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猫弓蛔虫（Toxocara cati）是全球猫常见的肠道寄生虫。在黏膜表面，宿主免疫系统通过包括免疫球蛋白A（IgA）在内的多种机制防御入侵病原体如寄生虫。IgA在猫弓蛔虫感染中的确切作用尚不清楚。研究人员采用商业酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了猫弓蛔虫感
猫弓蛔虫（Toxocara cati）是全球猫常见的肠道寄生虫。在黏膜表面，宿主免疫系统通过包括免疫球蛋白A（IgA）在内的多种机制防御入侵病原体如寄生虫。IgA在猫弓蛔虫感染中的确切作用尚不清楚。研究人员采用商业酶联免疫吸附试验（ELISA）测定了猫弓蛔虫感染猫在驱虫治疗前后血清（n=8）和粪便（n=10）中的总IgA水平，并与非寄生虫感染猫的IgA水平（血清n=8，粪便n=6）进行比较。研究人员还通过免疫组织化学（IHC）可视化了猫IgA与猫弓蛔虫成虫的结合，并通过Western blot分析了IgA反应性抗原。对5条抗原条带进一步进行了质谱分析。研究人员发现血清或粪便中的总IgA水平与猫弓蛔虫感染之间无一致性。在免疫组织化学中，无论使用弓蛔虫阳性猫血清还是无病原体猫血清处理，猫弓蛔虫的肠道、生殖道、排泄管和肌肉细胞体均呈现最强的免疫反应性。当比较猫弓蛔虫感染猫血清和无病原体猫血清作为IgA来源进行Western blot时，大多数条带显示出非特异性IgA免疫反应性，与宿主的弓蛔虫感染状态无关。在质谱分析中，所选抗原条带中最主要的蛋白质为两种未表征蛋白质、中间丝蛋白、内质网蛋白（endoplasmin）、副肌球蛋白（paramyosin）、肌动蛋白（actins）和谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase）。本研究的综合结果表明，IgA对猫弓蛔虫主要具有非特异性作用。
猫弓蛔虫（Toxocara cati）是隶属蛔科（Ascarididae）的广泛分布的猫线虫。一项系统综述估计猫弓蛔虫在猫中的全球合并感染率为17%。猫及其他猫科动物为其终末宿主，但其 também 具有多种转续宿主，如啮齿类和鸟类。猫通过食用生的转续宿主肉（通常为猎物）、经母猫至幼猫的经乳途径或从环境中摄入含感染性幼虫的猫弓蛔虫虫卵而感染。摄入转续宿主或感染母猫乳汁后，猫弓蛔虫幼虫在肠道进行黏膜迁移，六周后达到产卵期。在幼猫中，从环境摄入感染性幼虫后，幼虫经肝脏和肺部迁移至小肠，感染后八周达到产卵期。在老年猫及母猫妊娠晚期感染时，幼虫发生体细胞迁移。弓蛔虫感染可导致感染猫（尤其是幼猫）出现呼吸系统和胃肠道症状，以及脱水和贫血。雌性弓蛔虫线虫产生大量虫卵，随粪便释放至环境中。弓蛔虫属（Toxocara spp.）具有人兽共患性，人类可成为其意外宿主。在诊断人类弓蛔虫病时，通常不区分感染由犬弓蛔虫（Toxocara canis）还是猫弓蛔虫引起。因此，有研究认为猫弓蛔虫作为人兽共患威胁的作用被低估。在猫体内完成生活史的过程中，猫弓蛔虫必须逃避宿主的免疫系统。每个免疫球蛋白类别在宿主适应性免疫系统中均发挥重要作用。IgA在机体黏膜表面针对病原体发挥作用。肠道表面IgA的产生由抗原诱导，可通过小肠派尔集合淋巴结（Peyer‘s patches）的T细胞依赖性途径，或由肠道固有层浆细胞的非依赖性途径，也可在没有抗原刺激的情况下非特异性诱导。T细胞非依赖性IgA合成来源于肠道共生细菌，在维持肠道微生物稳态中发挥重要作用。在黏膜上，两个单体IgA抗体通过J链连接形成二聚体。该二聚体IgA与肠上皮细胞上的多聚免疫球蛋白受体（pIgR）结合。IgA-pIgR复合物通过肠上皮细胞的转运和胞吞作用进入肠腔。pIgR被切割，剩余受体肽段称为分泌成分（secretory component），保持与二聚体IgA结合，共同形成分泌型IgA（sIgA）。