《BMC Methods》：Optimized protocol for single-cell and bulk transcriptomic profiling of stabilized hemocytes from Anopheles gambiae mosquitoes
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背景：昆虫血细胞（hemocytes）在针对病原体的先天免疫应答中发挥关键作用。然而，由于昆虫媒介如冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）血细胞体积小、RNA含量低、数量有限且高度反应性，其转录组谱分析和研究面临挑战。方法：为应对上述挑战，研究人员开
背景：昆虫血细胞（hemocytes）在针对病原体的先天免疫应答中发挥关键作用。然而，由于昆虫媒介如冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）血细胞体积小、RNA含量低、数量有限且高度反应性，其转录组谱分析和研究面临挑战。方法：为应对上述挑战，研究人员开发了一套针对成年雌性冈比亚按蚊稳定化血细胞的单细胞RNA测序（scRNA-seq）与批量RNA测序（bulk RNA-seq）方案。灌注（perfusion）采集血细胞后立即进行稳定化处理，可防止样本采集过程中的转录变化和RNA降解，从而最大限度减少技术性伪影（technical artifacts）。稳定化处理后，对血细胞进行过滤以去除污染组织和采样过程中组织损伤引入的环境RNA（ambient RNA），富集血细胞特异性转录本。稳定化血细胞可储存长达四周，便于样本保存、运输及多样本同时处理，从而降低成本并减少批次效应（batch effects）。讨论：研究人员的单细胞RNA测序稳定化与处理方案兼容10X Genomics平台，可产生高质量且可重复的数据。与其他现有方法相比，该方案展示出更高的血细胞回收率，能够鉴定稀有血细胞群体。然而，该方案仍需进一步优化以提高小型原血细胞（prohemocytes，直径< 5 μm）的回收率。研究人员的批量mRNA稳定化与血细胞富集方案可获得高质量、完整的RNA，Illumina批量mRNA测序文库能够深入探究血细胞中的基因表达变化。这些方案显著改善了血细胞的转录组分析，对于推进媒介生物学和疾病控制领域的发现至关重要。此外，该方案仅需少量优化即可应用于其他蚊种及可能的许多其他昆虫。
昆虫血细胞（hemocytes）是昆虫包括冈比亚按蚊（Anopheles gambiae）——疟疾致病性疟原虫（Plasmodium）的主要传播媒介——的主要免疫细胞。近年来，血细胞研究对于理解蚊虫先天免疫系统的机制细节及其在消除病原体以限制疾病传播中的作用日益重要。根据形态学特征，蚊虫血细胞被分为三种不同的细胞类型：前体原血细胞（prohemocytes）、吞噬性粒细胞（granulocytes）和介导黑化反应的绛色细胞（oenocytoids）。单细胞RNA测序（scRNA-seq）已成为一种强大且高度灵敏的工具，可基于独特的基因表达谱对细胞进行表征，在揭示蚊虫血细胞的功能异质性和新亚群方面取得了巨大进展。此外，批量mRNA测序现已成为研究血细胞对不同病原体和特定生理条件的全局转录组响应不可或缺的工具。
对成年蚊虫血细胞进行单细胞和批量转录组分析极具挑战性，因为这些细胞体积小、RNA含量低、高度反应性，且在蚊虫血淋巴中数量有限。此外，循环血细胞是通过缓冲液对单只蚊虫进行血腔灌注（hemocoel perfusion）获得的。该操作会对胸部区域造成损伤，可能导致松散组织的其他细胞（如脂肪体滋养细胞，fat body trophocytes）污染，或受损组织释放到血淋巴中的环境RNA（ambient RNA）污染。因此，血细胞RNA-seq面临的主要挑战包括：在较长的样本采集过程中基因表达的改变和RNA降解风险，以及灌注样本中其他细胞RNA的污染。这些问题可能导致不必要的数据变异和保真度丧失，并引入严重影数据质量的技术性伪影，使结果解释复杂化。因此，优化一套稳健的scRNA-seq和bulk RNA-seq血细胞方案以最大限度减少潜在技术性伪影并产生高质量、可重复的数据至关重要。
