《Frontiers in Bioinformatics》：Exploring candidate molecular links between aspartame and pulmonary arterial hypertension through network toxicology and transcriptomics
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目的：识别阿斯巴甜靶点谱与肺动脉高压（PAH）相关转录组特征之间的候选分子重叠。方法：整合网络毒理学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）与12种机器学习算法对候选基因进行优先级排序。通过分子对接、单细胞RNA测序及虚拟CAPN1敲除分析，探讨预测的相互作用、
目的：识别阿斯巴甜靶点谱与肺动脉高压（PAH）相关转录组特征之间的候选分子重叠。方法：整合网络毒理学、加权基因共表达网络分析（WGCNA）与12种机器学习算法对候选基因进行优先级排序。通过分子对接、单细胞RNA测序及虚拟CAPN1敲除分析，探讨预测的相互作用、细胞表达模式与网络扰动。结果：共识别21个重叠基因，富集于肾素-血管紧张素及钙相关过程。机器学习优先筛选出CAPN1、ERAP2、ITK、PTGS1和KDR。五基因组合在肺组织中受试者工作特征曲线下面积（AUC）达0.972，在外部血液样本中为0.660。对接评分为?8.0至?5.7 kcal/mol。PAH样本显示造血细胞比例降低，且该群体内CAPN1表达减少。虚拟CAPN1敲除识别出VNN2与MLX为候选网络效应因子。结论：上述分析为探究阿斯巴甜相关靶点谱与PAH之间的分子关联优先提供了候选基因。缺乏暴露记录、代谢物测定及实验验证使研究结果仅限于假设生成。
研究背景方面，阿斯巴甜按JECFA与EFSA标准每日允许摄入量（ADI）为40 mg/kg体重/天，美国食品药品监督管理局（FDA）定为50 mg/kg体重/天。摄入后阿斯巴甜迅速水解为苯丙氨酸（约占重量50%）、天冬氨酸（40%）和甲醇（10%），完整化合物进入体循环可忽略。因此潜在血管效应可能涉及循环代谢物，尤其是苯丙氨酸。既往研究已将阿斯巴甜或其他非营养性甜味剂与心脏代谢、炎症及神经学结局相关联；在103,388名参与者队列中，包括阿斯巴甜在内的非营养性甜味剂摄入量较高与心血管事件呈正相关；实验研究亦将阿斯巴甜与高脂血症小鼠动脉粥样硬化加速相联系，机制涉及迷走神经介导的胰岛素依赖途径。肺动脉高压（PAH）是一种相对少见的慢性进展性心血管疾病，以肺动脉压升高伴右心室肥厚为特征，血管重塑、持续血管收缩与血管周围炎症参与疾病进展。据2021年全球疾病负担系统分析，全球年龄标化患病率为2.28/10万，死亡率为0.27/10万。靶向一氧化氮、前列环素和内皮素通路的治疗可延缓进展，但治疗仍具挑战性；择期非心脏手术围术期死亡率报告为0%至18%，急诊情况下为15%至50%。目前尚不清楚阿斯巴甜相关靶点谱是否与PAH相关分子通路存在交叉，因此研究人员整合生物信息学与机器学习方法以优先筛选候选PAH相关分子，旨在为后续基于暴露的实验研究生成假设。
研究人员开展的研究为：从NCBI基因表达综合数据库（GEO）获取四个微阵列数据集，肺组织数据集GSE113439与GSE117261构成发现队列，外周血单个核细胞（PBMC）数据集GSE131793与GSE33463提供外部验证；采用ComBat校正批次效应并以主成分分析（PCA）评估。从PubChem、ChEMBL和SuperPred收集阿斯巴甜候选靶点（限Homo sapiens）。用limma识别差异表达基因（DEGs），阈值为本杰明-霍赫伯格校正P<0.05且|log2倍数变化|>0.585。采用WGCNA（v1.74）构建共表达网络，软阈值功率使无标度拓扑拟合R2>0.85，最小模块60个基因，模块合并高度0.25。以DEGs与PAH相关模块基因的并集定义疾病相关基因集，与阿斯巴甜靶点取交集，用超几何检验评估重叠显著性（背景为数据集中检测到的23,306个基因）。