sIgA在区分病原体（包括寄生虫）与营养抗原以及共生和有益微生物方面承担重要责任，从而维持有害入侵者与关键营养物和微生物之间的重要平衡。在猫中，有研究声称血清IgA主要以二聚体形式存在，这与人类不同。在早期研究中，黏膜IgA已被证明在肠道蠕虫排出中发挥作用。猫对线虫感染的IgA应答尚未得到广泛研究。特别是粪便IgA水平此前未被广泛研究，尽管IgA是局部黏膜防御的主要抗体。一项研究发现，感染猫弓蛔虫的猫比未感染猫的过敏原特异性IgA应答更强。在患有多种寄生虫感染的犬中，已发表的研究稍多。一篇文章报道，感染犬弓蛔虫或贾第虫（Giardia sp.）的犬粪便IgA水平降低，但感染犬等孢球虫（Cystoisospora canis，一种球虫寄生虫）的犬粪便IgA水平显著升高。全身性IgA结果也不一致，既有绦虫感染期间寄生虫特异性IgA升高的报道，也有寄生虫感染犬血清总IgA降低的报道。本研究旨在检测猫弓蛔虫感染猫和无寄生虫猫血清和粪便中的总IgA应答，以识别与感染相关的总体差异。此外，研究人员希望可视化猫IgA在猫弓蛔虫成虫线虫上的结合位点，并鉴定IgA结合的猫弓蛔虫抗原。研究人员从猫弓蛔虫感染猫和非感染阴性对照猫采集粪便和血清样本。符合条件的猫粪便样本于2024年11月至2025年6月从芬兰的转诊兽医和猫收容所招募。共纳入14只猫弓蛔虫阳性猫和10只阴性猫。粪便样本由畜主或收容所管理人员采集，在检查前于4°C保存最多7天。仅弓蛔虫阳性且其他肠道寄生虫阴性的个体被纳入阳性组。阴性对照猫的粪便样本确认无肠道寄生虫。粪便采用定量Mini-FLOTAC法以硫酸锌（比重1.35；灵敏度为每克粪便10个虫卵[EPG]）检查线虫虫卵和原虫卵囊，并使用IDEXX SNAP?贾第虫检测试剂盒（IDEXX Laboratories；Westbrook，ME，USA）检测贾第虫抗原。弓蛔虫阳性猫分别接受芬苯达唑口服连续三天（9只）、吡喹酮-依莫德普赛（praziquantel-emodepside）滴剂（3只）、吡虫啉-莫西克丁（imidacloprid-moxidectin）滴剂（1只）或噻嘧啶-吡喹酮（pyrantel-praziquantel）口服（1只）驱虫。驱虫药由畜主或收容所选择，按生产商说明和猫体重给药。驱虫后14天，采集新粪便样本并用Mini-FLOTAC检查。所有合格粪便样本以一克等分试样于-20°C冷冻备用。血清样本在治疗前和治疗后14天从弓蛔虫阳性猫采集，以及从弓蛔虫阴性猫采集，通过头静脉（vena cephalica）穿刺入血清管。血清分离后，上清收集于2 mL锥形管（Eppendorf，Hamburg，Germany）中并于-20°C保存。14只猫弓蛔虫感染猫中，8只为雄性，其中3只已去势。6只雌性中2只已绝育，1只雌性的生殖状态未知。猫年龄范围为6个月至5岁（中位数1.0）；最年长猫的年龄为估计值。1只猫的年龄未知且未估计。所有弓蛔虫阳性猫均为家猫。弓蛔虫阳性猫的EPG值范围为120至13 400（中位数950）。共10只来自志愿畜主和1家当地猫收容所的猫在粪便检查确认无肠道寄生虫后纳入阴性对照。其年龄范围为8个月至15岁（中位数8.5岁）。其中6只为雌性，3只已绝育。所有4只雄性猫均已去势。6只为家猫，2只为东方猫，2只为西伯利亚猫。阴性对照猫的样本在酶联免疫吸附试验（ELISA）中用作非寄生虫对照。在免疫组织化学和Western blot中，商业正常猫血清（2BScientific Limited，Oxfordshire，UK）用作阴性对照血清。猫弓蛔虫成虫线虫从自然感染猫的粪便和呕吐物中采集，以及由芬兰食品管理局（Finnish Food Authority）的病理学家从自然感染猫的尸检中采集（材料转让协议，MTA）。线虫通过立体显微镜（SZX9，Olympus，Tokyo，Japan）依据形态学特征鉴定为猫弓蛔虫。作为参考，从自然感染犬的粪便中采集1条雄性犬弓蛔虫线虫。此外，由芬兰食品管理局的兽医病理学家从犬尸检中采集2条雌性犬弓蛔虫线虫（MTA）。