《Cancer Reports》：Effect and Mechanism of Modified Lichong Decoction on Inhibiting Proliferation and Inducing Apoptosis in AGS Gastric Cancer Cells
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背景：理冲汤为经典中药复方，临床用于治疗妇科疾病及腹中癥瘕。根据胃癌的病机特点，研究人员加入部分中药组成加味理冲汤（MLCD）用于治疗胃癌。目的：探讨MLCD抑制AGS胃癌细胞增殖并诱导凋亡的作用，并通过代谢组学及药理学验证探索其分子机制。方法：采用CCK-8
背景：理冲汤为经典中药复方，临床用于治疗妇科疾病及腹中癥瘕。根据胃癌的病机特点，研究人员加入部分中药组成加味理冲汤（MLCD）用于治疗胃癌。目的：探讨MLCD抑制AGS胃癌细胞增殖并诱导凋亡的作用，并通过代谢组学及药理学验证探索其分子机制。方法：采用CCK-8法、溴脱氧尿苷（BrdU）染色、形态学观察、DNA凝胶电泳及Annexin V-FITC/PI染色评价MLCD的药理作用。通过代谢组学及药理学验证评估MLCD的潜在分子机制。结果：药理学实验显示，MLCD可抑制AGS细胞增殖、诱导凋亡，并影响凋亡相关基因及蛋白（Bcl-2、Bim、Bax、Fas及FasL）的表达。代谢组学结果证实，包括PI3K/Akt信号通路在内的多条信号/代谢通路参与MLCD处理的AGS细胞。随后，研究人员联合LY294002进行药理学验证，结果显示MLCD可降低p-Akt及p-FoxO3a蛋白表达水平并增强FoxO3a的核转位。所有结果揭示，联合LY294002具有更显著的药理效应。同时，既往网络药理学综合结果验证了MLCD抗胃癌的相关靶点，结果显示MLCD可降低AGS细胞中P53、P21、LKB1及AMPK的基因和蛋白表达。结论：MLCD可抑制AGS细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能涉及线粒体凋亡通路、死亡受体通路、P53/P21通路、LKB1/AMPK通路及PI3K/Akt通路。
研究背景：据2022年全球癌症统计，胃癌占全球新发病例的4.9%，死亡率为6.8%。在中国，胃癌的发病率和死亡率居所有恶性肿瘤第三位。胃癌的主要治疗策略为手术切除，但患者常确诊于晚期，五年生存率不足30%。尽管手术方式、放疗、化疗及新辅助治疗取得进展，晚期胃癌患者的预后仍不理想。因此，需要新的治疗途径。中药具有多靶点、不良反应少的特点，在改善胃癌患者生活质量方面具有显著优势。理冲汤为清代名医张锡纯所创经典方剂，载于《医学衷中参西录》，由9味中药组成，用于治疗妇科疾病及腹中癥瘕。针对理冲汤治疗胃癌时补益元气与消癥散结药效不足的缺陷，依据中医辨证论治肿瘤的原则，结合胃癌元气亏虚、邪毒内蕴、痰湿瘀血阻滞的病机，研究人员对理冲汤进行加减：减去山药、瓜蒌、知母等清热补阴之品，党参等补胃气之品及鸡内金等消食化积之品，加入白花蛇舌草、半枝莲等清热解毒之品，水蛭、海藻、壁虎等消癥散结之品，西洋参、鹿茸、龟甲等补益元气之品，组成加味理冲汤（MLCD）。既往研究证实，MLCD醇水共提物对胃癌细胞的抗增殖作用强于单纯醇提物或水提物，且在多种胃癌细胞系（MNK-45、AGS、MGC-803、SGC-7901及BGC-823）中对AGS细胞增殖的抑制作用最为显著，并可诱导AGS细胞凋亡，而对GES-1细胞的抑制作用较弱。综上，本研究选择AGS胃癌细胞作为实验细胞，进一步探讨MLCD的具体作用及分子机制。
研究人员开展的研究及结论与意义：本研究通过CCK-8实验、BrdU染色、形态学观察、DNA凝胶电泳及Annexin V-FITC/PI染色证实MLCD可抑制AGS细胞增殖并诱导凋亡；通过qRT-PCR及Western blotting发现MLCD可下调Bcl-2表达、上调Bim、Bax、Fas及FasL表达；通过代谢组学发现PI3K/Akt、FoxO及AMPK等多条信号/代谢通路参与MLCD对AGS细胞的调控；通过联合PI3K抑制剂LY294002进行药理学验证，证实MLCD通过PI3K/Akt通路抑制增殖并诱导凋亡；同时验证了MLCD可上调P53、P21、LKB1及AMPK的基因和蛋白表达。本研究为MLCD治疗胃癌提供了有价值的实验依据，有助于阐明其临床应用价值，并进一步巩固其作为胃癌潜在有效替代药物的地位。
