《Blood Research》：Linking sORFs and microproteins in hematological malignancies: current update on origin, function and clinical implications
综合翻译组学与蛋白质组学技术的进步已成功鉴定出历史上被视为非编码区域的隐藏微蛋白组（microproteome）层面。对微蛋白在血液系统恶性肿瘤中参与机制的研究可能有助于填补尽管已进行广泛基因组和转录组分析但仍持续存在的关键空白。许多血液系统恶性肿瘤表现出广泛的克隆异质性、动态演化及有限的可靶向突变。因此，以突变为中心的研究策略不足以全面阐明疾病行为并识别新型治疗方法。理解微蛋白的作用可能有助于阐明异常非编码RNA（ncRNA）表达与恶性细胞中所观察表型之间的关系，其途径在于发现直接参与信号传导、代谢重编程及表观遗传调控的关键贡献因子。这些微小分子可能揭示一个尚未探索的疾病调控因子储备库及潜在的免疫治疗抗原靶点。抗原性微蛋白起源于非常规编码区域（如ncRNA转录本），可引发T细胞应答，代表一类此前未被识别的具有治疗相关性的免疫原性分子。本综述强调需要探索微蛋白在血液系统恶性肿瘤病理生物学中的作用，并提供一个支持未来评估微蛋白作为抗原靶点免疫原性潜力的研究框架。
急性白血病是儿童中最常见的恶性肿瘤形式。约80%的急性白血病病例为淋系来源，即急性淋巴细胞白血病（ALL），而15%–20%被诊断为急性髓系白血病（AML）。白血病中观察到的显著遗传异质性和表观遗传变异强烈提示，以突变为中心的传统"一刀切"治疗策略无法捕捉白血病克隆的动态适应特性。为应对这些挑战，研究基因组中的基因调控元件，如非编码RNA（ncRNA），可能为白血病改进治疗策略的开发提供有前景的途径。ncRNA是转录但不通常翻译为蛋白质的功能性RNA，参与基因表达调控。聚焦ncRNA的关键优势在于ncRNA介导的调控网络运作于许多遗传改变的上游，并在演化中的亚克隆间保持相对保守。此外，ncRNA可直接调控表观遗传调控因子、编码转录本及染色质结构的活性或表达。
近年来，高通量测序和蛋白质组技术的进步揭示ncRNA可能含有短开放阅读框（sORFs），其编码少于100个氨基酸的小肽，称为微蛋白。这些在小肽由于低丰度和小尺寸历史上被忽视；然而，近期研究表明这些蛋白质的失调促进癌变，包括白血病。它们通过与转录因子、大蛋白复合物、信号通路或染色质相关机器相互作用来执行直接生物学功能。微蛋白功能具有高度细胞状态特异性，为理解非编码基因组的功能输出提供了直接途径。它们作为高度特异性和敏感的的生物标志物以及跨多种癌症（包括白血病）的治疗靶点具有相当大的潜力。本综述旨在探讨微蛋白的生物学起源、鉴定方法、治疗靶点及研究现状，特别聚焦于血液系统恶性肿瘤。
微蛋白：背景
微蛋白通常定义为7至20 kDa的肽段。早期测序技术在解码方面面临挑战；因此，这些较短的开放阅读框（ORFs）在基因组研究中被忽视，通常被认为是基因组中随机出现的非功能性ORFs。核糖体足迹技术和质谱（MS）工作流程的改进使得能够鉴定这些少于100–150个氨基酸的翻译sORFs。文献中使用了多种术语描述微蛋白，包括小蛋白、微肽、sORF编码蛋白（SEPs），以及更具比喻性的"幽灵蛋白"。这些微肽可能来源于长非编码RNA（lncRNA）、微小RNA（miRNA）、环状RNA（circRNA）以及蛋白编码基因的非翻译区（UTRs），特别是上游5′ UTR和下游3′ UTR。微蛋白的另一个重要起源是蛋白编码基因内未注释sORFs使用经典区域的替代阅读框；此外，微蛋白可能来源于此前不编码蛋白质的基因间区域。
许多微蛋白已在细胞和分子水平被赋予多种功能，包括RNA加工、蛋白质加工、细胞运输、线粒体过程、细胞信号传导、修复机制、应激反应和免疫调控。研究表明这些微小肽段也可能充当开关，放大或沉默参与疾病生理学的基因通路；因此，需要考虑微蛋白是否在癌症生物学中被忽视作为关键参与者。微蛋白可作为翻译后调控因子，通过形成蛋白质复合物（如同源二聚体、异源二聚体或多聚体）调节各种生物学过程。它们也可通过共享的蛋白质–蛋白质相互作用结构域调节较大蛋白质。重要的是，这些微肽含有跨膜结构域，倾向于具有高疏水性和高碱性氨基酸含量。这有利于它们定位至带负电荷的膜并调节离子泵和代谢复合物，促进改变信号传导、剪接或细胞器功能的蛋白质相互作用支架形成。
