《Aging Cell》：H3K18 Lactylation in Degenerated Nucleus Pulposus Cells Suppresses CD248 Through Transcriptional and Post-Translational Modifications to Promote Apoptosis and Extracellular Matrix Degradation
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椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）主要由髓核（nucleus pulposus，NP）退变驱动，该过程与乳酸蓄积增加相关。本研究探讨了组蛋白H3K18乳酸化（histone H3K18 lactylatio
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）主要由髓核（nucleus pulposus，NP）退变驱动，该过程与乳酸蓄积增加相关。本研究探讨了组蛋白H3K18乳酸化（histone H3K18 lactylation，H3K18la）在NP退变中的作用。与正常细胞相比，退变NP细胞中乳酸和乳酸化水平升高。添加外源性乳酸和糖酵解抑制剂（2-DG）分别正向和负向调控乳酸化水平。随后，研究人员发现乳酸通过H3K18la在转录和蛋白质水平调控CD248。免疫共沉淀-质谱联用（immunoprecipitation-mass spectrometry，IP/MS）、染色质免疫沉淀-蛋白质印迹（chromatin immunoprecipitation-Western blot，ChIP-WB）和染色质免疫沉淀-重复染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-reChIP-qPCR）显示，H3K18la招募SMARCA5共富集于CD248启动子区域，从而抑制CD248 mRNA表达。在蛋白质水平，乳酸通过泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin–proteasome pathway，UPP）促进CD248降解。通过敲低和过表达CD248，发现其可通过激活Hedgehog通路改善NP细胞凋亡和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解。本研究结果表明，乳酸通过H3K18la在转录和蛋白质水平调控CD248，导致CD248的双重抑制。这些发现定义了IVDD中的乳酸–H3K18la–CD248调控轴。
椎间盘退变（intervertebral disc degeneration，IVDD）是脊柱退行性疾病的核心病理过程之一，其主要驱动因素为髓核（nucleus pulposus，NP）退变。椎间盘是人体最大的无血管器官，长期处于低氧环境，其主要能量供应来源于厌氧糖酵解，随着时间推移，糖酵解终产物乳酸逐渐蓄积。已有研究报道退变人NP组织中乳酸水平升高，但乳酸长期仅被视为代谢废物，其对疾病发展的影响机制尚不清楚。近年来，代谢物诱导的组蛋白翻译后修饰（post-translational modifications，PTMs）在表观遗传学研究中日益受到重视。2019年，D. Zhang等首次证实乳酸可共价结合至组蛋白赖氨酸残基，形成乳酸化赖氨酸（lactate-lysine，Kla）结构，将乳酸化确定为一种新的表观遗传PTM。此后，多项研究揭示了乳酸化在多个领域的显著作用，但乳酸化在IVDD及NP退变中的作用仍不明确。因此，研究人员提出假设：退变NP细胞中乳酸蓄积增加诱导组蛋白乳酸化，此即本研究的基础。
研究人员开展了以下研究：首先在退变NP细胞中检测到组蛋白乳酸化并验证其修饰位点；通过外源性乳酸和糖酵解抑制剂2-DG正向和负向调控乳酸化水平；构建H3K18R点突变体以明确H3K18la的特异性贡献；通过mRNA测序筛选H3K18la下游靶基因，确定CD248为关键靶点；通过Co-IP/MS、ChIP-WB和ChIP-reChIP-qPCR揭示H3K18la招募SMARCA5至CD248启动子抑制其转录；通过CHX追踪实验和蛋白酶体抑制剂MG132明确乳酸通过UPP促进CD248蛋白降解；通过敲低和过表达CD248验证其对NP细胞凋亡和ECM代谢的功能影响；通过KEGG富集分析和GANT61抑制剂验证Hedgehog通路的中介作用；最后通过大鼠尾椎IVDD模型进行体内验证。研究得出以下结论：退变NP细胞中乳酸代谢活跃、组蛋白乳酸化水平升高，H3K18la为关键修饰位点；H3K18la通过招募转录抑制因子SMARCA5抑制CD248 mRNA转录，同时通过UPP促进CD248蛋白降解，实现对CD248的双重抑制；CD248通过激活Hedgehog通路抑制NP细胞凋亡并促进ECM合成；体内实验证实CD248过表达可显著缓解IVDD进展。本研究首次揭示了乳酸–H3K18la–CD248调控轴在IVDD中的作用，为开发NP退变的治疗策略提供了新的实验依据。
