《Journal of Advanced Research》：Restoring the repair–fibrosis balance via a localized extracellular vesicle–pirfenidone dual-delivery biomaterial platform promotes ureteral repair after thermal injury
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输尿管热损伤是妇科、结直肠及输尿管镜手术公认的并发症。输尿管热损伤后，微血管破坏、缺血、缺氧、炎症细胞浸润及活性氧（ROS）持续蓄积，在转化生长因子-β1（TGF-β1）等促纤维化介质作用下，成纤维细胞分化为肌成纤维细胞并产生过量细胞外基质（ECM），尿路上皮
输尿管热损伤是妇科、结直肠及输尿管镜手术公认的并发症。输尿管热损伤后，微血管破坏、缺血、缺氧、炎症细胞浸润及活性氧（ROS）持续蓄积，在转化生长因子-β1（TGF-β1）等促纤维化介质作用下，成纤维细胞分化为肌成纤维细胞并产生过量细胞外基质（ECM），尿路上皮细胞亦可发生上皮–间充质转化（EMT），共同驱动输尿管壁进行性纤维化增厚与管腔狭窄。现有治疗主要依赖尿液引流、腔内泌尿外科干预与手术重建，但长期支架置入可致多种并发症，重建手术多具侵入性，且愈合过程中形成的瘢痕组织增加再狭窄风险。间充质干细胞（MSCs）来源细胞外囊泡（EVs）可调控炎症、氧化应激、血管生成与组织修复，但局部给药易被快速清除、靶部位滞留不足；吡非尼酮（PF）具有抗纤维化作用，但靶部位蓄积不足且全身给药可能产生不良反应。鉴于输尿管修复结局取决于修复性反应与纤维化反应之间的平衡，本研究设计了一种局部双递送平台EG_PFM，由载有MSC来源EVs的壳聚糖/透明质酸水凝胶（EG）与载有吡非尼酮的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米纤维膜（PFM）组成。EG旨在与损伤输尿管保持紧密接触、增强EV滞留并实现损伤部位持续局部释放；MSC来源EVs据报可促进血管生成、降低氧化应激并调节炎症反应，而PF通过抑制过量ECM产生与纤维化组织形成发挥抗纤维化效应。通过整合上述互补活性，EG_PFM旨在支持组织修复的同时限制输尿管热损伤后过度纤维化重塑。研究人员在兔输尿管热损伤模型中评估了EG_PFM对组织修复、纤维化、氧化应激、血管生成及炎症反应的治疗效果，并进行了转录组测序以刻画治疗相关的转录组改变与通路富集模式。
研究背景：输尿管热损伤是妇科、结直肠及输尿管镜手术的公认并发症，电凝设备、超声刀等能量器械的误用可造成热损伤，43 °C以上即可诱导热损伤，超过54 °C可致组织坏死，合并肾内压升高时热–压复合效应可进一步加重损伤。热损伤后输尿管发生微血管破坏、缺血、缺氧、炎症细胞浸润及活性氧（ROS）持续蓄积等病理改变，持续氧化应激与组织缺氧促进成纤维细胞活化与胶原沉积，在转化生长因子-β1（TGF-β1）等促纤维化介质作用下成纤维细胞分化为肌成纤维细胞并产生过量细胞外基质（ECM），尿路上皮细胞亦可发生上皮–间充质转化（EMT）提供额外产基质细胞来源，随纤维化进展管腔进行性狭窄，导致尿液引流受损、肾积水甚至不可逆肾功能损害。现有治疗主要依赖尿液引流、腔内泌尿外科干预与手术重建，轻度狭窄常用双J管置入与抗感染治疗，较重病变需球囊扩张、腔内输尿管切开或重建手术，但长期支架置入可致多种并发症，多数重建手术具侵入性，愈合中形成的瘢痕组织增加再狭窄可能，因此亟需开发既能促进组织修复又不致过度纤维化的疗法。