微蛋白的起源和生物学来源
LncRNA编码的微蛋白
LncRNAs定义为长度超过200个核苷酸的非编码转录本，通过常与DNA、RNA和蛋白质相互作用在细胞增殖和存活中发挥作用。证据表明一些lncRNAs含有嵌入其转录本中的smORFs，可能编码肽段并显示与演化年轻蛋白质序列相似的序列约束，提示在从头蛋白质演化中的重要作用。在已知人类lncRNAs中，9,387个lncRNAs被假定具有编码小蛋白的潜力。此外，考虑蛋白质不稳定性、二级结构和跨膜螺旋，共2,246个小蛋白已被高置信度鉴定。值得注意的是，lncRNA衍生的微蛋白，如APPLE和SMIM26，在血液系统恶性肿瘤中越来越多地被鉴定。这些微肽已被牵涉于调控白血病发生、免疫逃逸和血液系统癌症的肿瘤微环境。
MiRNA编码的微蛋白
miRNAs是20–24个核苷酸的小ncRNAs，主要通过结合3′ UTRs负调控靶mRNAs的翻译效率和稳定性。与lncRNA编码肽不同，迄今鉴定的miRNA编码肽（miPEPs）很少，原因在于其低丰度、有限的稳定性以及需要高灵敏度检测方案。迄今为止，miPEPs仅在植物研究中被鉴定；然而，其在细胞环境中的功能表征提示它们通过刺激相关miRNA的转录参与miRNA靶基因的沉默。尽管如此，miPEP特异性的活性和分子基础仍不清楚，关于其翻译机器调控仍存在若干问题。MiPEP133是动物中发现的第一个miRNA编码微蛋白。该微蛋白由miR34a编码，在鼻咽癌中作为肿瘤抑制性微蛋白发挥作用。进一步研究癌症中miPEPs已鉴定出由初级miRNAs（pri-miRNAs；miR-200a和miR-200b）编码的微肽（miPEP-200a和miPEP-200b），其抑制前列腺癌细胞转移并调控这些细胞的上皮–间质转化。迄今为止，尚无miRNA编码微肽在血液系统疾病中被实验验证，尽管若干已鉴定miPEPs的母转录本（如编码miPEP133的pri-miR-34a）已被牵涉于白血病、多发性骨髓瘤和非霍奇金淋巴瘤。这突显了在血液系统恶性肿瘤中发现新型微蛋白并鉴定此前未识别的基因调控层面的潜力。
CircRNA编码的微蛋白
随着近期测序技术的进步，数千个环状RNA已被揭示含有蛋白编码区域。CircRNAs由前体mRNA（pre-mRNA）的反向剪接产生，其中下游5′剪接位点与上游3′剪接位点共价连接。这些circRNAs含有内部核糖体进入位点（IRESs）和m
6A修饰，促进5′ UTR中的帽非依赖性翻译。编码微蛋白的circRNAs实例包括circSHPRH、circMbl、circZNF609、circFBXW7和circPINT。一项泛癌研究鉴定了4,362个具有独特一级结构和编码肽潜力的circRNAs以及1,179个编码具有新结构域组成蛋白的circRNAs，其中183个在不同癌症中差异表达。一项结肠癌研究鉴定了circRNA circPPP1R12A，其促进肿瘤发病和转移，其编码的新蛋白长73个氨基酸。circFBXW7编码FBXW7-185aa，其拮抗USP28诱导的c-Myc稳定化，缩短c-Myc半衰期并调控关键致癌通路。另一个蛋白circCCDC7-180aa由circCCDC7编码，上调FLRT3（参与细胞黏附的关键蛋白），从而抑制癌症进展。此外，circNFIB编码一个56个氨基酸的蛋白，通过减少花生四烯酸合成和阻断氨基酸通路抑制乳腺肿瘤生长和转移。一个名为circRNADb的circRNA数据库已建立，包含来自不同来源的32,914个人类外显子circRNAs。其中，16,328个circRNAs被注释为具有长于100个氨基酸残基的ORFs，7,170个含有IRES元件。对于来自37个基因的46个circRNAs，表达蛋白已通过MS确认。另一算法CICADA将circRNA序列与MS蛋白质组验证相结合，提高可翻译circRNA预测的灵敏度并解决蛋白质池中非特异性鉴定问题。鉴定circRNAs编码的微蛋白至关重要，因为这些分子正成为生物学过程和疾病发展的关键参与者，挑战circRNAs作为ncRNAs的传统观点。其独特性质使其成为诊断和治疗的有价值潜在靶点。在血液系统恶性肿瘤中，circRNAs牵涉于白血病发生、药物应答和预后。BCR–ABL阳性白血病中的circPCMTD1被证明在CML模型中编码约30 kDa的肽段。然而，circRNA编码肽尚未充分建立，使circRNA衍生肽成为值得研究的新生物学层面。