用clusterProfiler进行基因本体（GO）与京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析。用12种算法（Lasso、Ridge、Enet、SVM、RF、XGBoost、GBM、glmBoost、Stepglm、plsRglm、LDA、Naive Bayes）生成113种模型组合，五折交叉验证优化超参数，保留特征少于5个的模型被排除，以AUC、准确率和F1分数评估，并用SHAP（SHapley Additive exPlanations）解释模型。用CB-Dock2（结合CurPocket空腔检测与AutoDock Vina）进行分子对接。单细胞数据GSE293580为作者整理的Seurat对象，含12名供者（4例对照、4例特发性PAH即IPAH、4例系统性硬化症相关PAH即SSc-PAH），对注释为Hematopoietic的细胞以Wilcoxon秩和检验识别DEGs（|log2倍数变化|>0.25，校正P<0.05），并用AddModuleScore汇总钙相关表达。用scTenifoldKnk（v1.0.3）在对照造血细胞中模拟虚拟CAPN1敲除。
主要关键技术方法概括：网络毒理学靶点预测与多数据库整合；基于GEO公共队列的批量转录组差异分析与WGCNA共表达网络；12种机器学习算法组合建模结合SHAP可解释性分析；分子对接（CB-Dock2/AutoDock Vina）；单细胞RNA测序分析（GSE293580）与scTenifoldKnk虚拟基因敲除。样本队列来源为GEO数据库的GSE113439、GSE117261、GSE131793、GSE33463及GSE293580。
研究结果方面，3.1候选阿斯巴甜靶点：整合三个数据库去重后识别163个独特候选靶点。3.2 PAH相关基因：ComBat降低了数据集间分离，差异分析识别166个DEGs；WGCNA以β=6达到R2≥0.85，识别10个共表达模块，turquoise模块与PAH正相关最强（r=0.50，P=3×10?8）；其1,703个基因与166个DEGs（含30个共享基因）合并得1,839个PAH相关候选基因。3.3重叠靶点与功能富集：163个阿斯巴甜靶点与1,839个PAH相关基因共享21个基因（超几何P=0.0178）；GO富集涉及受体与肽分解代谢、一氧化氮介导信号、钙稳态、溶酶体与内吞膜、内肽酶与组蛋白激酶活性；KEGG识别肾素-血管紧张素系统（RAS）富集（校正P=0.027）。3.4模型解释与外部评价：筛选113种组合后选定RF+XGBoost模型，保留15个特征；SHAP排序CAPN1、ERAP2、ITK、PTGS1、KDR最高，CAPN1平均绝对SHAP值最大（0.120）；CAPN1与KDR高表达一般贡献较低预测PAH概率，ERAP2、ITK、PTGS1高表达贡献较高概率；五基因组合在发现肺组织AUC为0.972（95%CI 0.935–1.000），外部PBMC为0.660（95%CI 0.534–0.787）；CAPN1单独肺组织AUC为0.823（95%CI 0.730–0.916），PBMC为0.721（95%CI 0.589–0.853）；决策曲线分析显示阈值概率0.20–0.75区间净获益为正，但外部校准发生偏移；ERAP2与ITK在批量肺组织中显著上调，CAPN1、PTGS1、KDR未达DEG标准，说明特征重要性并不直接对应差异表达。3.5预测对接构象：阿斯巴甜对接CAPN1（2ARY）、ERAP2（5AB0）、ITK（4M15）、PTGS1（6Y3C）、KDR（4ASD），Vina评分?8.0至?5.7 kcal/mol，ERAP2最低；预测构象包含检测空腔内的氢键接触；对照对接钙敏感受体（CaSR；PDB 5K5S）中西那卡塞为?9.9 kcal/mol、苯丙氨酸为?6.3 kcal/mol，但跨蛋白比较不能确立等效结合亲和力或生理靶点结合。3.6单细胞图谱与虚拟CAPN1扰动：PAH组造血细胞与中性粒细胞比例降低，肥大细胞、成纤维细胞和平滑肌细胞更丰富；IPAH中肺泡巨噬细胞与纤毛上皮细胞增加，SSc-PAH中树突样巨噬细胞与基底上皮细胞增加；CAPN1、KDR、PTGS1、ERAP2优先表达于注释的造血群体，ITK主要表达于NK–T细胞；GSEA显示PAH中"参与出芽血管生成调控的细胞迁移"基因集富集；因CASR检测低，以20基因特征评估钙相关表达，PAH造血细胞中CAPN1与CAPN2表达较低而PLCG1与CACNA1C较高，但总体钙信号评分组间无显著差异；虚拟CAPN1敲除识别VNN2与MLX为最显著受扰动的网络基因。