既往MSC（间充质干细胞）治疗面临细胞制备、表型稳定性与临床给药等挑战，基于EVs（细胞外囊泡）的无细胞策略受到关注，但局部给药受快速清除与靶部位滞留不足限制；水凝胶递送系统可延长局部滞留并实现EVs持续释放；PF（吡非尼酮）可减少瘢痕形成并减轻输尿管狭窄模型的纤维化改变，但靶部位蓄积不足且全身给药可能产生不良反应，纳米纤维膜局部递送可维持损伤组织内药物浓度并减少全身暴露。输尿管损伤修复的难点在于组织修复与瘢痕形成在愈合过程中同时发生，修复信号若持续超出急性期可促进成纤维细胞活化与基质蓄积，而过度抑制纤维化反应又可能损害正常愈合并延迟恢复，因此修复结局取决于修复性反应与纤维化反应的平衡与相互作用。基于此，本研究设计局部双递送平台EG_PFM，由载有MSC来源EVs的壳聚糖/透明质酸水凝胶（EG）与载有PF的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）纳米纤维膜（PFM）组成，EG作为局部载体与损伤输尿管保持紧密接触、增强EV滞留并提供持续局部释放，MSC来源EVs促进血管生成、降低氧化应激并调节炎症反应，PF抑制过量ECM产生与纤维化组织形成，通过整合互补活性在支持组织修复的同时限制过度纤维化重塑；该平台定位为局部生物材料治疗辅助手段而非替代既有尿液引流或重建手术。研究人员在兔输尿管热损伤模型中评估EG_PFM对组织修复、纤维化、氧化应激、血管生成与炎症反应的治疗效果，并进行转录组测序刻画治疗相关转录组改变与通路富集模式。结论：EG_PFM表现出良好的生物相容性、组织黏附性与缓释性能，体外与体内结果提示其可降低氧化应激、增强血管生成、减少胶原沉积并减轻输尿管狭窄形成，组织学与影像学分析显示该体系改善结构保存并减少上尿路扩张，探索性转录组分析进一步识别出涉及多条信号与代谢通路的治疗相关表达与通路富集模式；因此局部递送MSC来源EVs与PF可能成为输尿管热损伤的有用治疗策略，并值得在泌尿系统其他纤维化相关疾病中进一步探索。
关键技术方法：研究人员从健康足月剖宫产脐带组织（经广州医科大学附属第五医院临床研究伦理委员会批准，批件号GYWY-L2025-70，供者签署知情同意）分离人脐带来源间充质干细胞（hUCMSCs）并鉴定，采用差速离心结合超速离心从培养上清分离MSC来源EVs；以京尼平交联制备载EVs的壳聚糖/透明质酸水凝胶（EG），以静电纺丝制备载PF的PLGA纳米纤维膜（PFM）；对EVs进行小RNA测序与生物信息学分析；在SV-HUC-1、HUSMCs、HUVECs及THP-1来源巨噬细胞中开展细胞实验；建立兔输尿管电凝热损伤模型（30 W、5 s，购自广州莫斯生物科技有限公司，动物伦理批件号IAC(S)2506001）并进行局部给药，于2周和4周行CT成像，4周取材行组织学、免疫组化与DHE染色，并对各组混合组织样本进行转录组测序。
研究结果：hUCMSCs与MSC来源细胞外囊泡的鉴定与表征——流式细胞术显示分离细胞表达CD73、CD90、CD105而不表达CD34、CD45、CD14，光镜下呈典型纺锤形，经成脂（油红O）、成骨（茜素红）、成软骨（阿利新蓝）诱导验证多向分化能力；透射电镜显示EVs呈纳米级膜性杯状形态，动态光散射显示平均粒径143 ± 41 nm，蛋白免疫印迹检出CD63、CD81、CD9、HSP70与TSG101而内质网标志物钙联蛋白缺失，支持MSC来源EVs制备成功。EG与PFM的表征与释放行为——EG具互联多孔结构，在湿润条件及拉伸、扭转、水流变化下保持黏附，EVs释放呈先 burst 后缓慢释放、72 h累积约85%；PFM呈双相释放，前6 d较快、其后缓慢持续至28 d。