鉴定微蛋白的方法
LncRNA和miRNA衍生微蛋白的发现和验证依赖于整合RNA测序（RNA-seq）、核糖体图谱（Ribo-seq）和MS的综合方法。Ribo-seq检测sORFs处的核糖体结合，RNA-seq提供转录本表达细节，MS提供肽段水平证据。为赋予所鉴定微蛋白有效功能，随后需要遗传学（CRISPR敲除/敲入）和生化（表位标签和相互作用组学）实验。数据库搜索策略的进步和MS灵敏度的提高显著增加了鉴定真正ncRNA编码肽的信心；此外，公共资源（如sORF数据库）现在汇总了跨许多组织和物种的证据。
计算机模拟方法
鉴定微蛋白常用的方法是使用生物信息学工具预测可翻译性。这些工具利用数据库中的基因组和转录组数据，通过鉴定起始密码子、IRES元件或3-nt周期性分析ORFs。许多工具如PhyloCSF、OrfPredictor、CPAT等使用序列比对方法鉴定ORFs。PhyloCSF使用基于系统发育模型的方法，通过比较非编码区与编码区的比对来分析较短序列。一项近期利用PhyloCSF的研究鉴定了144个新编码序列；其中50个新发现序列被鉴定编码微蛋白。OrfPredictor通过利用BLASTX指导EST衍生序列中编码区的鉴定，而CPAT是一种更先进的基于机器学习的工具，采用逻辑回归框架，使用多种序列特征如ORF长度、Fickett评分、ORF覆盖度和六聚体使用偏倚。MiPepid是另一种专门设计用于评估测试集编码潜力的工具，具有非常高的总体准确性。Ribo-seq之后，对所得reads进行处理以鉴定每个样本中核糖体结合的基因组位置。通过鉴定这些核糖体位置，生物信息学工具有助于利用特征性三核苷酸周期性推断哪些ORFs被翻译，表明明显的翻译并确保核糖体占据非随机。从Ribo-seq数据检测sORFs的常用工具包括RiboWave、ORF-Rater、riboHMM、DeepRibo、RiboTaper/ORF-quant和RiboCode。PRICE、RiboTish和TIS-Hunter等工具有助于翻译起始位点检测。
除计算工具外，公共资源如sORFs.org已被开发，其整合了来自六个物种78个数据集通过Ribo-seq鉴定的300万个sORFs。该数据库包含位于lncRNAs和非翻译区内的sORFs以及替代ORFs，使其成为探索候选非经典微蛋白的有用资源。它将鉴定与多种指标整合，如sORF位置、长度、系统发育存在、ORF评分以及后续更新中的基于MS的证据，为翻译提供额外支持。除这些生物信息学方法外，RNA-seq、MS和实验验证等技术提供必要证据以确认非经典sORFs的表达和翻译，确保预测的微蛋白代表真正的编码产物。
RNA测序
RNA测序是一种强大的下一代测序（NGS）工具，用于以高灵敏度分析细胞或组织的全转录组，允许发现新转录本。特别是，总RNA-seq允许对所有RNA种类进行测序，而非仅捕获mRNA，它能有效鉴定lncRNA、circRNA、snRNA、snoRNA、tRNA和小RNA（在一定程度上）。在文库制备过程中，仅去除核糖体RNA并保留所有其他种类；然而，这比传统RNA-seq需要更多测序reads。建议每个样本对总RNA文库测序至少1亿条100-bp双端reads；较低read深度（如每样本4000万reads）可能仍检测到LncRNA但会遗漏circRNA检测。为鉴定lncRNA，最终RNA-seq数据与已知注释数据库整合，使用RefSeq、UCSC和GENCODE蛋白编码转录本数据库比对reads。对于缺乏任何先前信息的转录本，使用Pfam和PhyloCSF评估鉴定任何演化保守ORFs或搜索与31,912个蛋白质结构域的相似性，从而仅捕获新基因并排除已知转录本。CircRNAs基于反向剪接事件鉴定，当锚定对相对于参考基因组以反向方向比对时推断，且规范GU/AG剪接信号侧翼于剪接位点，标志RNA的环化。用于miRNA表达谱的小RNA测序通过从总RNA提取物中分离小RNA，使用大小选择或基于蛋白质结合的策略，因为直接小RNA富集可能导致显著损失。文库构建始于接头连接的小RNA逆转录（RT）生成互补DNA，随后扩增和测序。由于miRNA分子长度较短，连接或聚腺苷酸化成为引入PCR扩增引物结合位点的必要步骤。值得注意的是，延伸步骤中的接头连接被认为是小RNA-seq工作流程中技术偏倚的主要来源。