采集的线虫用自来水冲洗并保存于70%乙醇中于4°C。本研究获得动物实验许可（ESAVI/45932/2021，补充：ESAVI/38949/2024）。畜主和收容所管理人员通过电子邮件书面同意血清采样和获取猫的数据。使用商业猫双夹心IgA ELISA试剂盒（Immunology Consultants Laboratory Inc，Portland，OR，USA）分析血清和粪便样本的总IgA水平。该试剂盒未经验证用于粪便，但粪便样本的方案参照Peters等人所述。研究人员首先用多个平行血清和粪便样本测试ELISA试剂盒以验证功能并确定两种样本类型的适当稀释度。准确称取一克（湿重）粪便，在10 mL锥形管（Falcon，Corning Incorporated，Corning，NY，USA）中与提取缓冲液（0.01 M磷酸盐缓冲盐水[PBS]和0.5% Tween?[Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，USA]）混合。试管充分振荡和涡旋以匀浆样本。悬液在5°C下以1500 x g离心20分钟后，取2 mL上清与5 μL蛋白酶抑制剂混合物（Epigentek Group Inc，Farmingdale，NY，USA）混合，涡旋，并以10 000g离心10分钟。收集上清用于ELISA。起始稀释度通过预实验确定。所有样本用ELISA试剂盒中的商业稀释液稀释至四个不同浓度（血清：1：20 000、1：40 000、1：80 000、1：160 000；粪便：1：2500、1：5000、1：10 000、1：20 000）。标准品浓度为0、100、200和400 ng/mL。方案在制造商说明基础上修改。简言之，稀释样本和标准品加入预定孔中，ELISA板加盖室温孵育30分钟。洗涤缓冲液洗涤后，加入辣根过氧化物酶（HRP） conjugate，板用锡箔包裹室温保持30分钟。洗涤后，显色底物溶液（四甲基联苯胺和过氧化氢的柠檬酸溶液）加入孔中。锡箔包裹室温孵育10分钟后，加入终止液（硫酸）。ELISA板立即用Byonoy 96 ELISA读板仪（Byonoy GmbH，Hamburg，Germany）在450 nm波长下分析。血清和粪便中的总IgA水平使用标准曲线确定。测量每个样本结果的中位数，排除极端异常值。测定8只弓蛔虫阳性猫治疗前和治疗后14天以及8只阴性对照的血清IgA水平。测定10只阳性猫治疗前后以及6只阴性对照的粪便IgA水平。并非每个参与猫的所有样本材料均可获得，且由于实验室误差，部分结果必须丢弃。猫弓蛔虫成虫置于室温福尔马林中24小时，然后切成3毫米段。在组织处理仪（Tissue-Tek? VIP? 5 Jr.，Sakura Finetek，Torrance，California，USA）中石蜡包埋。固化石蜡块切成2.5微米切片（Microm HM355S，Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）。切片装在玻璃载玻片上，室温干燥，37°C过夜。次日，样本在切片染色机（Autostainer XL，Leica，Wetzlar，Germany）中复水。相应编号后，虫体表位在PT模块（PT Module，Lab Vision?，Fremont，California，USA）中以pH 6柠檬酸缓冲液99°C修复20分钟。冷却后，载玻片装配覆盖板（Epredia，Portsmouth，New Hampshire，USA）用1× PBS。首先，190 μL 3%过氧化氢加入覆盖板孔中以阻断组织任何过氧化物酶活性。10分钟后，载玻片用1× PBS冲洗两次。通过加入190 μL SuperBlock?（Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）阻断非特异性抗原结合。20分钟后，将三只弓蛔虫感染猫的混合血清（EPG值分别为120、190和580，血清总IgA值分别为15.3、3.83和9.26 mg/mL）1：100稀释、商业猫正常血清1：100稀释或仅SuperBlock?