在此，研究人员开发了一套针对成年雌性冈比亚按蚊稳定化血细胞的单细胞和批量RNA测序分析方案。用于单细胞RNA测序的血细胞通过将灌注液立即置于vivoPHIX?（一种深共熔溶剂，deep eutectic solvent）中进行稳定化；用于批量测序时，使用RNAprotect Cell Reagent?防止RNA降解。这些处理可稳定细胞组分并在采样时保持血细胞的转录组景观，使样本储存和多组样本同时处理成为可能，从而最大限度减少批次效应和技术变异。该方案使用的灌注法血细胞采集与其他报道和技术相比可获得更高数量的细胞（每只糖饲蚊虫5000–10000个血细胞 vs. 500–4000个血细胞）。
使用vivoPHIX对血细胞进行单细胞RNA测序稳定化，随后采用本研究开发的基于乙醇的回收方案，与下游多组学应用兼容，包括使用10X Genomics平台进行scRNA-seq文库制备。与其他报道的方案（如使用SMART-seq2单细胞技术处理需要立即样本处理的活血细胞）相比，该方案回收的细胞数量更高。SMART-seq2是一种基于板的单细胞方法，通常通过FACS（荧光激活细胞分选）分离活血细胞，而10X Genomics利用微流控技术将单个细胞捕获在纳升级GEM（凝胶珠乳液，Gel Beads in Emulsion）中。活血细胞分选还需要用染料染色，可能引入不良的转录变化，影响细胞活力，从而损害数据质量和细胞回收率。scRNA-seq数据的强度依赖于分析中包含的细胞数量和质量。使用更多高质量细胞进行聚类分析对于鉴定稀有细胞群体和以更高置信度检测簇间转录组差异至关重要。一旦样本为bulk RNA-seq进行了稳定化，就可以通过不同尺寸截留的过滤去除灌注样本中较大的细胞或组织碎片来富集血细胞。随后通过离心回收血细胞，减少环境RNA污染并在下游文库制备中富集血细胞特异性转录本，从而提高样本质量并促进数据获取和分析。
此外，稳定化血细胞可在两种保存液中于4 °C储存长达4周，便于样本保存和运输。需要注意的是，小型血细胞如原血细胞（直径< 5 μm）的回收率（20–30%）低于较大血细胞如绛色细胞和粒细胞，这可能在单细胞RNA测序样本制备中引入潜在的细胞类型偏倚。此外，为获得足够的血细胞进行单细胞文库制备并最小化个体蚊虫间血细胞组成的变异，需要从多只蚊虫中汇集血细胞。尽管如此，该方案已在成年雌性冈比亚按蚊血细胞的单细胞转录组分析中得到验证，并基于独特分子标记的表达鉴定出若干原血细胞和粒细胞亚群。在同一研究中，稳定化样本的批量转录组分析方案也成功用于血细胞对特定免疫信号通路调控响应的深入全局转录组分析。总之，稳定化血细胞的单细胞和批量转录组分析方案将有助于深入理解蚊虫免疫应答，推动媒介生物学和疾病控制领域的发现。
研究人员开展了针对成年雌性冈比亚按蚊稳定化血细胞的单细胞和批量RNA测序方案开发与验证研究。研究结论为：该单细胞RNA测序稳定化与处理方案兼容10X Genomics平台，可产生高质量且可重复的数据，与其他现有方法相比展示出更高的血细胞回收率，能够鉴定稀有血细胞群体；但该方案仍需进一步优化以提高小型原血细胞（直径< 5 μm）的回收率。批量mRNA稳定化与血细胞富集方案可获得高质量、完整的RNA，Illumina批量mRNA测序文库能够深入探究血细胞中的基因表达变化。这些方案显著改善了血细胞的转录组分析，对于推进媒介生物学和疾病控制领域的发现至关重要，且仅需少量优化即可应用于其他蚊种及可能的许多其他昆虫。
