所有繁殖疾病，每群年均成本约为20,013欧元，每头牛约100欧元；群体水平上，急性子宫炎的年均成本最高（每头牛每年30欧元），经济影响主要归因于产奶损失、淘汰、兽医服务和治疗费用（Wicaksono et al. 2025）。因此，需要改进子宫疾病的预防和早期诊断。奶牛子宫微生物群在产后迅速变化，有利于拟杆菌门（Bacteroidetes）和梭杆菌门（Fusobacteria）等厌氧菌的增殖（Jeon et al. 2015）。微生物组的转变是子宫疾病发生和转归的关键因素。有观点认为阴道微生物群与子宫炎和子宫内膜炎等子宫疾病的发生直接相关（Jeon et al. 2015; Bicalho et al. 2017）。既往证据表明，乳杆菌（Lactobacillus）菌株通过产生乳酸、过氧化氢和细菌素等有机酸抑制人阴道内其他内源性细菌的生长（Aroutcheva et al. 2001）。尽管牛的データ有限，但据推测奶牛中存在类似机制。在牛中，乳杆菌属存在于阴道微生物群中，但丰度通常较低。近期研究表明，调节阴道微生物组可能成为抗生素治疗的替代方案。益生菌定义为"当以足够量施用时对宿主产生健康益处的活微生物"（FAO/WHO 2001; Hill et al. 2014）。阴道内益生菌可能在产后子宫疾病的预防管理中发挥重要作用（Adnane and Chapwanya 2022）。阴道内益生菌的益处已在产后疾病发生率、产奶量和炎症标志物表达等方面进行了评估（Ametaj et al. 2014; Deng et al. 2015, 2016; Genís et al. 2017, 2018; Madureira et al. 2023）。本研究使用的菌株（L. rhamnosus LR04和LR06以及L. reuteri LRE02）为市售益生菌菌株；LR04和LRE02已有益生菌使用记录，且此前曾联合使用（Drago et al. 2020），LR04对大肠杆菌（Escherichia coli）具有已报道的活性（Mogna et al. 2012; Genís et al. 2018），而含鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌的相关LAB组合已在奶牛中经阴道给药（Genís et al. 2017, 2018）。然而，与人阴道环境以低pH为特征不同，牛阴道维持近中性pH。因此，使用这些菌株的理论依据主要不在于酸化作用，而在于其竞争排斥、上皮黏附以及产生抗菌物质抑制病原体的潜力。阴道内益生菌的益处已在产后疾病发生率、产奶量和炎症标志物表达等方面进行了评估（Ametaj 2014; Deng et al. 2015, 2016; Madureira 2023）。然而，通过该给药途径的益生菌活力及其对治疗奶牛pH和微生物群的影响尚未被描述。因此，本研究旨在评估基于乳杆菌组合（L. rhamnosus和L. reuteri）的阴道内益生菌对阴道微环境的影响，重点关注微生物活力、pH和分类学组成。

研究人员开展了以下研究：试验在巴西南部Embrapa Clima Temperado进行（31°49'02.1"S 52°27'14.2"W）。选用21头非妊娠泽西多胎次奶牛，放牧饲养，非泌乳期，平均体况评分（BCS）为3.5（1至5分制）。动物接受完整妇科检查，包括超声评估子宫和卵巢以确定繁殖状态，仅健康动物纳入研究。所有动物按照伦理与动物实验委员会指南处理，实验方案经南里奥格兰德联邦大学批准（方案编号44088）。所有动物在治疗开始前10天（D-10）肌肉注射150 mg长效孕酮（Sincrogest?, Ouro Fino, Cravinhos, S?o Paulo, Brazil），以确保所有动物处于相似的繁殖内分泌状态，因为激素可改变阴道微生物组成（Bo et al. 1995）。孕酮注射每周一次直至D14，实验期间共四次给药。奶牛在第0天（D0）被随机分配至两个阴道治疗组：对照组（CTR；n=10）仅接受两枚不含LAB的明胶胶囊；益生菌组（PRO；n=11）接受两枚含益生菌LAB菌株的胶囊。清洁外阴后，使用可在操作间灭菌的装置将胶囊无菌放置于阴道穹窿。