加入预定覆盖板孔中，每孔190 μL，孵育60分钟。1× PBS冲洗两次后，加入190 μL 1：200稀释的HRP偶联山羊抗猫IgA重链二抗（Bio-Techne，Minneapolis，USA）。孵育30分钟并用1× PBS冲洗两次后，回收载玻片通过滴加3，3’-二氨基联苯胺（Pierce? DAB Substrate Kit；Thermo Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）染色。水平孵育6分钟后，载玻片用蒸馏水冲洗。背景组织用Harris苏木精（Sigma-Aldrich，Burlington，Massachusetts，USA）染色10秒，然后用自来水冲洗。载玻片经递增浓度乙醇和二甲苯处理；每种乙醇2分钟，每种二甲苯4分钟。载玻片用盖片工作站（HistoCore Chromax CV，Leica，Wetzlar，Germany）封片，并用Zeiss Imager.A2（Carl Zeiss Microscopy，Jena，Germany）以5倍放大检查。70%乙醇保存的弓蛔虫线虫在递减乙醇稀释系列中复水。每条虫体在立体显微镜（SZX9，Olympus，Tokyo，Japan）下用手术刀纵向剖开，内部器官和皮下组织用手术刀刮入2 mL锥形管（Eppendorf，Hamburg，Germany）中，含约500 μL裂解缓冲液（含8 M尿素、40 mM Tris碱和SDS）。3条猫弓蛔虫雄性线虫、4条雌性猫弓蛔虫线虫、2条雌性犬弓蛔虫线虫和1条雄性犬弓蛔虫线虫的器官按性别和物种分装于各自管中。样本在冰上用超声破碎仪破碎25次每次1秒，并在4°C下以10，000 x g离心15分钟以去除所有多余沉淀。上清收集于2 mL锥形管（Eppendorf，Hamburg，Germany）中，蛋白质浓度用分光光度计（DS-C Cuvette，DeNovix，Wilmington，DE，USA）分析。每种弓蛔虫蛋白20或40 μg（按计划）与Laemmli样本缓冲液（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）以三份样本对一份Laemmli样本缓冲液的体积比混合，95°C加热5分钟。样本加入8–16% Mini-PROTEAN? TGX Stain-Free?蛋白凝胶（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）预定孔中。Marker Precision Plus Protein? All Blue（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）分子量条带为250、150、100、75、50、37、25、20、15和10 kDa，与弓蛔虫蛋白一起先在60 V电压下运行10分钟，然后在Running Buffer（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）中100 V运行60分钟。凝胶一部分用Coomassie Brilliant Blue R-250染色液（Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）在37°C染色1小时用于质谱采样，然后在室温下用Coomassie脱色液（甲醇和乙酸在蒸馏水中）脱色40分钟。其余未染色凝胶用蒸馏水冲洗，然后在冰上于Towbin缓冲液（Tris/Glycine Buffer [Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA]、甲醇和蒸馏水）中孵育15分钟。