测序后，比对或映射的reads使用已建立数据库如miRbase、GENCODE和Rfam进行解释。长读长测序技术更为先进，能够对RNA种类进行全长、端到端测序，为深入转录组分析提供强大平台。在这些系统中，单个全长分子由固定在纳米结构反应孔中的单个DNA聚合酶处理。为提高测序准确性，DNA通过连接发夹接头进行环化，并通过聚合酶多次连续passes测序。所得reads经计算折叠产生高精度共识序列。延长的长读长特别适用于确定全长转录本序列，也有助于解析复杂结构，这是短读长RNA-seq分析ncRNA种类的主要挑战。长读长Seq的其他主要挑战包括每次读取成本较高；从临床样本获得高质量完整RNA样品的困难；以及所需的大量生物信息资源。更专业的技术如Ribo-seq（捕获活跃翻译的"快照"以推断编码区）和基于MS的蛋白质组学（直接检测蛋白质产物）通常与RNA-seq结合在蛋白质基因组学方法中，以准确鉴定和验证微蛋白。
核糖体测序
目前发现的sORFs相对新颖，其编码潜力无法通过计算预测，原因在于其历史上被基因注释研究遗漏、缺乏实验验证以及现有数据库信息有限。实验方法如核糖体测序在为微蛋白翻译提供证据方面具有相当大的前景。Ribo-seq是一种基于NGS的工具，开发用于测量核糖体保护的含ORF片段或翻译核糖体的活性。翻译过程中，核糖体可结合至少31个核苷酸形成核糖体足迹。该技术涉及通过停止翻译过程分离这些足迹，使用harringtonine或lactimidomycin抗生素处理，随后使用蛋白质合成抑制剂如puromycin或cycloheximide。然后通过记录翻译停止的精确位置鉴定足迹，在AUG和非AUG起始密码子之间无偏倚。该技术不仅可分离翻译核糖体并鉴定翻译位点，还可揭示其他翻译特性如肽合成速率、3-核苷酸周期性信息、移码事件和重叠ORFs。解释结果的主要挑战在于缺乏已知ORFs的共识参考集，如UniProt、RefSeq和Ensembl。正在开发多种方法检测smORFs，包括基于3-核苷酸周期性的计算工具如ORFScore和PRICE。未来旨在建立smORFs高置信度参考注释的努力将通过改进工具和标准化分析流程得到加强。ShortStop是另一个计算框架，其前提是尽管许多smORFs可被翻译，但仅一个子集产生功能性蛋白质；然而，那些确实产生的可能与实验表征的微蛋白相似。RibORF 0.1是一个软件包，基于Ribo-seq覆盖度为ORFs提供翻译评分。成功的图谱实验产生约155 bp长度的文库，测序后获得的核糖体保护片段read长度对于高质量数据应分布在28–29 nt峰值附近。Ribo-seq的一个主要限制是它不提供蛋白质稳定性信息；因此，这些数据需要与MS等蛋白质组技术整合以获得高置信度结果。
质谱
基于MS的蛋白质组学检测微蛋白的特定肽段片段，为鉴定sORF编码微蛋白提供直接有力的证据。鉴定sORF编码微蛋白的主要工作流程通常包括富含微蛋白的样品制备、MS原始数据采集和后续数据分析。基于MS鉴定的主要挑战是微蛋白的低丰度，使其难以在大蛋白质样本中分离和检测。正在开发多种方法在生物复杂样本中富集微蛋白，基于微蛋白的各种特性如大小、电荷和疏水性。然而，在患者血浆或血清样本中鉴定微蛋白具有挑战性，因为样品复杂性含有高丰度蛋白质如白蛋白和免疫球蛋白，其抑制以极低丰度存在的许多稀有微肽的信号。细胞系为疾病特异性研究提供更好的替代方案，因为它们提供受控的均质系统，其中可利用大样本输入量和重复培养来实现更深的蛋白质组覆盖并鉴定微蛋白。富集方法包括使用分子量截留过滤器（10或30 kDa）；基于凝胶的低分子量蛋白质分离；用有机溶剂如乙腈、甲醇和乙酸沉淀微蛋白；以及使用C8固相萃取柱的亲和分离。组合两种或更多这些方法比单独使用任何单一方法产生更大的微蛋白富集。许多研究报道自上而下蛋白质组学是鉴定微蛋白和减少假阳性的有效方法；然而，无需预分级的从大复合物中分离蛋白质仍然具有挑战性。在MS中，酶消化通常使用胰蛋白酶在赖氨酸（K）和精氨酸（R）残基的羧基侧切割肽链。然而，微蛋白往往含有少量精氨酸和赖氨酸残基，因此MS中序列覆盖度常受影响。更好的方法是使用多酶消化策略，将胰蛋白酶与各种蛋白酶如Asp-N、Lys-C或Glu-C组合，以获得更好的样品覆盖度和消化。鉴定新的样本特异性微蛋白需要将肽组学与RNA-seq相结合。整合RefSeq和RNA-seq结果构建用于MS分析的自定义数据库的综合方法是鉴定广泛微蛋白的理想选择。数据非依赖性采集在MS中的应用允许全光谱覆盖并全面鉴定低丰度肽段（如微蛋白），这些在传统数据依赖性采集常被遗漏。使用Ribo-Seq和MS两种策略联合检测sORFs为微蛋白存在提供有力证据，从而为其下游表征奠定坚实基础。