益生菌治疗由LAB混合物组成，包括鼠李糖乳杆菌LR06（DSM 21981）、鼠李糖乳杆菌LR04（DSM 16605）和罗伊氏乳杆菌LRE02（DSM 23878），均分离自人类，最终细胞计数为4.5×10¹⁰ CFU/胶囊，三种益生菌菌株比例为12:12:1。基于既往文献选用鼠李糖乳杆菌和罗伊氏乳杆菌冻干菌株混合物（Genís et al. 2017, 2018; Madureira et al. 2023）。阴道拭子在胶囊插入时（D0）、D2、D3、D4、D7和D14采集，使用专用装置。清洁外阴后，将装置插入阴道，回缩外管暴露拭子。通过旋转拭子使其接触阴道壁采集阴道样本。随后重新插入外管覆盖拭子，避免取出时污染。装置在动物间用70%酒精清洁并火焰灭菌。每个采样时间点每头动物采集五个拭子：两个置于含MRS半固体琼脂的Falcon管中运输，冷藏（8°C）用于后续微生物培养；另外三个拭子冻存（-20°C）于300 μl分子稳定液（SEMol）中用于后续微生物群分析。收集的拭子接种于含MRS琼脂的培养皿，37°C厌氧培养48 h。48 h观察到的菌落进行革兰染色。约40 μl蒸馏水滴加至显微镜载玻片，用细菌接种环将少量菌落转移至蒸馏水中。样品匀质后，在层流罩中加热固定。染色过程使用结晶紫、卢戈氏碘液和丙酮。随后经品红复染后，蒸馏水洗涤并风干。载玻片在1000倍油浸显微镜下分析，评估形态（球菌或杆菌）和颜色（紫色/紫罗兰色为革兰阳性，粉色/红色为革兰阴性）。D2和D4采集的革兰染色杆菌阳性样本送至商业实验室通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）进行菌种鉴定。CTR组（n=5）和PRO组（n=5）奶牛在D4和D7采集的阴道拭子样本（因生长数据表明益生菌活力持续至D4并在D7前清除）使用标准商业试剂盒提取DNA（Nextera DNA Library Preparation Kit, Illumina），按制造商方案操作。通过NanoDrop分光光度法（Thermo Scientific）评估质量和定量。使用引物341F/805R扩增16S rRNA基因高变区V3-V4约460 bp片段，PCR条件为：95°C初始变性3 min；随后25个循环的95°C变性30 s、55°C退火30 s、72°C延伸30 s，最终72°C延伸5 min。扩增子使用Illumina Nextera双索引条形码标记，条件为：95°C初始变性3 min；随后8个循环的95°C 30 s、55°C 30 s、72°C 30 s，最终72°C延伸5 min。产物纯化、合并后在Illumina NextSeq平台测序（Degnan and Ochman 2012），产生300 bp双端读长。生物信息学预处理：使用fastp v0.23进行质量控制（Chen et al. 2018），包括Illumina接头去除、5'端引物修剪（R1固定修剪17 bp，R2固定修剪21 bp）、质量过滤（Phred评分≥20，4-bp滑动窗口）以及去除短于150 bp的读长。过滤后的读长使用Bowtie2 v2.5（Langmead and Salzberg 2012）以"very-sensitive"模式比对至Bos taurus参考基因组（ARS-UCD1.3, Ensembl release 112）。双端均未比对至牛基因组的读长对保留为微生物读长（samtools v1.x, flags -f 12 -F 256）。D4样本平均宿主比对率为45.6%，D7样本为64.1%，凸显了阴道黏膜样本中宿主DNA去除的重要性。高宿主-微生物DNA比率是牛阴道样本公认的挑战，宿主来源DNA降低了可用于微生物内容的有效测序深度（Ong et al. 2022）。D4和D7之间宿主比对率的差异因此转化为时间点之间有效微生物深度的不均衡，这些比率被明确报告以便在解释下文呈现的多样性估计时考虑该变异来源。文库制备和DADA2处理：微生物读长使用DADA2 v1.30流程（Callahan et al. 2016）在R v4.x环境中处理。根据质量图谱目视检查，读长截断至270 bp（R1）和200 bp（R2），正向和反向读长最大期望错误阈值均为2（maxEE=c(2,2)），去除含模糊碱基的读长（maxN=0）。