MSC来源细胞外囊泡的小RNA图谱——小RNA测序显示microRNA（miRNA）为主要小RNA种类，miR-21-5p、let-7i-5p与miR-222-3p高度富集，与文献整理的功能miRNA数据库交集分析显示EVs含多个与抗纤维化、血管生成、抗氧化及炎症调控相关的miRNA，提示其生物活性可能由多个调控miRNA协同贡献而非单一主导效应分子；预测靶基因KEGG富集于TGF-β信号通路、ECM–受体相互作用、VEGF信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路与FoxO信号通路。EG与PFM的生物相容性——与SV-HUC-1尿路上皮细胞共培养72 h，细胞骨架染色显示细胞形态、黏附与核完整性正常，CCK-8显示生物材料组与NC组细胞活力无显著差异，两种材料均无细胞毒性。吡非尼酮抑制纤维化相关细胞活化——CCK-8显示PF以细胞类型与浓度依赖方式改变相对细胞生长，SV-HUC-1细胞相对生长由98.65 ± 4.34%降至83.26 ± 3.13%（低浓度），HUSMCs更敏感、低剂量与高剂量组分别降至63.75 ± 4.53%与32.17 ± 2.14%（均p < 0.001），划痕愈合实验显示HUSMC迁移能力相应浓度相关改变；鉴于更高浓度对HUSMC生长与迁移抑制更明显，选择150 μg mL?1作为后续工作浓度以在维持抗纤维化活性同时避免更明显的不良效应；在TGF-β1诱导的SV-HUC-1纤维化活化模型中，免疫荧光显示PF显著降低α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）与纤连蛋白表达，而单用MSC-EVs对这些纤维化标志物作用相对有限，提示PF主要作为纤维化限制性干预。MSC来源细胞外囊泡促进修复性细胞反应——CCK-8显示0–400 μg mL?1范围内MSC-EVs浓度依赖性增加相对细胞生长，SV-HUC-1细胞由89.77 ± 3.47%增至306.34 ± 8.21%、HUSMCs由87.81 ± 1.14%增至196.97 ± 5.47%，超过400 μg mL?1后增幅减弱，故选择400 μg mL?1用于后续实验；划痕愈合实验显示MSC-EVs增强两型细胞迁移能力，72 h迁移率SV-HUC-1由72.07%增至81.77%（p < 0.05）、HUSMCs由67.47%增至88.35%（p < 0.01）；在TBHP诱导氧化应激模型中，PF未显著改变细胞内ROS水平，而MSC-EVs显著降低CM-DCF荧光强度（p < 0.01）；HUVEC成管实验显示MSC-EVs显著增加分支数与总分支长度；THP-1来源巨噬细胞流式显示MSC-EVs降低CD86阳性细胞比例、增加CD206阳性细胞比例，与向M2样表型转变一致但本身不足以确立明确M1/M2极化状态。EG_PFM促进体内输尿管修复并减少纤维化重塑——建立兔输尿管热损伤模型，CT分析显示EG_PFM组在损伤后2周与4周肾积水明显减轻、肾盂体积大幅减小，大体形态观察显示输尿管连续性保存更好、上尿路扩张减轻；H&E染色显示治疗组织输尿管壁增厚减轻、管壁结构保存改善，Masson三色染色显示胶原沉积与纤维化增厚减少，标准化横断面定量显示EG_PFM组输尿管壁厚度与胶原阳性面积显著降低，与单用EG相比EG_PFM进一步降低输尿管壁厚度（p < 0.01）与胶原阳性面积（p < 0.001），支持PF加入带来的额外抗纤维化效应；DHE染色显示CTRL组强烈ROS相关荧光，CTRL与PFM组间无显著差异，而EG与EG_PFM组荧光强度分别下降86%与91%，免疫组化显示EG_PFM组TNF-α与IL-6表达显著低于CTRL组，VEGF免疫染色显示EG与EG_PFM组微血管形成增加、VEGF阳性血管数显著增多。