《Journal of Biomedical Science》：RNA splicing factors and long noncoding RNA reciprocally regulate EGFRvIII expression in human cancer cells
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背景：失调的表皮生长因子受体变异体III（EGFRvIII）促进包括口腔鳞状细胞癌（OSCC）和多形性胶质母细胞瘤在内的多种人类癌症的肿瘤进展。尽管基因组改变常与EGFRvIII表达相关，但环境致癌物及基于RNA的调控机制对其表达的贡献仍知之甚少，本研究对此进
背景：失调的表皮生长因子受体变异体III（EGFRvIII）促进包括口腔鳞状细胞癌（OSCC）和多形性胶质母细胞瘤在内的多种人类癌症的肿瘤进展。尽管基因组改变常与EGFRvIII表达相关，但环境致癌物及基于RNA的调控机制对其表达的贡献仍知之甚少，本研究对此进行了探讨。方法：在异常增生口腔角质形成细胞中建立烟草特异性亚硝胺4-（甲基亚硝胺基）-1-（3-吡啶基）-1-丁酮（NNK）和槟榔碱（arecoline）的慢性暴露模型。采用分子实验和长读长测序分析EGFR亚型的表达和剪接模式。通过功能实验、RNA pull-down、AGO2免疫沉淀、基于MS2的RNA亲和纯化和报告基因实验研究剪接因子、长链非编码RNA（lncRNA）和微小RNA（microRNA）在EGFRvIII调控中的作用。结果：致癌物暴露诱导EGFR和EGFRvIII的持续表达，增加含外显子1–8连接转录本的水平，并扩大EGFR亚型多样性。这些变化伴随剪接调控因子尤其是SRSF1的上调。转录组和功能分析鉴定出lncRNA RP11-30P6.6为致癌物响应因子，其促进细胞增殖和迁移并维持EGFRvIII表达升高。基于RNA亲和的实验显示RP11-30P6.6 pull-down组分中SRSF1和EGFRvIII相关RNA的优先回收，与其参与EGFRvIII相关RNA调控一致。功能和AGO2免疫沉淀分析与竞争性内源RNA（ceRNA）样关系一致，即RP11-30P6.6可能减弱候选microRNA的抑制作用，这些microRNA在测试条件下对EGFRvIII相对于野生型EGFR（WT-EGFR）表现出差异调控效应。干扰SRSF1、RP11-30P6.6或候选microRNA可减弱EGFRvIII表达，而这些调控组分的功能调节与肿瘤细胞生长和迁移的改变相关。结论：研究结果支持环境致癌物重编程RNA剪接和非编码RNA网络以维持EGFRvIII表达的模型。SRSF1、RP11-30P6.6和microRNA可能参与EGFRvIII表达的转录后调控，并可能为EGFRvIII相关癌症提供潜在靶点。
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的主要亚型，其发生与烟草使用、槟榔咀嚼等环境致癌物暴露密切相关。表皮生长因子受体（EGFR）是上皮性恶性肿瘤的核心致癌驱动因子，其前体mRNA可通过可变剪接产生多种亚型，其中外显子2–7框内缺失产生的截短型变异体EGFRvIII具有组成性激酶活性，与肿瘤增殖、侵袭及治疗耐药相关。尽管基因组改变（如基因内缺失或EGFR::EGFR融合）是EGFRvIII产生的重要基础，但环境致癌物如何整合基因组改变、可变剪接及非编码RNA（ncRNA）网络来调控EGFRvIII的丰度和信号输出，目前尚不清楚。基于此，研究人员提出假设：致癌物诱导的剪接因子和ncRNA网络重编程有助于在OSCC中建立EGFRvIII相关调控网络，并围绕剪接调控因子SRSF1、lncRNA RP11-30P6.6及相关microRNA展开了系统研究。