使用DADA2参数化错误模型估计错误率，随后去重复并推断扩增子序列变体（ASVs）。对于341F/805R扩增子（含引物464 bp; Klindworth et al. 2013），引物修剪后插入片段约426 bp，因此此处应用的截断长度（R1 270 bp和R2 200 bp）产生约44 bp的预期正反向重叠。这超过DADA2 mergePairs函数要求的最小重叠12 bp（Callahan et al. 2016），因此与读长对的可靠合并兼容。正向和反向读长合并，使用共识方法（removeBimeraDenovo）去除嵌合序列。分类学分配使用DADA2朴素贝叶斯分类器，针对SILVA v138.1数据库（Quast et al. 2012），最小bootstrap置信阈值80%。分类为叶绿体、线粒体或缺乏门级分配的ASVs从最终数据集中去除。阴道pH测量使用商业试纸（Kasvi），量程0至14，间隔为1。每头动物在D0、D2、D3、D4、D7和D14每天测量一次pH，使用单条pH试纸。pH试纸附着于Hartmann钳尖端，通过先前用于采集拭子的硬管插入，定位于宫颈入口并压向阴道侧壁。试纸在阴道内保留约10 s后取出，使用制造商提供的比色卡读数。统计分析：连续数据分布使用Shapiro-Wilk检验分析，必要时进行归一化。pH数据通过方差分析（ANOVA）分析。分析使用JMP统计软件（JMP Statistical Discovery LLC）进行。所有生态学分析在R中使用phyloseq v1.46（McMurdie and Holmes 2013）、vegan v2.6（Oksanen 2022）和microbiome（Lahti and Shetty 2018）包进行。由于脲原体属（Ureaplasma）表现出可变优势和显著的个体间变异（PRO组D4时SD=38.9%），所有分析同时使用完整数据集（Full Dataset）和去除脲原体属的数据集（without Ureaplasma）进行，以评估该优势分类单元对观察到的微生物群落模式的影响。Alpha多样性使用Observed ASVs、Chao1、Shannon和Simpson指数评估。采用以下统计方法：（i）Wilcoxon秩和检验（Mann-Whitney U检验; Mann and Whitney 1947）比较各时间点组间差异；（ii）对组间配对差值（ΔD7–D4）应用Wilcoxon秩和检验，从而考虑重复测量设计；（iii）配对Wilcoxon符号秩检验比较各组内D4和D7。所有P值使用Benjamini-Hochberg程序进行多重比较校正。Beta多样性通过基于相对丰度计算的Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）和基于中心对数比（CLR）变换后的主成分分析（PCA）评估，后者适用于成分数据（Gloor et al. 2017）。微生物群落组成差异使用PERMANOVA（adonis2, 999次置换）以组别×时间点模型评估，分别在无限制和以动物为约束的置换（strata=animal_id）下进行，以考虑配对重复测量设计。分析使用Bray-Curtis和Aitchison（CLR变换数据加欧几里得距离）相异性指标进行。多变量离散度同质性使用BETADISPER评估。差异丰度使用两种考虑扩增子测序数据成分性质互补方法评估。ANCOM-BC2（Lin and Peddada 2020）使用最小流行率阈值10%、文库大小截断值1,000 reads、结构零检测和Benjamini-Hochberg校正（q<0.05）。ALDEx2（Fernandes et al. 2014）通过Dirichlet采样（128个蒙特卡洛实例）建模成分不确定性，使用Wilcoxon检验加Benjamini-Hochberg校正。两种分析均在属水平上对各时间点分别进行。联合使用这些方法是因为它们依赖不同假设处理成分数据：ANCOM-BC2估计并校正样本间采样比例的差异（Lin and Peddada 2020），而ALDEx2通过中心对数比变换和Dirichlet重采样建模成分不确定性（Fernandes et al. 2014）。