蛋白质通过半干转印装置（Trans-Blot Turbo，Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）在15 V电压下20分钟从凝胶转移至聚偏二氟乙烯（PVDF；Immobilon-P，Sigma-Aldrich，Burlington，Massachusetts，USA）膜。用蒸馏水冲洗四次每次5分钟并用Tris缓冲盐水（TBS）冲洗5分钟后，膜在封闭缓冲液（SuperBlock?，Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）中室温孵育1小时。然后膜切成条带，按蓝图分别与1：50稀释的混合猫弓蛔虫感染猫血清（EPG值分别为120、190和580，血清总IgA值分别为15.30、3.83和9.26 mg/mL）、商业正常猫血清或仅SuperBlock?在4°C孵育过夜。用TBS-Tween? 20（0.05%）（Sigma-Aldrich，Burlington，Massachusetts，USA）冲洗三次每次5分钟后，条带与1：20，000稀释的二抗（山羊抗猫IgA重链二抗[HRP]，Bio-Techne Ireland Limited，Dublin，Ireland）室温孵育1小时。用TBS-Tween?冲洗六次每次5分钟后，膜用TBS冲洗5分钟，然后与Western化学发光底物（Clarity?，Bio-Rad Laboratories Inc.，Hercules，California，USA）孵育5分钟。化学发光反应用LAS-3000 Imager（Fujifilm，Tokyo，Japan）可视化并拍照。根据Western blot中的抗原反应性选择蛋白质条带进行质谱分析。雌性猫弓蛔虫的100 kDa条带被收集，因其仅对弓蛔虫感染猫血清呈阳性反应。此外，雌性和雄性猫弓蛔虫的72 kDa条带被选为潜在特异性抗原，因其仅在弓蛔虫感染猫血清中具有免疫反应性。雄性猫弓蛔虫的37 kDa条带在弓蛔虫阳性猫血清和商业正常猫血清（阴性对照）中均具有免疫反应性，因此被选为潜在非特异性抗原进行质谱分析。雄性和雄性犬弓蛔虫的22 kDa条带被选为可能的对应抗原条带进行质谱分析。犬弓蛔虫用作质谱分析的参考生物，因其蛋白质组已被表征。质谱分析在赫尔辛基大学蛋白质组学部门进行。Western blot后选择的蛋白质条带从凝胶中切出，放入单独1 mL锥形管（Eppendorf，Hamburg，Germany）中，于-20°C保存。凝胶碎片用100 μL 60%乙腈（Thermo-Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）脱色10分钟，随后用100 μL HPLC水（Thermo-Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）在37°C处理5分钟，重复直至所有Coomassie染色溶解。凝胶碎片依次用60%和100%乙腈洗涤和脱水，然后在50 mM Tris缓冲液（pH 8.0）中平衡。用二硫苏糖醇（DTT）（Thermo-Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）在60°C还原30分钟，之后凝胶碎片用100%乙腈脱水。用碘乙酰胺（Thermo-Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）在室温暗处烷基化30分钟。额外洗涤和脱水步骤后，凝胶碎片在室温干燥。通过加入酶溶液（12.5 ng/μL胰蛋白酶（Promega，Madison，Wisconsin，USA）在50 mM Tris缓冲液中；胰蛋白酶，pH 8.0）在37°C、300 rpm振荡下消化过夜。肽段通过依次与50 μL 60%乙腈孵育10分钟和50 μL 80%乙腈/0.1%三氟乙酸（TFA，Thermo-Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）孵育10分钟提取。