在技术方法上，研究人员建立了NNK（10 μM）和槟榔碱（50 μM）长期暴露12个月的异常增生口腔角质形成细胞（DOK）衍生模型（DOK-NNKL和DOK-AL），并结合多种OSCC细胞系、胶质母细胞瘤细胞系及HEK293T细胞开展研究。主要关键技术方法包括：PacBio环形一致性（CCS）扩增子长读长测序用于EGFR亚型解析；EGFR小基因（minigene）报告系统用于监测外显子1:8剪接连接的形成；生物素标记RNA pull-down、基于MS2的RNA亲和纯化（MS2-TRAP）联合GST pull-down用于RNA-蛋白复合物分离；AGO2免疫沉淀用于microRNA-AGO2复合物分析；双荧光素酶报告基因实验用于microRNA靶向验证；RNA原位杂交（RNA-FISH）联合免疫荧光用于亚细胞定位分析。此外，研究还分析了TCGA-HNSC数据集以评估临床相关性。
研究结果如下：
NNK和槟榔碱在人癌细胞模型中诱导EGFR和EGFRvIII表达：通过免疫印迹分析，研究人员发现多数OSCC细胞系中EGFRvIII表达高于DOK细胞；长期暴露于NNK或槟榔碱的DOK衍生细胞系中EGFRvIII表达升高；短期（72–96 h）处理同样增强EGFR/EGFRvIII表达，且在胶质母细胞瘤细胞系U87和A172中亦观察到类似诱导效应。
致癌物诱导的EGFR亚型结构重塑：通过PacBio长读长测序，研究人员发现与亲本DOK细胞相比，DOK-AL和DOK-NNKL细胞中EGFR亚型组成发生显著偏移，新注释（NIC）和新发现（NNC）亚型比例增加，提示致癌物暴露相关EGFR转录本加工改变。
RP11-30P6.6调控OSCC和胶质母细胞瘤细胞系中EGFRvIII表达：通过RNA-seq筛选，研究人员鉴定RP11-30P6.6为致癌物响应性lncRNA，并在DOK-NNKL和DOK-AL细胞中经qRT-PCR验证其上调。功能获得和丧失实验表明，RP11-30P6.6过表达增加EGFRvIII蛋白表达并促进细胞增殖、克隆形成和迁移，而敲低则降低EGFRvIII表达并抑制这些恶性表型。生物素标记RNA pull-down显示RP11-30P6.6相关组分中EGFRvIII转录本和蛋白信号的优先回收。此外，EGFRvIII过表达增加RP11-30P6.6表达，反之亦然，支持两者之间的相互关联。
NNK和槟榔碱重编程RNA剪接调控因子以促进EGFRvIII表达：RNA-seq分析鉴定出36个在两种致癌物暴露模型中一致失调的剪接和RNA加工相关基因，包括SRSF1、SRSF7、DDX21、DDX60和hnRNPA1等。EGFR小基因报告实验证实NNK或槟榔碱处理增加报告基因活性和外显子1:8剪接连接形成。siRNA敲低筛选显示PTBP1、SRSF1和SRSF7的缺失降低EGFRvIII丰度，其中SRSF1敲低一致性降低内源性EGFRvIII蛋白水平，且RP11-30P6.6敲低导致SRSF1表达下降而非SRSF7、DDX21、DDX60或PTBP1，提示SRSF1是RP11-30P6.6依赖性调控EGFRvIII表达的主要功能介导因子。
SRSF1和RP11-30P6.6协调ncRNA–剪接模块调控EGFRvIII表达：小基因特异性RT-PCR和qRT-PCR显示SRSF1过表达显著增加小基因来源的外显子1–外显子8连接转录本丰度，并增加A172细胞中内源性EGFRvIII转录本水平。生物素标记RNA pull-down显示RP11-30P6.6 pull-down组分中SRSF1的优先回收。RP11-30P6.6过表达增加DOK、DOK-AL、DOK-NNKL及A172细胞中EGFRvIII转录本丰度。在DOK-AL和DOK-NNKL细胞中，SRSF1敲低降低EGFRvIII蛋白水平和RP11-30P6.6表达，而RP11-30P6.6敲低降低SRSF1蛋白水平和EGFRvIII表达，表明两者之间存在相互调控作用。MS2-TRAP实验显示EGFR小基因RNA与SRSF1、PTBP1和DDX21等RNA加工因子的优先回收。RNA-FISH联合免疫荧光显示RP11-30P6.6信号与SRSF1阳性RNA加工区室在空间上邻近。小基因剪接实验进一步表明，SRSF1过表达增加外显子1–外显子8连接转录本丰度，而RP11-30P6.6敲低减弱此效应，提示RP11-30P6.6可能促进SRSF1介导的EGFRvIII剪接调控。