在38个数据集的差异丰度方法基准测试中，ALDEx2和基于ANCOM的方法属于最保守且产生最一致结果的方法（Nearing et al. 2022）；因此并行应用它们在本研究规模的数据集中提供了严格的评估。分类学组成使用门和属水平的堆叠条形图可视化，分别呈现个体样本和按组别与时间点的平均相对丰度。所有图形使用ggplot2 v3.5和patchwork生成。所有比较以5%显著性水平评估（P<0.05）。研究得出以下结论：益生菌LAB菌株治疗未在第4天和第7天调节阴道微生物群，也未改变第14天前的阴道pH。PRO组给药的鼠李糖乳杆菌保持活力至第4天，而罗伊氏乳杆菌在治疗后未在奶牛阴道黏膜中检测到。据研究人员所知，这是首次使用培养依赖和分子方法相结合来表征接受乳杆菌益生菌菌株治疗的奶牛的阴道微生物群，为未来研究益生菌对牛繁殖健康的影响提供了新见解。

在关键技术方法方面，本研究主要采用以下方法：（1）动物模型与分组：选用21头非妊娠、多胎次、非泌乳期泽西奶牛（来自巴西南部Embrapa Clima Temperado试验场），经孕酮同步化发情周期后随机分为益生菌组（PRO；n=11）和对照组（CTR；n=10），阴道内给予含或不含LAB的胶囊；（2）微生物培养与鉴定：阴道拭子接种MRS琼脂厌氧培养，革兰染色筛选杆菌阳性样本，经MALDI-TOF进行菌种鉴定；（3）16S rRNA基因测序：提取阴道拭子DNA，扩增V3-V4高变区约460 bp片段，Illumina NextSeq平台双端300 bp测序，DADA2流程处理获得ASVs，SILVA v138.1数据库分类学分配；（4）阴道pH测定：使用商业pH试纸（量程0-14）经Hartmann钳置入阴道测量；（5）生物信息学与统计分析：Alpha多样性（Observed ASVs、Chao1、Shannon、Simpson）和Beta多样性（Bray-Curtis PCoA、CLR-PCA）分析，PERMANOVA（配对设计）、ANCOM-BC2和ALDEx2差异丰度分析。

研究结果方面，培养结果显示，PRO组奶牛在D2、D3和D4的杆菌生长显著高于CTR组（P<0.0001），D7时该差异不再检测到。培养生长并经革兰染色鉴定为杆菌的样本随后经MALDI-TOF分析，然而仅鼠李糖乳杆菌被MALDI-TOF鉴定出；胶囊配方中使用的罗伊氏乳杆菌菌株未被检测到。这些结果表明，在给药的两种菌种中，仅鼠李糖乳杆菌通过培养方法被回收。阴道pH方面，CTR组和PRO组平均pH值分别为6.8±0.2和6.9±0.1。在D0、D2、D3、D4、D7和D14各组间pH无显著差异（P>0.05）。微生物群研究方面，测序产出与质量控制显示，经fastp质量控制和牛宿主来源读长去除后，DADA2流程从20个样本中处理了总共3,524,715个微生物读长对。经质量过滤、去噪和嵌合体去除后，保留2,310,120个读长，代表9,711个ASVs， assigned至40个门和666个属。这些总数包括大量稀有、低流行率的ASVs；因此差异丰度检验仅限于至少在10%样本中存在的分类单元。每样本测序深度范围为10,193至251,768个读长。D4采集的样本平均测序深度（188,730读长/样本）高于D7采集的样本（49,854读长/样本）。稀释曲线表明大多数样本达到多样性采样饱和。去除脲原体属的数据集保留9,645个ASVs和1,789,592个读长，涵盖665个属，每样本测序深度范围为1,725至206,718个读长。Alpha多样性方面，PRO组在所有评估指标上显示低于CTR组的alpha多样性。非配对Wilcoxon检验表明D4时Shannon（W=1, p=0.022）、Observed ASVs（W=2, p=0.037）、Chao1（W=2, p=0.037）和Simpson（W=2, p=0.037）存在名义显著差异。然而，经Benjamini-Hochberg多重检验校正后，所有比较均未保持统计学显著性（校正p=0.073）。D7时，任何alpha多样性指标组间均无差异（p>0.40）。在去除脲原体属的分析中，D4时Shannon指数的信号略有增强（W=0, p=0.012），但经多重检验校正后仍未显著。