关键技术方法：研究人员采用CCK-8法检测细胞活力，BrdU染色评估细胞存活率，光学显微镜、透射电镜（TEM）及TUNEL染色观察凋亡形态学及超微结构变化，DNA琼脂糖凝胶电泳检测DNA断裂，Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测凋亡率；采用LC-MS/MS进行非靶向代谢组学分析，结合正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）筛选差异代谢物并进行KEGG通路富集分析；采用qRT-PCR及Western blotting检测相关基因及蛋白表达，免疫荧光结合激光共聚焦显微镜分析FoxO3a核转位；联合PI3K特异性抑制剂LY294002进行药理学验证。AGS细胞购自上海生命科学研究院（中国）。
研究结果：
3.1 MLCD抑制AGS细胞活力：通过CCK-8实验检测MLCD（0、150、300、600 μg/mL）处理AGS细胞24、48、72 h后的细胞活力，结果显示MLCD以剂量依赖方式抑制细胞增殖。
3.2 MLCD对AGS细胞存活率的影响：通过BrdU染色结合激光共聚焦显微镜观察，对照组BrdU标记细胞较多，随MLCD浓度增加标记细胞逐渐减少，各处理组存活率与对照组比较差异有统计学意义。
3.3 MLCD对AGS细胞凋亡形态学变化的影响：通过光学显微镜观察发现，对照组细胞生长密集、呈圆形、透明度好；MLCD处理组随剂量增加细胞逐渐出现数量减少、贴壁减弱、出现不规则角及少量细胞碎片等凋亡形态特征。通过TUNEL染色发现，随MLCD剂量增加TUNEL染色阳性细胞数增多、荧光强度显著增强。通过TEM观察发现，对照组细胞核异型性明显、核质比高、细胞器丰富；MLCD处理组随浓度增加出现核浓缩、细胞器空泡变性、核周间隙增宽及胞质脂质蓄积等凋亡超微结构特征。
3.4 MLCD对AGS细胞凋亡的影响：通过DNA琼脂糖凝胶电泳发现，对照组呈均匀条带，MLCD处理组随浓度增加呈现典型梯状条带。通过Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测凋亡率，对照组总凋亡率为（3.58%±0.69%），MLCD 150、300、600 μg/mL处理48 h后总凋亡率分别逐渐升高至（13.27%±2.40%）、（22.28%±2.84%）及（30.89%±3.83%）。
3.5 MLCD诱导AGS细胞凋亡相关基因/蛋白的表达水平：通过qRT-PCR及Western blotting检测MLCD处理48 h后凋亡相关基因及蛋白表达，结果显示与对照组比较，随MLCD浓度增加Bcl-2的mRNA及蛋白水平逐渐降低，Bax、Bim、Fas及FasL的mRNA及蛋白水平逐渐升高。
3.6 代谢组学分析结果：通过LC-MS/MS对对照组及MLCD-H组AGS细胞进行非靶向代谢组学分析，QC样本Pearson相关分析及PCA得分图表明检测过程稳定、数据可靠；200次置换检验证实OPLS-DA模型可靠。以ANOVA p<0.05、FC≥1.2或VIP≥1为标准，共鉴定出95种差异代谢物（56种上调、39种下调），包括腺苷一磷酸、腺苷-5′-二磷酸、L-丙氨酸、L-色氨酸及L-丝氨酸等。KEGG通路富集分析显示，PI3K/Akt信号通路、FoxO信号通路、AMPK信号通路（前三位信号通路）、氧化磷酸化及多条氨基酸代谢通路等多条信号/代谢通路参与MLCD对AGS细胞的调控。
3.7 MLCD抗胃癌相关靶点的验证：既往网络药理学结果已证实TP53、AKT1等多靶点及PI3K/Akt信号通路等多通路参与MLCD抗胃癌调控。本研究代谢组学结果突出AMPK通路、FoxO信号通路及PI3K/Akt通路的前三位作用。通过qRT-PCR及Western blotting验证发现，与对照组比较，随MLCD浓度增加P21、P53、LKB1及AMPK的mRNA及蛋白水平升高。