候选microRNA对EGFRvIII和WT-EGFR差异响应的鉴定和功能评估：通过miRDB Custom Prediction分析，研究人员鉴定出12个仅在EGFRvIII预测输出中出现的microRNA，选择5个候选（miR-10392-3p、miR-3941、miR-197-3p、miR-11181-3p和miR-765）进行功能分析，其中miR-11181-3p和miR-765 additionally预测可结合RP11-30P6.6。这些microRNA在DOK-NNKL、DOK-AL及短期致癌物处理的DOK细胞中一致下调。双荧光素酶报告实验显示5个microRNA显著抑制EGFRvIII报告基因活性，而对WT-EGFR报告基因的抑制程度较小。microRNA模拟物转染降低DOK-AL和DOK-NNKL细胞中内源性EGFRvIII蛋白水平，而WT-EGFR蛋白变化相对较小。在RP11-30P6.6过表达背景下，microRNA模拟物对EGFRvIII的抑制作用部分减弱，支持ceRNA样关系。AGO2免疫沉淀显示RP11-30P6.6过表达增加四个测试microRNA与AGO2复合物的富集。EGFRvIII过表达增加RP11-30P6.6水平并降低多个测试microRNA表达，进一步支持EGFRvIII、RP11-30P6.6和microRNA之间的相互调控关系。
DNA甲基化部分参与RP11-30P6.6相关microRNA的调控：5-aza-dC处理重新激活miR-197-3p、miR-3941、miR-11181-3p和miR-765表达，提示启动子甲基化部分参与其沉默；同时EGFRvIII表达降低而RP11-30P6.6表达无显著变化，提示DNA甲基化可能通过调控microRNA介导的抑制而非剪接体丰度影响EGFRvIII表达。
讨论部分总结：研究人员在讨论中指出，OSCC在东南亚地区尤其是台湾地区疾病负担沉重，槟榔咀嚼和吸烟是主要协同风险因素。EGFR信号失调是OSCC和GBM的标志，EGFRvIII变异体驱动肿瘤进展、治疗耐药和不良预后，而EGFR靶向治疗临床反应有限，提示亚型多样性和RNA水平调控可能影响EGFR依赖性。本研究鉴定了一条致癌物相关的剪接–ceRNA调控轴调控OSCC中EGFRvIII表达，提出致癌物暴露可能建立"EGFRvIII允许"状态。研究人员提出整合性"增益控制"模型：基因组允许性为EGFRvIII提供底物，而致癌物暴露诱导的剪接机器重塑放大转录本成熟和稳态丰度。RP11-30P6.6作为致癌物响应因子连接剪接与EGFRvIII转录后调控，与AGO2和剪接相关组分相关联，可能调节对EGFRvIII相对于WT-EGFR表现出差异响应的候选microRNA。研究还发现DNA甲基化可能通过调节microRNA可用性影响EGFRvIII表达，构成表观遗传层调控。研究局限性包括：缺乏常规体内遗传模型（因EGFRvIII和RP11-30P6.6的人类特异性及缺乏明确小鼠直系同源物）；慢性致癌物暴露诱导的广泛转录组和RNA加工改变不能完全与EGFRvIII特异性调控区分；RP11-30P6.6是否直接调控EGFR剪接位点选择或通过调节SRSF1丰度或更广泛RNA加工机制间接影响EGFRvIII表达尚不明确。TCGA-HNSC数据分析显示原发肿瘤中RNA剪接相关基因尤其是SRSF家族成员上调，凸显该调控轴的临床相关性。鉴于EGFRvIII靶向治疗（酪氨酸激酶抑制剂、单克隆抗体、肽疫苗、过继细胞治疗）临床获益有限，研究人员提出靶向上游RNA调控环路可能为降低EGFRvIII表达和改善治疗结局提供补充策略。
研究结论翻译：本研究揭示了一个致癌物暴露驱动的RNA调控框架，在OSCC和GBM细胞中调控EGFRvIII表达。研究人员证明烟草和槟榔来源的致癌物协调剪接和ncRNA网络促进EGFRvIII表达，建立了一种致癌亚型表达被主动维持而非仅由基因组改变决定的调控状态。