比较组间时间变化（ΔD7–D4）的配对分析检测到D4时Shannon（W=1, p=0.02）、Observed ASVs（W=2, p=0.04）、Chao1（W=2, p=0.04）和Simpson（W=2, p=0.04）的显著差异。然而，经Benjamini-Hochberg多重检验校正后，所有比较均未保持统计学显著性（校正p=0.07）。D7时任何alpha多样性指标组间均无差异（p>0.40）。同样，各组内D4和D7之间的配对比较未显示任一组alpha多样性随时间发生显著变化（校正p>0.44）。Beta多样性方面，基于Bray-Curtis相异性的主坐标分析（PCoA）未显示PRO组和CTR组在任一时间点的明显分离。然而，以动物为约束的置换（配对设计）PERMANOVA检测到组别×时间点模型对微生物群落组成的显著效应，使用Bray-Curtis距离指标（R2=0.197, F=1.31, p=0.004）。该发现在去除脲原体属的数据集中一致，效应更为显著（R2=0.318, F=2.49, p=0.004），表明去除高度变异的优势分类单元提高了检测 underlying微生物群落差异的能力。值得注意的是，未以动物约束置换的PERMANOVA未达到统计学显著性（p=0.183），证明重复测量设计对于通过考虑个体间变异来检测益生菌治疗效应至关重要。相反，基于Aitchison距离（CLR变换数据加欧几里得距离）使用约束置换的PERMANOVA不显著（p=0.185），表明Bray-Curtis指标在该数据集中检测组成差异更为敏感。分类学组成方面，阴道微生物群在属水平上以脲原体属（Ureaplasma）为主导（D4时PRO组平均相对丰度29.9% vs. CTR组9.5%）、链球菌属（Streptococcus）（25.2% vs. 19.4%）、甲基娇养杆菌属（Methylotenera）（11.4% vs. 12.6%）、副球菌属（Paracoccus）（8.3% vs. 6.3%）和Cloacibacterium（6.5% vs. 4.3%）。值得注意的是，脲原体属在PRO组内表现出高个体间变异（SD=38.9%），提示该分类单元可能以样本特异性方式主导群落。这种显著的动物间变异与先前在牛中的报道一致，其中脲原体属反复被鉴定为优势阴道菌属，其丰度在个体奶牛间差异很大（Bicalho et al. 2017）；因此该分类单元的组水平均值应谨慎解释，这也是所有分析在去除脲原体属后重复进行的原因。甲基娇养杆菌属和副球菌属——通常与环境来源相关的属——的存在可能与采样过程中的水或环境污染有关，尽管它们也曾在牛黏膜微生物组中被报道。由于这些属也是低生物量扩增子测序中充分记录的试剂和实验室污染物（Salter et al. 2014），其存在应谨慎解释，并在可能的情况下与阴性提取和PCR对照交叉核对后再归因于阴道群落本身。差异丰度方面，ANCOM-BC2分析未在任一时间点鉴定出PRO组与CTR组之间丰度显著不同的属（所有分类单元q>0.05）。D4时q值最低的属为Clostridium sensu stricto 1（LFC=-0.68, q=0.223）和NK4A214 group（LFC=-0.60, q=0.223）。在去除脲原体属的数据集中观察到更低的q值（Clostridium sensu stricto 1: q=0.136; NK4A214 group: q=0.136），表明去除优势分类单元提高了分析分辨率，尽管仍未观察到统计学显著性。ALDEx2分析中经Benjamini-Hochberg校正后无属达到统计学显著性。然而，效应量分析在D4鉴定出生物学相关候选分类单元。Lacticaseibacillus——一种益生菌属——在PRO组中富集，并在所有属中表现出最大效应量（效应量=2.01, 未校正p=0.014），代表组间最大差异。相反，Bradyrhizobium（效应量=-1.22）和UCG-009 group（效应量=-1.32）在CTR组中富集。D7时，无分类单元表现出显著效应量。

