《Journal of Equine Veterinary Science》：Differential expression of miRNAs in experimental metacarpal and lumbar wounds in horses
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马匹创伤性损伤频繁发生，可导致显著的功能性和经济损失。四肢远端区域，如腕部和跗部，由于高活动性、较大污染风险、较低血液供应、收缩速率降低以及缺乏完整的肉膜肌，均阻碍组织修复，因而是最常受累的部位。与躯干创面相比，这些部位的创面氧饱和度较低，形成与愈合并发症及过
马匹创伤性损伤频繁发生，可导致显著的功能性和经济损失。四肢远端区域，如腕部和跗部，由于高活动性、较大污染风险、较低血液供应、收缩速率降低以及缺乏完整的肉膜肌，均阻碍组织修复，因而是最常受累的部位。与躯干创面相比，这些部位的创面氧饱和度较低，形成与愈合并发症及过度肉芽组织（EGT）形成相关的缺氧微环境。愈合是一个动态过程，分为止血期、炎症期、增殖期和重塑期，各阶段相互重叠，依赖于炎症细胞、成纤维细胞、细胞外基质（ECM）和分子介质之间的相互作用。初始细胞募集后，中性粒细胞和巨噬细胞协调炎症反应，其适当消退对修复进程至关重要。在增殖期，受肿瘤坏死因子α（TNFα）、血小板源性生长因子（PDGF）和转化生长因子β（TGFβ）等细胞因子刺激的成纤维细胞促进III型胶原沉积、血管生成和肉芽组织形成，随后通过I型胶原的逐步替代进行重塑。在马匹中，尤其是掌骨和跖骨创面，该过程可演变为过度纤维增生，特征为高度血管化的EGT、增殖期持续存在以及ECM重塑不足，组织突出于皮肤水平以上。该模式在组织学和病理生理学上与人类增生性瘢痕和瘢痕疙瘩相似，包括缺氧及胶原合成与降解之间的失衡，进一步支持将马作为病理性愈合的相关模型。皮肤修复的分子调控涉及复杂的信号网络。在主要的转录后调控因子中，微小RNA（miRNA）作为小型非编码分子脱颖而出，通过翻译抑制或靶mRNA降解调控基因表达。miRNA水平改变与人类愈合障碍相关。尽管已在马组织中鉴定出miRNA，但其在该物种皮肤愈合中的作用仍鲜有阐明。微阵列分析能够同时评估数千种转录本并鉴定与病理状态相关的差异表达谱。该技术的优势之一是从少量样本（通常包含两到五个样本）中获取数千个基因集，且估计数据误差为零。该技术的稳健性甚至允许在单细胞中评估基因表达。本研究旨在利用马实验性掌骨和腰部创面的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本，确定创面中miRNA的差异表达。研究假设掌骨和腰部创面呈现不同的miRNA表达谱，反映愈合过程分子调控的区域差异。
研究背景方面，马匹创伤性损伤频繁发生并可造成显著功能和经济损失，四肢远端因高活动性、污染风险大、血供低、收缩率低及缺乏肉膜肌等因素而愈合困难，创面氧饱和度低于躯干创面，形成易致愈合并发症及过度肉芽组织（EGT）形成的缺氧微环境。正常愈合涉及止血、炎症、增殖和重塑四个重叠阶段，依赖炎症细胞、成纤维细胞、细胞外基质（ECM）与分子介质的相互作用。在马匹掌骨和跖骨创面中，该过程可演变为过度纤维增生，形成高度血管化的EGT，组织学上与人类增生性瘢痕和瘢痕疙瘩相似，支持马作为病理性愈合模型。miRNA作为转录后调控因子，通过翻译抑制或靶mRNA降解调控基因表达，其水平改变与人类愈合障碍相关，但马皮肤愈合中miRNA的作用尚不清楚，且尚无报道描述马创面愈合相关的miRNA表达，因此研究人员开展了此项研究。研究目的在于确定马实验性掌骨和腰部创面FFPE样本中miRNA的差异表达，假设两部位创面具有不同miRNA表达谱。研究结论表明，研究人员首次证明了马掌骨和腰部实验性创面中差异表达的miRNA，揭示了这两个区域间miRNA介导的转录后调控差异，为理解两区域创面愈合差异奠定基础，提示miRNA可作为难愈创面的潜在生物标志物进行研究。
关键技术方法方面，研究人员采集4匹健康混种成年马（2雌2雄）的创面样本，在右臀腰部区域和右前肢掌骨区域各创建一处全层皮肤创面，术后第21天以6 mm皮肤钻孔器采集创缘及邻近健康组织，共8个样本（每组4个），常规福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）。采用改良Belder等（2016）方法从FFPE样本提取RNA，经NanoDrop分光光度计定量及Bioanalyzer毛细管电泳结合DV200指标评估完整性。微转录组分析使用Affymetrix miRNA 4.1 Array Strip平台，FlashTag Biotin HSR标记，48°C杂交20小时，GeneAtlas系统洗涤扫描。统计分析采用Transcriptome Analysis Console（TAC 4.1）软件，以ANOVA经验贝叶斯调节（eBayes）检验，以p < 0.05、倍数变化 < ?2或 > +2、DABG < 0.05为标准判定差异表达miRNA，并在miRBase平台鉴定核苷酸序列及可能的直系同源物。