每次提取步骤后收集上清，合并，并在C18净化前用SpeedVac浓缩器干燥。消化和干燥后，肽段重悬于100 μl缓冲液A（0.1% TFA、1%乙腈在HPLC级水中），并根据制造商说明用BioPureSPN PROTO 300 C18 Mini柱（Higgins Analytical，Mountain View，California，USA）脱盐。脱盐后，样本在离心浓缩器（Concentrator Plus，Eppendorf，Hamburg，Germany）中干燥。干燥肽段重悬于30 μl缓冲液A中，并用含0.1%甲酸（Thermo-Fisher Scientific，Waltham，Massachusetts，USA）的HPLC水进一步1：10稀释。脱盐样本加载至Evotips（Evosep，Odense，Denmark），并使用Evosep One液相色谱系统（Evosep，Odense，Denmark）通过CaptiveSpray纳喷雾离子源（Bruker，Billerica，Massachusetts，USA）与混合捕获离子迁移率四极杆TOF质谱仪（Bruker timsTOF Pro 2，Bruker，Billerica，Massachusetts，USA）联用分析。使用8 cm x 150 μm柱与1.5 μm C18珠（Evosep，Odense，Denmark）进行肽段分离，采用每日60样本方法（21分钟梯度时间）。流动相A和B分别为0.1%甲酸水溶液和0.1%甲酸乙腈溶液。样本用DDA-PASEF-short_gradient_0.5s-cycletime方法分析。研究人员使用Fragpipe分析平台（版本23.1）配合MSFragger（版本4.3）和Philosopher（版本5.1.0）进行肽段鉴定，以原始（.d）文件为输入。常见污染物和诱饵序列附加至犬弓蛔虫参考蛋白质组（UP000031036）。MSFragger分析保持默认设置，除前体质量容差设为?20至20 ppm，碎片质量容差设为20 ppm。同位素误差设为0/1/2。肽段长度设为5至50个碱基对，肽段质量设为200至5000 Da。每个肽段最大可变修饰数设为3。统计分析使用IBM? SPSS? 31.0.2.0 for Windows?进行。P值低于0.05视为统计学显著。治疗前后IgA水平的统计差异使用Wilcoxon符号秩检验。感染猫和非感染猫IgA水平的比较使用非参数Mann-Whitney U检验。EPG值与IgA水平之间的相关性使用Spearman相关检验分析。8只弓蛔虫阳性猫治疗前血清总IgA水平范围为1.34至15.3 mg/mL（中位数6.43 mg/mL）。驱虫治疗后，血清IgA水平范围为1.33至27.1 mg/mL（中位数5.28 mg/mL）。感染猫组治疗前后血清IgA水平差异无统计学显著性。治疗后4只猫血清IgA水平升高，4只降低。8只阴性对照猫血清IgA水平范围为1.25至18.8 mg/mL（中位数4.78 mg/mL）。感染猫治疗前与阴性对照猫之间血清总IgA水平无显著统计学差异。当所有非感染猫（治疗后和阴性对照）的血清IgA水平与治疗前IgA水平比较时，未发现统计学显著差异。感染猫治疗前后血清IgA水平与阴性对照猫的比较见图1。猫弓蛔虫阳性和非寄生虫猫的个体结果分别见表1和表2。测定了10只弓蛔虫阳性猫治疗前和治疗后14天以及6只阴性对照的粪便总IgA水平。粪便中IgA水平在治疗前范围为0.02至4.2 mg/g粪便（中位数0.62 mg/g），驱虫治疗后范围为0.08至6.01 mg/g（中位数0.26 mg/g）。治疗前后组间粪便IgA水平未发现统计学显著差异。治疗后5只猫粪便IgA水平升高，5只降低。阴性对照猫粪便IgA水平范围为0.10至0.29 mg/g（中位数0.21 mg/g）。弓蛔虫感染猫粪便IgA水平与非感染猫之间的差异无统计学显著性。当所有非感染猫粪便IgA水平与弓蛔虫感染猫比较时，统计学差异不显著。