讨论部分总结如下：本研究使用孕酮暴露奶牛模型测试了阴道内益生菌对局部微生物群的调节作用。主要发现为：（1）治疗后第4天分离到鼠李糖乳杆菌，同时PRO组D4时Lacticaseibacillus富集，提示该菌株可能在阴道内保持活力；（2）组间阴道pH无变化；（3）任一时间点PRO组与CTR组之间未观察到任何属的显著差异丰度；然而，检测到组别和时间点对微生物群落组成的显著效应，去除脲原体属后增强。为更好理解给药益生菌菌株的持久性，研究人员依赖微生物培养技术。多位研究者指出传统培养基仅能检测1%至2%的微生物（Torsvik et al. 2002）。本研究使用微生物培养方法估计奶牛生殖道中LAB的持久性。培养结果表明它们可能在阴道环境中保持高丰度直至D4。此后，传统体外培养方法不再检测到。研究人员推测此时期后出现细胞死亡和/或牛阴道微生物群土著微生物的竞争排斥。这些发现对未来研究具有相关性，并提示需要重复给药益生菌胶囊。其他研究者已报道这一点，建议每周应用（Ametaj et al. 2014; Deng et al. 2015, 2016）。然而，在MALDI-TOF菌种鉴定中，罗伊氏乳杆菌菌株未被检测到。研究人员提出存在活力降低和/或与鼠李糖乳杆菌菌株的竞争相互作用，尽管这些菌株此前已在组合中评估（Drago et al. 2020）。在选择本研究使用的LAB菌株时，研究人员考虑了先前从奶牛和女性阴道黏膜分离的菌种，如鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、加氏乳杆菌（L. gasseri）、嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）（Wang et al. 2013; Swartz et al. 2014; Graham et al. 2021; Shen et al. 2022）。此外，研究人员选择了具有已证实益生菌作用的市售菌株。因此，使用鼠李糖乳杆菌（LR04, LR06）和罗伊氏乳杆菌（LRE 02）冻干菌株配方。这些菌株已在对大肠杆菌的抑制试验中得到验证（Mogna et al. 2012; Chamignon et al. 2020），且此前曾联合使用（Drago et al. 2020）。Genís et al.（2018）显示，鼠李糖乳杆菌、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和罗伊氏乳杆菌益生菌菌株组合经阴道给药使奶牛子宫感染发生率降低58%。另一项使用类似益生菌菌株的研究报道在所研究的一个农场中子宫炎和子宫内膜炎发生率降低（Madureira et al. 2023）。对于未来研究，研究人员建议用致病性大肠杆菌菌株实验性攻击奶牛，因为本研究中采样奶牛的阴道微生物群中未检测到大肠杆菌。这应解释为缺乏分类至埃希菌/志贺菌属（Escherichia/Shigella）的ASVs，而非确定的种级鉴定，因为使用朴素贝叶斯分类器分类的短V3-V4扩增子通常不能将16S rRNA基因序列解析至种水平，特别是在肠杆菌科（Enterobacteriaceae）等分类学具有挑战性的类群中（Johnson et al. 2019）。尽管这些LAB菌株具有良好的背景及其影响阴道环境的潜力，本实验未观察到阴道pH的显著变化。考虑到这些微生物对阴道pH的先前报道效应，预期PRO组会表现出低于CTR组的阴道pH。然而，CTR组和PRO组之间平均阴道pH未观察到显著差异（P>0.05；分别为6.8±0.2和6.9±0.1）。与女性不同，奶牛阴道pH从中性至微碱性变化，范围为6.7至7.5（Beckwith-Cohen et al. 2012; O'Hanlon et al. 2013; Swartz et al. 2014）。在此背景下，重要的是注意虽然乳杆菌属嗜酸，但其代谢最适pH通常接近中性。例如，鼠李糖乳杆菌在pH 6.9时显示最佳生长动力学（Liew et al. 2005），该属一般在pH 5.5至6.2之间表现最佳生长（Hammes and Hertel 2015）。因此，本研究中观察到的中性pH提示牛阴道环境支持这些菌株的活力，而不一定诱导人阴道典型的显著酸化。相反，这些细菌可能面临高度竞争的环境，其中营养可用性而非酸度可能是主要限制因素。此外，关于数据解释，pH测量部位是一个重要问题。先前研究评估了不同解剖区域，如阴道前庭（后阴道）、阴道中段、前阴道和宫颈穹窿，报道了部位间pH值的差异（Beckwith-Cohen et al. 2012），以及pH评估方法的不同变化。