讨论部分总结：研究人员指出阿斯巴甜体内迅速水解且安全性仍有争议，PAH涉及炎症、氧化与代谢过程驱动血管重塑，苯丙氨酸经CaSR激活致啮齿类肺动脉高压为代谢物介导血管效应提供依据，但未证明膳食阿斯巴甜产生类似肺部效应。RAS富集将重叠基因与血管调节通路联系，ACE/AngII/AT1R轴与ACE2/Ang-(1–7)/Mas轴至关重要，RAS与PAH进展密切相关，ACE2-Ang-(1–7)-Mas轴可改善内皮依赖性血管舒张、抑制血管与心脏重塑并抑制炎症反应，拮抗AT1R可改善慢性尼古丁诱导的PAH与右心室重塑，但富集结果不支持阿斯巴甜改变这些通路。CAPN1、PTGS1、KDR未达批量DEG阈值，与网络及特征选择可捕捉均值表达差异之外的信息相符，但模型重要性本身不确立功能调控作用；CAPN1活性依赖钙可用性，不能由转录丰度直接推断；既往研究将CAPN1表达升高与缺氧肺组织及肺动脉平滑肌细胞中HIF-1α相关重塑和纤维化相联系，CAPN1/TGF-β/TFRC通路参与铁死亡，抑制该通路可改善缺氧诱导PAH相关肺血管内皮功能障碍，这些发现与本研究在注释造血群体中观察到的CAPN1降低不同，强调细胞类型与疾病背景的重要性；结合苯丙氨酸–CaSR证据，CAPN1优先化提示可检验的代谢物–钙信号假说，虚拟扰动进一步提名VNN2与MLX，提示白细胞转运、氧化应激与能量代谢的候选联系，仍需功能验证。ITK表达于造血谱系并参与免疫信号，全外显子测序已将其识别为原发性干燥综合征相关PAH（pSS-PAH）的潜在易感位点，其在Th2分化中的作用也与Th2反应促进PAH进展的证据一致。ERAP2为M1氨肽酶，将血管紧张素III加工为血管紧张素IV，连接肽代谢与RAS调控，其较低对接评分与特征重要性提示值得进一步研究，但对接不能表明阿斯巴甜改变ERAP2活性或局部肽加工。KDR编码血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2），调控内皮增殖、迁移、分化与存活，罕见变异研究将KDR功能丧失变异与PAH易感性相联系，ClinGen肺动脉高压基因 curation 专家组将KDR与PAH的基因–疾病关系定为确定性，KDR还可能是先天性心脏病相关PAH（APAH-CHD）的关键遗传决定因素，相关表型包括一氧化碳弥散能力降低与肺实质异常，中断VEGF/VEGFR-2信号轴足以在鼠模型中诱发PAH并在缺氧下加重。PTGS1编码的环氧合酶-1（COX-1）在血管内皮为主要亚型，具有"双刃剑"特性，既产抗血栓前列环素又驱动促血管收缩与血管炎症的病理介质，儿童先天性心脏病相关PAH中PTGS1与PTGS2表达升高且PTGS2诱导更强，其致病或保护作用需直接检验。局限性包括：公共转录组数据缺乏膳食史与循环代谢物测定，无法评估暴露、剂量或持续时间；母体化合物靶点预测因完整阿斯巴甜极少进入体循环而药代动力学相关性有限；静态对接不能确立结合、靶点调节或生理暴露下效应；外部PBMC区分度有限且校准跨队列偏移，五基因组合可移植性受限；回顾性结果不确立临床效用；单细胞表达与虚拟敲除结果仍为描述性或基于模型，需独立生物学验证。未来应检验受控阿斯巴甜或苯丙氨酸暴露是否改变肺血管重塑与CaSR–CAPN1信号，细胞特异性扰动实验可区分CAPN1丰度与酶活性变化并评估预测的VNN2/MLX反应，需具备经验证摄入与代谢物测定的前瞻性队列，生物物理结合研究与分子动力学模拟可在治疗或临床应用前澄清结构预测。
结论翻译：整合计算分析识别21个阿斯巴甜–PAH重叠候选基因，并优先筛选CAPN1、ERAP2、ITK、PTGS1和KDR。单细胞分析将CAPN1相关变化定位至注释的造血群体，虚拟扰动提名VNN2与MLX为候选网络效应因子。这些结果为基于暴露与功能的研究提供指引，但未确立阿斯巴甜为PAH危险因素，也未验证该基因组合的临床用途。