在实际研究工作流程中，整合多组学工作流程目前被认为是鉴定和验证非经典sORFs编码微蛋白的最可靠策略。通常，首先采用转录组学方法如RNA-seq进行转录本发现。然后使用计算机工具对最有说服力的smORFs进行排序，随后检查Ribo-seq以获取活跃翻译和与核糖体关联的证据。候选翻译ORFs随后使用基于MS的蛋白质组学在肽段水平验证，以证明肽段存在和稳定性。此外，转录组和Ribo-seq数据整合生成自定义蛋白质搜索数据库用于基于MS的肽段检测。随后，使用定位研究和CRISPR介导的方法进行功能验证对于建立所鉴定微蛋白的生物学相关性至关重要。因此，这些技术的联合应用是全面发现和验证微蛋白的最可靠且广泛采用的策略。
微蛋白在多种癌症类型中的作用报道
在癌症生物学中，微蛋白的发现挑战了基因调控的传统概念。尽管仅鉴定了小部分微蛋白，但这些已与癌症中许多基本生物学过程相关联，如RNA加工、代谢调控、信号通路和DNA修复。表1总结了跨各种癌症类型已鉴定的微蛋白。第一个报道的癌症相关微蛋白是癌症相关小整合膜开放阅读框1（CASIMO 1），其与乳腺癌细胞增殖增加相关。在肝细胞癌中，CASIMO 1与癌基因角鲨烯环氧酶相互作用，促进MAPK激活和ERK磷酸化。
微蛋白作为肿瘤抑制因子
许多微蛋白作为肿瘤抑制因子发挥作用。例如，C7orf49 smORF编码多肽MRI-2通过与Ku家族蛋白相互作用刺激非同源末端连接DNA修复。另一个lncRNA衍生微肽PINT-87aa已被证明在A172、U251、Hs683和SW1783细胞以及颅内胶质瘤异种移植中显著抑制胶质母细胞瘤增殖。PINT-87aa与转录延伸必需的复合物结合并阻止RNA聚合酶II在癌基因如SOX2、c-MYC和Cyclin D1启动子处的活性，损害转录机器。微蛋白CYREN已被鉴定为DNA双链断裂修复的调控因子，贡献肿瘤抑制功能。值得注意的是，CYREN微蛋白与核心剪接因子包括SF3B1相互作用，该基因在慢性淋巴细胞白血病和骨髓增生异常综合征中频繁突变。这种相互作用突显了微蛋白在这些恶性肿瘤中的新作用，值得进一步机制研究。在男性食管鳞状细胞癌病例中，肿瘤抑制性微蛋白YY1BM已被发现通过雄激素信号通路在营养缺乏条件下诱导癌细胞凋亡。此外，微蛋白miPEP133在卵巢癌和宫颈癌细胞中过表达通过线粒体膜电位丧失诱导凋亡并抑制鼻咽癌异种移植模型中的肿瘤生长。
微蛋白在转移和侵袭中
从局限性肿瘤进展为富含侵袭性和转移性癌通常由细胞形态、细胞–细胞相互作用及其与细胞外基质附着的变化驱动。在靶向癌症侵袭和转移的背景下，微蛋白已获得相当关注并预期在这些过程中发挥关键调控作用。例如，circRNA circPPP1R12A编码的新型73-aa微蛋白已被证明通过介导Hippo-YAP通路促进结肠癌转移和发病。微蛋白miPEP200a和miPEP200b分别由miR-200a和miR-200b pri-miRNAs编码，通过降低波形蛋白表达和调控上皮–间质转化减少前列腺癌细胞迁移。由LINC00493 lncRNA编码的线粒体定位微蛋白SMIM26的过表达在透明细胞肾细胞癌中发挥显著抑制转移的作用。进一步研究发现ZFAS1 lncRNA编码微肽通过增加细胞内活性氧水平促进肝细胞癌细胞迁移。
微蛋白参与癌症代谢
癌细胞的一个重要特征是其改变细胞代谢以满足增加的能量需求的能力。微蛋白也已成为代谢通路的潜在调控因子，具有多种临床应用。例如，lncRNA HOXB-AS3编码一个53个氨基酸的微肽，重编程RNA剪接并改变结直肠癌中的糖酵解。HOXB-AS3微肽与剪接因子hnRNP A1结合，抑制hnRNP A1介导的PKM前体mRNA可变剪接。这促进PKM1亚型而非胚胎/癌症相关PKM2亚型的表达，导致糖酵解代谢减弱和癌症进展抑制。Mitoregulin是由LINC00116 lncRNA编码的微蛋白，已被报道与线粒体内膜蛋白相互作用并稳定电子传递链复合物，导致呼吸效率增加；然而，其在癌症中的作用尚未确立。AltMRV11微蛋白由MRV基因的替代ORF编码，与BRCA1（同源重组机器的关键效应因子）相互作用。在白血病细胞系中，SMIM26已知通过mt-ND5翻译维持复合物I组装/功能支持氧化代谢和线粒体呼吸。这些发现突显了微蛋白作为血液系统恶性肿瘤代谢重编程重要调控因子的新兴作用。微蛋白研究使我们更接近更好地理解癌细胞生物学并开发更有效、毒性更低的下一代癌症治疗药物，最终改善生存结局。然而，来自白血病细胞和细胞系研究的有限证据突显了需要进一步研究以阐明微蛋白在白血病中的代谢功能。表1描述了跨各种癌症类型已鉴定和功能验证的微蛋白列表。