激素状态是影响阴道环境的另一重要生理因素。阴道微生物群的分类学组成随发情周期阶段变化（De Ruiz Holgado and Nader-Macias 1999; Otero et al. 2000; Reid 2001）。本研究选择使用长效注射孕酮同步化动物以避免发情周期对阴道微生物群的影响，这可能间接影响给药益生菌的存活和定植。然而，必须承认，虽然使用非妊娠同步化奶牛提供了受控模型，但不能完全代表产后状况。与本研究中动物不同，产后奶牛经历免疫抑制和活跃的子宫复旧，这些生理条件可能改变宿主-益生菌相互作用。在牛中，乳杆菌属在发情周期中一致被报道为低相对丰度，在卵泡期比黄体期更丰富（Quereda et al. 2020）。乳杆菌种在奶牛阴道微生物群中常见，在80%的肉牛阴道样本中检测到，但相对丰度较低（占总16S rRNA基因种群的0.36±0.66）（Swartz et al. 2014）。在另一项奶牛后备牛研究中，乳杆菌属在卵泡期和黄体期采集的样本中分别检测到37%（7/19）和10%（2/20），相对丰度较低（0.19±0.04%）。本研究中，在所有采集日中，乳杆菌属在治疗后D4最常分离到（81.8%; 9/11）。这些发现提示治疗诱导的效应，反映在PRO组干预后D4观察到的微生物种群动态变化中，而CTR组则无。此外，差异丰度分析揭示PRO组中Lacticaseibacillus的富集，进一步证明这些变化与LAB治疗相关。值得澄清的是，基于培养/MALDI-TOF鉴定（Lactobacillus rhamnosus）与基于扩增子的差异丰度结果（Lacticaseibacillus）之间属名的表面差异是命名法而非生物学上的。2020年乳杆菌属重新分类将L. rhamnosus连同L. casei组的其他前成员转入新属Lacticaseibacillus（Zheng et al. 2020），这是本研究用于分类学分配的SILVA v138.1参考数据库采用的命名法，而商业益生菌和MALDI-TOF参考库仍使用旧名。因此，基于培养和基于扩增子的结果是一致的且相互强化而非不一致的，研究人员建议未来此类研究在培养依赖和分子数据集之间明确协调属级命名法，以避免这一潜在的读者困惑来源。健康奶牛的微生物组通常富含厚壁菌门（Firmicutes）细菌，而发生子宫炎或子宫内膜炎的奶牛倾向于显示更高相对丰度的拟杆菌门（Bacteroidota）（Miranda-CasoLuengo et al. 2019; Galv?o et al. 2019; Adnane and Chapwanya 2022; Tasara et al. 2023）。样本中相对丰度较高的分类单元为脲原体属、链球菌属、甲基娇养杆菌属、副球菌属和Cloacibacterium。脲原体属是最常发现的属，无论动物的健康和繁殖状态如何（Bicalho et al. 2017; Galv?o et al. 2019）。根据Kudo et al.（2021），脲原体属在健康奶牛的阴道微生物群中占主导地位，并与其他细菌呈负相关。脲原体多样性（Ureaplasma diversum）先前已在包括巴西在内的多个国家的奶牛阴道微生物群中被报道（Azevedo et al. 2017; Nascimento-Rocha et al. 2017）。链球菌属细菌被认为是外阴、阴道、皮肤和胃肠道的常驻微生物群的一部分（Oliveira 2012）。多位作者报道链球菌属的分离作为共生和机会性微生物，常在病原菌存在时检测到而不对动物健康造成危害（Panangala et al. 1978; Kudo et al. 2021; Adnane and Chapwanya 2022）。使用标准培养基也观察到类似结果，其中链球菌属在阴道拭子样本中被鉴定。一些研究将α-溶血性链球菌与阴道微生物群中的益生菌特征相关联，提示其在预防生殖道感染（如子宫炎）中的潜在作用（Otero et al. 2000）。然而，其他作者报道了不同发现，提示该微生物可能通过产生青霉素酶促进更多病原菌的增殖，从而保护与子宫疾病相关的病原体（Silva and Lobato 1999; Sheldon et al. 2002）。