EG_PFM与信号及代谢通路转录改变相关——对混合输尿管组织的探索性转录组分析显示EG_PFM与CTRL组间基因表达模式存在组间差异，KEGG通路富集分析提示若干治疗相关通路模式，GSEA进一步识别出钙信号、细胞黏附分子、酪氨酸代谢、视黄醇代谢等相关通路，上述结果应解释为探索性分子关联而非统计学验证的差异表达发现或因果机制。EG_PFM调控修复–纤维化稳态的拟议生物学模型——基于体外、体内与转录组发现构建工作模型：热损伤伴随氧化应激、炎症、血管损伤与纤维化共同促进输尿管进行性狭窄，MSC-EVs增强血管生成反应、减少ROS蓄积并使巨噬细胞标志物向CD206相关M2样表型转变，PF减少纤维化相关细胞活化与ECM沉积，该模型整合上述效应以改善损伤输尿管组织修复并减少纤维化改变。
讨论部分总结：输尿管热损伤仍是有挑战性的微创泌尿外科并发症，损伤后氧化应激、炎症、血管损伤与纤维化促进进行性狭窄与最终狭窄形成，输尿管不同于许多其他组织，仅结构修复不足，恢复还需保持管腔连续性与通畅的尿液输送；现有治疗主要依赖支架与手术重建，虽可恢复尿液引流但很少直接针对损伤早期的生物学改变。本研究在兔模型中应用局部EG_PFM平台，结果显示其减少ROS蓄积、胶原沉积与纤维化重塑，同时增强血管化并减少上尿路扩张，主要支持结构修复改善与梗阻性重塑减轻，但未评估直接尿液输送与肾功能恢复；转录组分析进一步揭示多条信号与代谢通路的治疗相关改变。关于修复–纤维化平衡重建，损伤输尿管愈合涉及组织修复与瘢痕形成同时进行且密切相关，修复不足可延迟恢复而基质过度沉积可致管腔狭窄与功能丧失，故治疗策略应理想地增强修复并限制纤维化同时避免瘢痕与正常愈合破坏，本研究据此联合MSC-EVs与PF以发挥各自优势，MSC-EVs降低氧化应激、降低炎症活性并增强血管生成，PF抑制纤维化相关反应、减少细胞活化与ECM沉积，该联合较未治疗对照减少纤维化并改善输尿管结构保存。关于MSC来源EVs的生物学效应，越来越受关注的是分泌的EVs介导归因于干细胞的生物学效应，囊泡由蛋白质、脂质与调控RNA组成并可影响周围细胞行为；本研究多项发现提示MSC-EVs有助于改变局部损伤反应，包括降低细胞内ROS蓄积、增加血管化并使巨噬细胞标志物向M2样表型转变，支持其在输尿管损伤后调控炎症反应与血管修复中的作用；持续炎症与组织灌注受损是输尿管热损伤后进行性纤维化的已知促成因素，限制这些早期病理反应可能减少驱动成纤维细胞活化与瘢痕形成的下游信号事件。关于PF的抗纤维化效应，PF是已确立的抗纤维化药物，主要限制病理性纤维化重塑而非直接刺激组织再生，其在修复与纤维化反应同时发生的损伤组织中作用可能尤为重要，因为过度修复相关信号可促进成纤维细胞增殖与ECM蓄积；本研究中PF降低损伤输尿管组织α-SMA表达、ECM蓄积与胶原沉积，表明有效抑制纤维化相关重塑，由于输尿管狭窄 largely 是过度瘢痕形成的后果，局部递送PF可能有助于保持管腔通畅与减少纤维化梗阻；HUSMC相对细胞生长与迁移的浓度依赖性降低提示PF抗纤维化活性须与对正常平滑肌细胞行为的潜在抑制相平衡，故选择150 μg mL?1作为兼顾抗纤维化活性与限制更高浓度更明显细胞效应的工作浓度，但该体外浓度不应解释为直接临床组织等效剂量，尚需进一步剂量–反应与局部药代动力学研究确定最佳治疗窗。