微蛋白在白血病中
在白血病背景下，微蛋白仍是一个未被充分探索的功能分子类别。虽然遗传和表观遗传景观早已被表征，但白血病细胞 arising from非经典阅读框的翻译输出仍然隐藏。在阐明微蛋白在白血病中的多种功能方面已取得实质性进展。然而，大多数证据来自细胞系系统和异种移植模型，而验证其表达和治疗相关性的基于患者队列的研究仍然稀缺。
微肽也已被牵涉于多发性骨髓瘤的疾病进展和耐药。源自KLF4转录因子的微肽altKLF4已被鉴定为骨髓瘤中铁死亡和化疗敏感性的关键调控因子。该微肽定位于线粒体，通过在多发性骨髓瘤细胞中与GPX4相互作用并抑制RSL3来抑制铁死亡并调节对硼替佐米和伊沙佐米的敏感性。另一个lncRNA H19编码微肽altH19通过增强CDK2在苏氨酸160处的磷酸化并激活下游有丝分裂相关蛋白促进骨髓瘤细胞增殖并诱导多极有丝分裂。关于实验验证的淋巴瘤特异性微肽的证据仍然有限。MIR155HG是在B细胞淋巴瘤中高表达的lncRNA，被发现编码微肽P155，在人B细胞淋巴瘤细胞系OCI-LY-1和炎症人树突状细胞中表达。该微肽与热休克同源蛋白70（HSC70）的ATP结合结构域相互作用并破坏MHCII介导的抗原呈递和抑制自身免疫炎症反应所需的HSC70–HSP90伴侣机器。
迄今为止，仅有限数量的微蛋白在白血病中被实验验证（图3），以下实例突显其临床相关性和在疾病进展中的功能作用。
APPLE
APPLE是第一个被确立参与白血病疾病机制的微蛋白。它是一个90个氨基酸的肽段，被鉴定在AML患者中异常表达。Ribo-seq和MS数据的整合表明APPLE由lncRNA ASH1L-AS1的273核苷酸ORF 6编码，具有经典起始和终止密码子。lncRNA ASH1L-AS1的高表达与AML患者较差生存相关，并作为关键风险因素。ASH1L-AS1的敲低已被证明在体外和体内减少白血病生长，同时APPLE微蛋白的翻译输出减少。沉默APPLE导致抗白血病效应，包括抑制细胞增殖和促进凋亡，突显APPLE作为癌症治疗靶点的潜力。APPLE微蛋白被发现富集于核糖体结合的内质网并促进mRNA翻译，因为其敲低减少了AML细胞系中的全局蛋白质合成，而其过表达挽救了该表型。Pull-down实验揭示APPLE通过结合PABPC1的RRM1和RRM3结构域及eIF4G的N端结构域促进多聚(A)结合蛋白胞质1（PABPC1）与eIF4G（真核起始因子4G）之间的相互作用，从而促进mRNA环化和eIF4F起始复合物的组装以支持特定的促癌翻译程序。这是唯一在患者水平验证微蛋白表达并突显其与患者生存相关的临床相关性的研究。
CircPCMTD1编码肽
选择性circRNA研究报道了有限数量的在白血病中具有编码潜力的circRNAs。例如，BCR–ABL阳性白血病中的circPCMTD1被证明富集于细胞质，在那里与核糖体关联，并含有能够编码约30 kDa肽段的隐秘ORF，该肽段主要定位于细胞核。该circRNA由PCMTD1基因座的反向剪接产生，该基因座在BCR::ABL驱动的白血病细胞中至关重要，特别是在CML急变期模型中。敲低circPCMTD1而不影响线性PCMTD1表达揭示在K562和LAMA-84细胞系中增殖减少和G2/M细胞周期阻滞。该肽段与BTR复合物的核心成员——BLM解旋酶、TOP3A和RMI1——相互作用，有助于在复制和重组过程中解析复杂DNA结构，促进尽管存在DNA损伤的细胞增殖。它增加γH2AX并触发多个DDR轴的激活，包括CHK1、RPA32、ATR、ATM和DNA-PK，增加DNA断裂并降低DNA复制能力。在移植BCR::ABL阳性原始细胞的小鼠中，靶向circPCMTD1显著延长生存，未观察到明显毒性。
SMIM26