研究结果方面，创面大体外观：术后第21天活检采集时，所有动物腰部与掌骨区域创面宏观外观存在差异，腰部创面上皮化更明显，可见广泛粉红色组织区域及少量附着痂皮；掌骨创面则持续存在开放的中心区域，肉芽组织突出，闭合程度相对较低，腰部创面视觉上处于更先进的愈合阶段。差异表达miRNA鉴定：与腰部组（LG）相比，掌骨组（MG）组织样本中鉴定出6个差异表达miRNA，其中eca-miR-205是唯一显著过表达的miRNA，其余均表达降低；在人类直系同源miRNA分析中鉴定出物种间相同的miRNA，提示人类研究结果对马具有适用性。差异表达miRNA列表：与腰部创面相比，掌骨创面中eca-miR-127（人类直系同源hsa-miR-127-3p）平均表达量（log2）MG 2.88、LG 4.36，倍数变化?2.78，P=0.0058；eca-miR-379（hsa-miR-379-5p）MG 3.49、LG 4.97，倍数变化?2.78，P=0.0386；eca-miR-335（hsa-miR-335-5p）MG 2.43、LG 3.72，倍数变化?2.44，P=0.0401；eca-miR-205（hsa-miR-205-5p）MG 10.58、LG 9.25，倍数变化2.51，P=0.0425；eca-miR-376c（hsa-miR-376c-3p）MG 2.34、LG 3.93，倍数变化?3.01，P=0.0436；eca-miR-487b（hsa-miR-487b-3p）MG 3.66、LG 4.82，倍数变化?2.23，P=0.0493。
讨论部分总结：迄今为止尚无报道描述马创面愈合过程中的miRNA表达，本研究首次证明eca-miR-127、eca-miR-379、eca-miR-335、eca-miR-376c、eca-miR-487b和eca-miR-205与马腰部及掌骨创面愈合相关，区域间表达谱差异强化了马创面愈合至少部分由依赖miRNA的转录后机制调控且随组织微环境变化的假设。人类病理性瘢痕与健康皮肤间miRNA差异表达已有充分文献记载，而马尚未建立该体系；马掌骨区域创面愈合与人类增生性瘢痕和瘢痕疙瘩面临相似挑战，支持马作为人类难愈创面实验模型的表征。多种miRNA跨物种的进化保守性允许以人类直系同源物作为功能参考；尽管miR-127、miR-379和miR-376c此前已通过比较方法在马中描述，本研究首次提供其与创面愈合过程相关的差异表达证据及该物种不同解剖区域间的比较。在分析的miRNA中，eca-miR-205是掌骨区域唯一上调的miRNA，其人类直系同源物hsa-miR-205-5p具有双重功能，依背景和靶基因不同发挥肿瘤抑制或促进作用；在糖尿病溃疡模型中，其上调通过抑制血管内皮生长因子A（VEGF-A）表达负向调控血管生成，导致愈合延迟。鉴于血管生成是组织修复的核心过程且其失调损害愈合，掌骨区域创面中观察到的eca-miR-205升高提示该环境易发生血管生成失败，导致组织缺氧和血管化不足，这与马肢体创面炎症期氧饱和度较低、可能促进纤维增殖性疾病及未来EGT形成的研究一致。人类直系同源物miR-205-5p上调与磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）基因活性降低相关，导致PI3K/AKT信号通路激活和细胞增殖加剧；未来应在马中开展研究以确定eca-miR-205升高是否促成类似肿瘤过程中观察到的过度增殖细胞表型。在掌骨区域表达降低的miRNA中，miR-127和miR-487b在人类瘢痕疙瘩中亦显示水平降低；miR-127被描述为肿瘤抑制因子，负向调控细胞增殖和迁移相关基因，其下调与骨桥蛋白（OPN）增加相关，OPN是炎症、胶原调节和肉芽组织形成的关键细胞因子，因此本研究中观察到的eca-miR-127表达降低可能解释掌骨区域创面更明显的肉芽组织。直系同源物miR-379-5p和miR-335-5p在多种人类模型中对细胞增殖、迁移和侵袭发挥抑制作用；miR-379-5p下调与多种上皮中促增殖基因激活相关，miR-335-5p下调细胞生存和进展相关基因，因此这些直系同源物在马中的下调可能促进EGT中观察到的细胞过度增殖，这是掌骨区域创面愈合的常见并发症。eca-miR-376c的人类同源物miR-376c-3p是人类创面愈合多条通路的关键调节因子，证据表明其调控基质金属蛋白酶3（MMP-3）从而影响ECM重塑，并调控TGFβ/Nodal和Wnt/β-catenin通路、表皮生长因子及其受体（EGF/EGFR）以及BMI1和HOXB7基因等细胞过程相关靶点；观察到的eca-miR-376c下调提示多种转录后调控机制同时丧失，可能促进增殖期持续、重塑紊乱及马远端肢体创面常见的慢性状态。miR-487b-3p则调控人类增殖和血管生成相关通路，包括与代谢、细胞生长、增殖和分化调控相关的IRS1/PI3K/Akt/MAPK轴以及参与组织微环境信号和功能相互作用的THBS1通路，尤其在癌症、炎症和血管疾病中；其下调可导致细胞过度增殖和血管生成失调，促成易形成人类增生性瘢痕或瘢痕疙瘩的未成熟愈合微环境。综合所得数据表明，马肢体创面愈合涉及以普遍低表达miRNA为主并伴eca-miR-205上调的复杂相互作用。
研究结论翻译：本研究首次证明了马掌骨和腰部区域实验性创面中差异表达的miRNA，并揭示了这两个区域间miRNA介导的转录后调控差异。这些发现为理解这些区域间创面愈合差异铺平了道路，提示miRNA可作为难愈创面的潜在生物标志物进行研究。