3.8 MLCD通过PI3K/Akt通路影响AGS细胞增殖与凋亡：通过CCK-8实验评估MLCD或MLCD联合LY294002对增殖的影响，结果显示MLCD显著抑制AGS细胞增殖，LY294002联合MLCD可增强MLCD对细胞增殖的抑制作用。通过流式细胞术评估凋亡率，结果趋势与CCK-8实验一致。通过qRT-PCR及Western blotting检测PI3K/Akt通路相关因子表达，结果显示Bim基因表达水平升高、FoxO3a基因表达水平降低，MLCD联合LY294002时升高或降低程度更为显著；LY294002显著增强MLCD对Akt及FoxO3a磷酸化蛋白的抑制作用。免疫荧光结合激光共聚焦显微镜观察显示，与对照组比较，MLCD（300 μg/mL）处理AGS细胞后FoxO3a蛋白核转位增强，MLCD联合LY294002时核转位变化显著增强。上述结果提示MLCD抑制AGS细胞活力及诱导凋亡可能与PI3K/Akt信号通路相关。
讨论部分总结：研究人员的临床实践发现MLCD复方对改善胃癌患者胃肠道症状及延长生存期具有良好疗效，并在抑制增殖、避免转移及加速细胞死亡方面具有一定效力，但仍需充分的实验室数据证实。本研究CCK-8实验及BrdU染色结果证实MLCD可抑制AGS细胞增殖；形态学观察证实MLCD使细胞呈现显著凋亡特征；DNA凝胶电泳及凋亡率分析证实MLCD诱导AGS细胞凋亡；基因及蛋白分析发现MLCD可降低Bcl-2基因/蛋白表达水平、升高Bim、Bax、Fas及FasL基因/蛋白表达水平。既往MLCD成分分析结合网络药理学证实MLCD治疗胃癌涉及多靶点（TP53、AKT1、HSP90AA及JUN等）及多通路（PI3K/Akt通路最为显著）调控，主要活性成分与AKT靶点的分子对接亦证实PI3K/Akt通路的参与。本研究代谢组学结果显示MLCD可通过包括PI3K/Akt信号通路、FoxO信号通路及AMPK信号通路等多条信号/代谢通路发挥抗胃癌作用。P53/P21通路是介导凋亡的最重要通路之一，P53蛋白可通过形成同源二聚体与P21结合，从而调控细胞周期及凋亡过程；P53参与对多种细胞外刺激的响应，从而激活线粒体及死亡受体相关凋亡通路，导致凋亡；P53可激活其下游靶基因P21，P21蛋白表达减弱可能导致对细胞增殖的有效监控丧失，增加肿瘤细胞恶性表型并促进肿瘤发生发展。本研究基因及蛋白结果显示MLCD可升高P53及P21基因/蛋白表达水平。AMPK信号通路是正常细胞及癌细胞中的关键能量感受器，在感知细胞能量可用性方面发挥重要作用，并诱导代谢适应通路以保证细胞存活；一旦激活，可增加ATP的分解代谢产生并抑制ATP消耗的生物合成过程。肝激酶B1（LKB1）是一种肿瘤抑制因子，作为AMPK的主要上游激活因子，在细胞生长及能量代谢中发挥关键作用，通过调节多种下游激酶调控细胞结构、凋亡及能量代谢稳态。多项研究表明LKB1/AMPK信号通路参与调控癌细胞的增殖与凋亡。本研究基因及蛋白分析发现MLCD可升高LKB1及AMPK基因/蛋白表达水平。细胞增殖与凋亡受多种信号转导通路调控，其中PI3K/Akt通路是关键的细胞内转导通路，在细胞生长、存活及凋亡中发挥调控作用。LY294002是PI3K通路的特异性抑制剂，可抑制Akt及其下游因子的激活。Bim是线粒体凋亡通路中的促凋亡蛋白，亦是FoxO3a的重要下游因子，而FoxO3a是PI3K/Akt通路的关键下游因子，Bim在肿瘤发生发展中的凋亡过程中影响显著。此外，应用LY294002抑制PI3K/Akt转导通路可导致FoxO3a蛋白从细胞质转位至细胞核，内源性FoxO3a蛋白的核转位被认为是凋亡的重要标志。本研究结果证实，LY294002药理学阻断可更有效抑制增殖、诱导凋亡、影响PI3K/Akt转导通路相关因子表达水平并增强MLCD处理AGS细胞中FoxO3a蛋白的核转位。综上，本研究结果表明MLCD可抑制增殖并诱导凋亡，可能通过多条通路发挥抗胃癌作用，为MLCD治疗胃癌提供了有价值的信息，有助于阐明其临床应用价值并进一步巩固其作为胃癌潜在有效替代药物的地位。本研究存在一定局限性：首先，本工作揭示MLCD可抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡，但是否存在其他药理作用如抑制侵袭转移或触发自噬仍需进一步探索；此外，本研究开展代谢组学结合既往网络药理学证实MLCD可通过调控PI3K/Akt通路诱导凋亡，但相关机制仍需通过基因敲低/过表达研究或 rescue 实验进一步验证。
研究结论翻译：MLCD可抑制AGS细胞增殖并诱导凋亡，其机制可能涉及线粒体凋亡通路、死亡受体通路、P53/P21通路、LKB1/AMPK通路及PI3K/Akt通路。