全基因组SEP CRISPR筛选鉴定LINC00493编码一个95个氨基酸的线粒体微蛋白SMIM26。在K562细胞系中的研究表明它作为连接丝氨酸代谢和复合物I组装的代谢传感器。SMIM26定位于线粒体内膜，N端和C端面向膜间隙，中央区域伸向基质。它与分子复合物SFXN-1/2和线粒体核糖体大亚基形成功能性三联体。由SMIM26介导的丝氨酸转运体与线粒体核糖体之间的相互作用促进复合物I亚基mt-ND5的翻译。SMIM26在OCI-AML2细胞和各种AML模型（MV4-11、THP-1和K562）中具有高表达水平。敲除SMIM26导致复合物I组装减少和增殖减少，而重新表达恢复生长。AML高度依赖叶酸代谢并对抗叶酸剂敏感。在叶酸依赖性AML异种移植模型中敲低SMIM26减少肿瘤生长，并被证明在小鼠中导致胚胎致死，提示它是复合物I生物发生的关键调控因子并驱动氧化代谢。需要在原代患者队列中临床验证SMIM26表达并评估其与白血病患者生存结局的关联。
EMBOW
SCRIB基因的5′UTR开放阅读框（uORF）编码120个氨基酸的EMBOW微蛋白，主要定位于细胞核，已被发现显著抑制MLL1重排白血病细胞系MV-4–11中的H3K4甲基化。EMBOW通过与WDR5的WIN位点相互作用作为WDR5的天然竞争性抑制剂，并限制其在细胞核中与MLL-1的结合，从而减少H3K4甲基化。早期研究设计了WDR5降解剂MS67，其在体外和体内抑制AML患者中MLL重排细胞的恶性生长。WDR5对MLL1融合驱动转录和白血病干性至关重要，维持HOXA9和MEIS1致癌程序；其被EMBOW微蛋白抑制导致细胞周期和抗凋亡调控因子转录减少。此外，EMBOW衍生肽Ac7在MV-4–11异种移植模型中表现出抗肿瘤活性，突显了微肽靶向白血病表观遗传机器的治疗干预，标志着向癌症治疗迈出的重要一步。
进一步研究微蛋白在白血病生物学调控中的存在和参与包括一项T-ALL circRNA组分析研究，其鉴定了跨越反向剪接连接处具有ORFs的小部分circRNAs。一项涉及K562和MOLT4细胞系的比较蛋白质组学研究鉴定了28个未注释的细胞系特异性sm/alt-ORF编码蛋白。许多ncRNAs，包括lncRNAs如HOXB-AS3、LINC00467和LINC00665，circRNAs如circFBXW7，以及miRNAs如miR34a，已与白血病细胞生物学强烈关联。然而，关于其在白血病背景下蛋白质表达的研究缺乏。相反，这些ncRNAs已在其他癌症类型的研究中被报道编码微蛋白。例如，HOXB-AS3在结直肠癌中、circFBXW7在脑癌中、miR34a在鼻咽癌中已被报道编码肿瘤抑制性微蛋白。LINC00665在T-ALL中上调，编码CIP2A-BP，其在乳腺癌和肝细胞癌中调控PP2A相关信号。LINC00467编码ASAP，一个94aa肽，具有ATP合酶调节活性，促进结直肠癌。尽管很少有研究调查白血病中的微蛋白翻译，现有证据表明相当大的潜力，表明进一步研究可能产生具有有意义临床意义的重要生物学和治疗发现。
微蛋白的治疗意义
从治疗角度看，微蛋白的特征如小尺寸和受限的相互作用界面提供巨大优势。在白血病中，遗传异质性和克隆演化限制以突变为中心治疗的持久性，靶向调控翻译、代谢或染色质组织等基本过程的微蛋白可能提供更持久的疗效。使用微蛋白优于传统治疗药物的额外优势是微肽具有较低的细胞毒性和脱靶效应可能性。微蛋白介导的相互作用可能使用小分子抑制剂或基于肽的药剂进行治疗性利用。调节微蛋白表达可能具有增强现有抗癌治疗疗效的潜力。
从ncORFs翻译的微蛋白已被牵涉于新抗原产生，为免疫治疗提供额外靶点。传统单克隆抗体和CAR-T细胞方法由于微蛋白的细胞内定位和不稳定性质无法直接靶向完整微蛋白。然而，当由内源性抗原呈递通路加工时，这些微肽片段作为优良的高度特异性肿瘤新抗原，可使用T细胞受体（TCR）工程化疗法或TCR样抗体有效靶向。肿瘤特异性抗原是肿瘤细胞由于基因组改变或失调RNA剪接和紊乱蛋白质产生而产生的抗原。免疫肽组学等新兴技术可促进表征由HLA呈递机器加工和呈递的细胞蛋白。该方法首先涉及使用免疫亲和原理分离HLA上呈递的免疫肽，随后使用MS鉴定。将免疫肽组学与RNA-Seq和Ribo-Seq数据集结合能够全面评估转录、翻译和HLA呈递之间的相关性。表2总结了研究各种癌症类型中ncRNA衍生抗原性肽的研究。免疫肽组学调查和蛋白质基因组学分析的进步已允许鉴定源自ncORFs呈递于MHC-I上的肽段，使得能够检测传统突变经典蛋白之外的新型肿瘤特异性抗原和新抗原。重要的是，许多这些非经典肽在正常组织中缺失或罕见，增加肿瘤特异性特征并降低治疗、新抗原疫苗或T细胞工程的脱靶风险。