三组（治疗前、治疗后和阴性对照猫）的粪便IgA水平比较见图1。同时测定粪便和血清IgA水平的4只弓蛔虫阳性猫中，2只在驱虫治疗后14天粪便IgA升高同时血清IgA降低，另2只则相反。在研究材料中，EPG值与血清IgA水平呈中度负相关（Spearman相关系数r=-0.571），与粪便IgA水平无关联（r=0.103）。两项结果均无统计学显著性。猫弓蛔虫线虫的免疫组织化学显示IgA结合尤其在肠道、子宫、虫卵、精子、肌肉细胞体层、皮下和排泄管中（图2和图3）。与弓蛔虫阳性血清相比，正常猫血清（阴性对照）孵育的线虫切片免疫反应性较弱；然而，非特异性染色明显。仅用SuperBlock?孵育的切片显示无IgA免疫反应性。猫弓蛔虫雄性和雌性线虫以及犬弓蛔虫雄性线虫的SDS-PAGE凝胶见图4。猫弓蛔虫最显著的蛋白质在雄性中为100、90、48、40、38、17和13 kDa，在雌性猫弓蛔虫中为100、80、51、38、36、35、17和12 kDa。此处使用犬弓蛔虫雄性抗原比较两个物种。在Western blot（图5）中，研究人员识别出猫弓蛔虫IgA免疫反应性抗原在雄性中为250、150、105、72、70、60、44、37、25、22、18和16 kDa，在雌性中为250、100、72、70、60、44、37、25、22、18和16 kDa。在这些抗原中，两种性别中44、37、25、22、18和16 kDa的抗原在正常猫血清（阴性对照）中也具有IgA免疫反应性。从检查的5条抗原条带中共检测到426种猫弓蛔虫蛋白质（蛋白质概率≥0.9）。检测到的蛋白质中28种为未表征蛋白质。每条Western blot条带分析中最丰富的五种蛋白质见图5。研究人员比较了猫弓蛔虫感染猫和非寄生虫猫血清和粪便中的IgA水平，以评估感染是否对总IgA量产生大规模影响。在血清样本中，感染前和治疗后总IgA值未见趋势。猫弓蛔虫感染猫的粪便总IgA水平在驱虫治疗前高于治疗后及非寄生虫猫；然而，组间差异无统计学显著性。已知有多种因素影响个体猫IgA水平，如年龄、膳食纤维含量、亚临床病毒性或免疫介导性疾病。老年猫血清IgA水平往往高于年轻成年猫，但粪便IgA的类似研究缺乏。在本研究材料中，血清或粪便中均未观察到这种差异。然而，本研究中样本量太小，无法观察年龄与IgA水平之间的任何关联。其他寄生虫感染也可能影响IgA水平，尽管研究人员通过浮聚法和贾第虫抗原检测排除了最重要的肠道寄生虫。例如，在刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）感染中，已显示猫在卵囊排出期后血清IgA水平升高。视黄酸（维生素A）是将B细胞转换为IgA产生浆细胞的重要诱导剂。因此，必须考虑到由于例如流浪猫饥饿导致的膳食视黄酸缺乏可能减少黏膜上B细胞分泌的IgA水平。在本研究中，6只猫最近被当地动物收容所捕获，到达前可能缺乏均衡饮食。应激也已被证明影响不同物种的IgA应答，结果存在一定争议。急性应激往往导致IgA水平升高，但当应激持续时IgA水平降低。IgA的产生也受肠道细菌刺激，这可以解释猫之间的个体差异，特别是考虑到猫肠道微生物群已检测到年龄依赖性变化。在 earlier 犬类研究中，驱虫治疗也已被证明对肠道微生物群有一定影响。据研究人员所知，尚未发表猫的类似研究，但一项关于东北虎的研究得出了类似结论。在一项涵盖25篇关于反刍动物、啮齿动物和猪的研究文章的系统综述中，针对肠道蠕虫的IgA应答被认为是在减弱而非限制。在该综述中，对肠道蠕虫更具抵抗力的动物血清和粪便IgA均较高。在人类弓蛔虫感染中，血清IgA在随访治疗反应方面特别有价值，但在初始诊断中价值不大。然而，人类弓蛔虫感染的意外性与终末宿主完全不同。对于猫，血清和粪便总IgA似乎均无价值；个体猫血清和粪便中IgA水平的变化不一致。本研究涉及的猫已处于感染的产卵期，意味着采样前猫已感染数周。基于这些结果，研究人员无法判断感染阶段是否会导致结果差异。对于粪便总IgA，研究人员使用了商业ELISA试剂盒，该试剂盒此前已用于分析猫粪便IgA，尽管其设计用于血清和血浆样本。