本研究中，链球菌属被解释为阴道微生物群的机会性共生组成部分，因为纳入实验的所有动物均临床健康。在微生物分类单元表征之后，alpha和beta多样性分析揭示了阴道内益生菌给药对奶牛阴道微生物群短期效应的重要见解。D4时，CTR组表现出显著更高的丰富度和多样性，如大多数alpha多样性指数（包括Observed ASVs、Fisher's alpha、Simpson指数、Shannon指数和Pielou均匀度）的较高值所示。这表明益生菌治疗可能暂时降低了微生物多样性，可能由于涉及给药菌株的短暂优势或竞争相互作用。然而，这些差异至D7时不再明显，提示微生物群落随时间重新平衡。与Toquet et al.（2025）报道不同——该研究报道在人工授精前两次施用基于乳杆菌的益生菌在一个绵羊群中增加了妊娠诊断时的alpha和beta多样性——该效应并非在所有群体中一致观察到。有趣的是，尽管对alpha多样性有这些短暂效应，两个时间点均未观察到beta多样性的显著差异。这表明组间整体微生物组成保持相对稳定，未被益生菌治疗实质性改变。Beta多样性普通图（如PCoA）中的重叠椭圆进一步支持这一结论，提示虽然局部多样性指标可能波动，但阴道微生物群的全局结构在所测试条件下对短期益生菌干预具有韧性。Pascottini et al.（2020）进行的一项研究表明，泌乳天数（DIM; 10、21和35）对子宫微生物群的alpha或beta多样性均无显著影响。然而，根据子宫健康状况观察到明显区别。临床子宫内膜炎奶牛与健康奶牛和亚临床子宫内膜炎奶牛相比表现出独特的微生物谱。健康奶牛和亚临床子宫内膜炎奶牛显示比临床子宫内膜炎奶牛更高的alpha和beta多样性，提示微生物多样性降低可能与临床子宫内膜炎的发展相关。第4天或第7天微生物组成无统计学显著差异表明所用配方在该时间窗内未诱导可测量的常驻群落调节。此外，样本量可能降低了检测单个分类单元水平差异的效力，尽管通过配对PERMANOVA可检测到全局组成差异。PRO组中Lacticaseibacillus的富集与益生菌干预在生物学上一致，值得在更大统计效力的研究中进一步调查。微生物变化可能发生在评估窗口之外，即更早或更晚的时间点，或可能需要更长治疗持续时间以促进稳定定植和影响。此外，LAB菌株组合、浓度和配方可能并非在非泌乳、激素同步化奶牛的阴道环境中建立定植的最佳选择。修改剂量、调整配方、改变所用菌株或将治疗应用于不同生理阶段的奶牛（如过渡期奶牛）可能增加检测益生菌诱导的微生物谱变化的可能性。尽管微生物群未发生转变，D4通过培养观察到的杆菌生长显著增加提示可能发生了短暂定植，尽管该定植未持续或不足以改变整体细菌群落组成。这些短暂相互作用仍可能具有功能相关性，例如通过调节黏膜免疫或竞争排斥病原体。据研究人员所知，这是首次结合靶向培养依赖的乳酸菌回收与16S rRNA基因测序来监测接受益生菌菌株治疗的奶牛的阴道环境，为该领域未来研究开辟了新途径。迄今为止，其他作者（Ametaj et al. 2014; Deng et al. 2015; Genís et al. 2017）在使用益生菌后观察到的奶牛产后疾病发生率降低无法完全由微生物组的可检测变化来解释。扩增子方法的两个固有局限性也影响对未观察到调节的解释。首先，16S rRNA基因调查产生相对而非绝对丰度，因此乳杆菌生物量的真实增加（如本研究中培养所指示）若总细菌负荷同时变化则可能未被检测到。其次，分类单元间16S rRNA基因拷贝数的变异扭曲丰度估计且仍缺乏可靠校正（Louca et al. 2018）。用定量方法（如总细菌负荷或菌株特异性靶标的qPCR）补充扩增子数据将使未来研究能够区分无定植与无可检测组成变化。对阴道微环境的局部效应可能有助于调节炎症反应。仅依赖抗菌药物不足以遏制抗菌耐药性的上升；因此，开发农场动物疾病的替代治疗策略对于保障动物和人类健康至关重要。研究结论翻译如下：益生菌LAB菌株治疗未在第4天和第7天调节阴道微生物群，也未改变第14天前的阴道pH。PRO组给药的鼠李糖乳杆菌保持活力至第4天，而罗伊氏乳杆菌在治疗后未在奶牛阴道黏膜中检测到。据研究人员所知，这是首次使用培养依赖和分子方法相结合来表征接受乳杆菌益生菌菌株治疗的奶牛的阴道微生物群，为未来研究益生菌对牛繁殖健康的影响提供了新见解。