ncORF编码的微蛋白已被证明由HLA分子有效呈递。人类B细胞中约10%的MHC-I相关肽起源于基因组推定的非编码区域的发现突显了微蛋白作为免疫治疗候选物的潜力。例如，一项AML研究鉴定了21个非经典来源的高置信度新抗原。其中若干新抗原显示与MHC等位基因强结合，使其成为免疫治疗的有吸引力的靶点。AML中反复突变的NPM1基因产生一个altORF衍生肽，其作为经验证的HLA-A*02:01限制性新抗原用于TCR工程化T细胞疗法。此外，NPM1的5′ UTR已被发现表现出增加的核糖体占据，提示uORF衍生肽可能贡献于肿瘤相关免疫肽组。许多研究报道CircRNAs在不同细胞系和组织中由核糖体翻译，提示其作为癌症抗原的重要来源和黑色素瘤和肺癌癌症免疫肽组贡献者的潜力。值得注意的是，circRNA衍生肽已被证明引发抗肿瘤免疫，在小鼠中接种疫苗显著减少体内肿瘤生长。
在B-ALL中，靶向CD19和CD22的CAR-T细胞疗法已改变治疗格局，估计缓解率为70%–90%。然而，在其他白血病类型如T-ALL或AML中，CAR-T疗法面临挑战，包括CAR-T自相残杀、由于缺乏特异性表面标志物导致的免疫再生障碍以及疾病异质性。有效免疫治疗的一个有前景的策略是工程化T细胞，如TCR-T或CAR-T变体，特异性结合肿瘤表面的微蛋白衍生肽（图4）。这些抗原将起源于肿瘤独有表达，消除对健康细胞的任何脱靶效应并引发强效细胞毒性应答，避免中枢耐受机制。一项肝癌研究鉴定了在多个患者中表达ncORF衍生抗原，突显其通过整合Ribo-seq和MS的多组学策略作为更大患者群体共享疫苗靶点的潜力。这种多层策略为鉴定白血病特异性抗原提供蓝图，其中仅依赖谱系特异性标志物或反复体细胞突变已被证明不足。它提供了鉴定基于外显子组流程遗漏的抗原并改善安全肿瘤特异性靶点优先排序的机会，用于开发白血病疫苗（图4）。
总之，白血病相关微蛋白的鉴定扩展了传统抗原之外的治疗景观，使这些先前描述的"幽灵产物"成为疫苗、基于TCR的疗法和其他靶向免疫治疗的有前景候选物。
结论与未来展望
近期对非经典ORFs编码微蛋白的认识为理解白血病生物学的分子复杂性提供了新视角。传统上，白血病研究聚焦于转录本水平分析，忽视非编码转录本的翻译输出。新兴证据表明这些非经典ORF衍生微蛋白如何积极参与细胞过程、代谢适应、应激反应和白血病细胞存活。由于白血病的异质性，微蛋白代表高度肿瘤特异性的实体，起源于异常转录和翻译程序而非基因组改变。
重要的是，微蛋白衍生肽由MHC分子呈递为其在免疫治疗中的利用提供了坚实基础。这特别与髓系白血病和T-ALL相关，其中肿瘤特异性抗原的缺乏和脱靶效应的风险限制了现有免疫治疗的成功。通过将焦点转向非经典来源衍生的抗原，可鉴定高度特异性、毒性较低、临床相关的靶点。
未来，涉及白血病患者转录组学、蛋白质组学和核糖体图谱的系统整合研究可能有助于鉴定临床相关微蛋白。微蛋白衍生抗原有望开发下一代疫苗、肽–MHC靶向双特异性抗体和T细胞疗法，用于更精准的免疫治疗。此外，微蛋白表达具有细胞状态依赖性并与致癌和表观遗传通路相关联，使其可用作风险分层、微小残留病（MRD）分析和治疗应答的生物标志物。微蛋白的肿瘤特异性表达和可测量性质使其成为靶向基于MS的MRD分析的有前景候选物。基于肽的MRD方法已在急性白血病和多发性骨髓瘤中被探索，证明肽特征在残留病检测和预后评估中的临床效用。当前基于MS的MRD策略主要依赖检测肿瘤特异性免疫球蛋白衍生肽特征，特别是免疫球蛋白的独特互补决定区序列。重要的是，MS不仅仅是补充平台，因为比较研究表明MS可检测NGF遗漏的残留病，突显其在MRD评估中日益增长的作用。此外，MS阴性与新诊断多发性骨髓瘤中延长的无进展生存和总生存显著相关。同样，微蛋白也有潜力推进靶向基于MS的MRD检测，因为其小尺寸、确定的肽组成和可测量的丰度，使其能够整合到纵向疾病监测中。此外，许多微蛋白起源于与肿瘤发生和治疗耐药相关的非经典或癌症特异性翻译事件；因此，治疗后微蛋白衍生肽的持续或再现可能反映残留恶性克隆并可能比传统临床方法更早预测复发。总之，血液系统恶性肿瘤中微蛋白的探索为发现和临床干预开辟新途径，为更有效的诊断和治疗策略铺平道路。