对于血清和血浆，有几种ELISA试剂盒可供选择，但粪便样本材料更复杂，且没有专门设计用于猫粪便IgA的商业试剂盒。因此，本研究中粪便IgA绝对浓度无法验证，但样本间的关系可以比较。由于研究人员希望使用自然感染猫作为材料而非进行实验性感染，无法标准化年龄或其他背景因素，样本量也较小。研究人员可以提供猫总IgA与猫弓蛔虫感染之间关系的初步概述，但该主题需要未来更广泛的实验。在本研究中，研究人员使用血清作为免疫组织化学和免疫印迹的IgA来源，因为已证明血清也能很好地反映犬的黏膜IgA，犬的血清IgA主要呈二聚体形式，与猫相同。此外，无病原体猫的血清可商业获得，而粪便则不能。免疫组织化学提示猫弓蛔虫的IgA免疫反应性抗原存在于肠道、肌肉、皮下、精子、子宫、虫卵和排泄管中，但染色为非特异性的。该发现得到蛋白质组学分析的支持：猫弓蛔虫中存在IgA免疫反应性蛋白质，这些蛋白质并非该寄生虫特有，也存在于其他生物体中。研究人员使用SDS-PAGE确定猫弓蛔虫的蛋白质谱。在Soleyman等人的研究中，猫弓蛔虫蛋白质条带经二维电泳显示最显著的条带约为35、70和140 kDa，与本研究结果部分吻合。在Western blot中，研究人员能够识别一些特异性IgA免疫反应性猫弓蛔虫抗原（图5），但非特异性IgA免疫反应明显，这与非特异性免疫组织化学发现一致。虫体角质层被排除在蛋白质组学之外，因为其对抗体-抗原相互作用相对惰性，研究人员在免疫组织化学中也证明了这一点（图2和图3）。本研究中鉴定的某些蛋白质此前已在其他寄生虫中研究过。果糖二磷酸醛缩酶和半乳糖凝集素此前已被描述为绵羊线虫Teladorsagia circumcincta中的IgA反应性蛋白。此外，血吸虫（Schistosoma haematobium）的烯醇化酶、肌动蛋白和果糖二磷酸醛缩酶此前已被鉴定为人类IgA反应性蛋白。副肌球蛋白，一种来源于肌肉组织的蛋白质，此前已在绵羊T. circumcincta中被识别为IgA反应性蛋白，并被建议作为蠕虫疫苗的可能靶标。内质网蛋白，一种也称为gp96的热休克蛋白，也已在血吸虫属（Schistosoma spp.）蛋白质组中鉴定，是一种炎症介质，通过刺激巨噬细胞和树突状细胞参与激活T细胞，并参与吞噬作用。丙酰辅酶A羧化酶参与蠕虫的能量代谢。关于其他抗体，在本研究检测的蛋白质中，血吸虫和另一种吸虫肝片形吸虫（Fasciola hepatica）的肌动蛋白此前已被鉴定为人类IgG免疫反应性蛋白，并被建议作为吸虫药物或吸虫疫苗工具的潜在靶标。马来丝虫（Brugia malayi）的烯醇化酶已显示与人类IgM反应。此外，多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis）的副肌球蛋白和热休克蛋白此前已被发现与小鼠IgG反应。有趣的是，旋毛虫（Trichinella spiralis）的副肌球蛋白也已被发现可抑制人类补体激活，曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）和猪带绦虫（Taenia solium）的副肌球蛋白对抗补体激活的类似发现也已在豚鼠中观察到。研究人员的发现表明，IgA相关防御针对许多生物体中的相同抗原，而非特异性针对每种病原体。这对宿主必定有益。然而，研究人员在此仅鉴定了部分抗原，为更好地理解IgA在寄生虫感染中的作用，应进一步研究这些蛋白质以及猫弓蛔虫的其他抗原。研究人员得出结论，猫IgA主要与猫弓蛔虫中其他生物体也常见的抗原结合。这种非特异性结合可能有助于IgA更快地防御弓蛔虫以及肠道中的其他入侵者。本研究中未发现血清或粪便总IgA与弓蛔虫感染状态之间存在统计学显著关联，可能出于相同原因：IgA反应性抗原在许多生物体中普遍存在。然而，猫弓蛔虫成虫中有些抗原在本研究中尚未鉴定，其意义仍未明确。小样本量限制了本研究检测总IgA水平与猫弓蛔虫感染之间可能相关性的效能。