关于局部双递送策略的优势与转化考虑，局部递送可通过使治疗组分紧邻损伤输尿管并减少不必要全身暴露而具优势，本平台中载MSC-EV水凝胶提供局部滞留与早期持续EV释放，载PF纳米纤维膜提供更持久的抗纤维化组分，EG_PFM组合使两种治疗组分在互补时间尺度上发挥作用并与损伤输尿管保持直接接触；从转化角度，EG_PFM定位为在输尿管热损伤被识别且损伤输尿管手术可及时的可吸收腔外生物材料治疗辅助手段，而非替代既有尿液引流、输尿管支架、腔内泌尿外科干预或重建手术，临床应用前尚需解决若干挑战：MSC-EV制品在颗粒产量、分子货物与生物效力方面可能存在供者与批次依赖变异，需标准化生产与放行标准，临床转化还需可扩展且符合GMP（药品生产质量管理规范）的EV生产、可重复质量控制、经验证的储存条件与适当效力检测；此外生物材料组分本身需进一步转化评估，EG与PFM的灭菌、降解动力学、机械稳定性与长期局部滞留应系统表征，围绕输尿管的手术操作特性、放置可重复性、输尿管运动与蠕动下的滞留性及与输尿管支架或重建手术的兼容性亦需进一步研究。关于转录组景观与通路分析，转录组分析识别实验组间治疗相关基因表达模式差异，富集分析突出EG_PFM组中钙信号、细胞黏附分子、酪氨酸代谢与视黄醇代谢等显著通路层面关联，这些通路可能与输尿管修复生物学相关，钙信号密切参与平滑肌兴奋与收缩，细胞–ECM相互作用在组织重塑中起重要作用，氧化还原稳态与组织损伤与修复反应密切相关，维甲酸信号参与细胞分化与组织发育；上述发现提示EG_PFM治疗与跨多条信号与代谢通路的协同转录改变相关而非单一分子靶点，但富集结果具关联性与假设生成性，不能确立这些通路的因果性激活或抑制，需通路特异性扰动研究确定所识别通路是否直接促成EG_PFM治疗效应。局限性方面：体内样本量较小（每组n = 4）限制统计效能、效应估计精度与组间比较稳健性，体内发现应视为初步临床前证据并需更大独立队列确认；虽标准化电凝功率与暴露时间，但未独立量化确切热穿透深度，故将模型外推至不同热穿透深度临床损伤应谨慎；观察期限于4周，不足以确定长期输尿管重塑、再狭窄形成、疗效持久性或延迟材料相关反应，需更长随访评估结构获益是否持续；虽CT与组织学显示上尿路扩张减轻与纤维化重塑减轻，但未直接测量输尿管尿液输送、分肾功能或长期肾功能恢复，故发现主要支持结构而非功能恢复；转录组分析基于每组一个混合组织样本，在测序层面缺乏独立生物学重复，故基因表达差异与通路富集模式应视为探索性与描述性而非统计学验证的差异表达发现，且富集通路未通过通路特异性抑制、遗传操作或其他机制扰动验证，不应解释为已确立因果机制，未来需采用独立生物学重复与通路特异性验证的转录组研究确认；平台转化可行性尚待确立，MSC-EV制品可能受供者与批次相关产量、货物组成与生物效力变异影响，可扩展GMP兼容生产、质量控制、储存稳定性与效力评估未在本研究中涉及；同时EG与PFM的长期体内滞留与降解、灭菌要求、手术操作、输尿管运动与蠕动中的稳定性及与标准输尿管支架或重建手术的兼容性仍待系统评估；本研究发现获自兔模型，临床转化前需在更大动物模型中验证；最后EV来源miRNA与PF相关转录改变之间的关系未直接研究，值得进一步研究。研究结论翻译：本研究开发了一种局部双递送平台（EG_PFM），将载MSC-EV的EG与PFM结合用于输尿管热损伤。该平台表现出良好的生物相容性、组织黏附性与缓释性能。体外与体内结果提示EG_PFM治疗降低氧化应激、增强血管生成、减少胶原沉积并减轻输尿管狭窄形成。组织学与影像学分析亦表明该体系改善结构保存并减少上尿路扩张。探索性转录组分析进一步识别出涉及多条信号与代谢过程的治疗相关表达与通路富集模式。因此，局部递送MSC-EVs与PF可能是输尿管热损伤的有用治疗方法，并值得在泌尿系统其他纤维化相关疾病中进一步探索。