在技术方法方面，研究人员收集了2022至2024年间在哈尔滨医科大学附属第一医院接受脊柱手术患者的NP组织（按Pfirrmann分级II–V级），并购买了永生化人NP细胞系；采用非靶向代谢组学分析代谢谱，使用乳酸检测试剂盒测定乳酸含量；通过Western blot和免疫荧光检测乳酸化水平；采用mRNA-seq筛选差异表达基因；通过Co-IP/MS鉴定H3K18la相互作用蛋白；利用ChIP-qPCR、ChIP-WB和ChIP-reChIP-qPCR验证启动子富集；通过CHX追踪实验和MG132/BafA1处理明确蛋白降解途径；构建H3K18 WT/H3K18R点突变体和CD248过表达质粒进行功能验证；采用CCK-8、EdU、划痕实验和流式细胞术检测细胞增殖、迁移和凋亡；建立大鼠尾椎针刺IVDD模型并通过AAV9介导CD248过表达进行体内验证，采用H&E、番红O和Masson三色染色进行组织病理学评估。
研究结果如下：
3.1 退变NP细胞中椎间盘退变分级、乳酸代谢及组蛋白乳酸化特征——通过MRI评估将患者分为轻度退变（≤III级）和重度退变（IV–V级）组，非靶向代谢组学显示退变NP细胞中乳酸代谢活跃，重度退变NP组织中乳酸水平显著高于轻度退变组织；WB和IF一致显示退变人原代NP细胞中整体乳酸化水平升高；通过筛选五种乳酸化位点抗体，发现H3K18la变化最为显著，IF进一步验证重度退变NP细胞中H3K18la水平升高。
3.2 乳酸增加NP细胞组蛋白乳酸化，促进凋亡和ECM降解，糖酵解抑制剂可逆转这些效应——外源性乳酸处理呈浓度依赖性增加整体乳酸化和H3K18la水平；2-DG显著降低整体乳酸化和H3K18la水平；划痕实验显示乳酸损害NP细胞迁移，2-DG可大部分逆转；乳酸抑制NP细胞增殖，2-DG可有效逆转；CCK-8显示乳酸浓度递增性抑制NP细胞生长，2-DG促进细胞生长；乳酸浓度依赖性增加NP细胞凋亡，同时抑制ECM合成并促进其降解，2-DG不仅减少凋亡还恢复ECM产生；H3K18R突变体全局乳酸化和H3K18la水平显著降低，H3K18R突变消除了乳酸诱导的NP细胞凋亡和ECM降解，直接证明这些病理变化通过H3K18la介导。
3.3 H3K18乳酸化调控NP细胞中CD248表达——通过mRNA测序比较乳酸处理与对照组及H3K18 WT与H3K18R突变体，交集分析鉴定出56个重叠基因，CD248为唯一在两组数据集中表现一致调控的基因（log2FC > 1.5）；CD248被乳酸下调而在H3K18R中上调；GO分析将CD248与"ECM蛋白结合"关联；qPCR和WB证实CD248 mRNA和蛋白水平在乳酸处理中降低而在H3K18R中升高；重度退变人原代NP细胞中CD248表达降低；ChIP-qPCR显示乳酸增强H3K18la在CD248启动子区域的富集，H3K18R则减弱此富集，与CD248抑制现象看似矛盾，提示H3K18la可能招募转录抑制因子。
3.4 乳酸诱导的H3K18la招募SMARCA5抑制CD248转录并通过蛋白酶体途径促进CD248蛋白降解——Co-IP/MS显示H3K18la-IP组有67个显著富集蛋白，其中SMARCA5（一种通过水解ATP调控染色质可及性的染色质重塑因子）和p53为仅有的两个转录抑制候选因子；ChIP-WB证实SMARCA5和p53存在于H3K18la免疫沉淀物中，p53在各组间无差异，而SMARCA5在乳酸处理组和H3K18-WT组显著升高；ChIP-reChIP-qPCR进一步证实乳酸刺激下H3K18la和SMARCA5在CD248启动子附近共富集；SMARCA5敲低部分恢复了乳酸抑制的CD248转录水平，但未能恢复CD248蛋白水平，提示存在额外的翻译后调控；CHX追踪实验显示乳酸处理细胞中CD248半衰期缩短，MG132可逆转CD248耗竭而BafA1无效，证实乳酸通过UPP而非自噬促进CD248降解；Co-IP验证乳酸增强CD248泛素化，MG132处理后累积，H3K18R突变体中减弱。
3.5 乳酸抑制的CD248在体外促进NP细胞凋亡和ECM降解——si-CD248转染NP细胞后mRNA和蛋白水平显著降低；si-CD248显著促进NP细胞凋亡、增强ECM降解并抑制ECM合成；划痕实验显示si-CD248组NP细胞迁移能力显著减弱；EdU和CCK-8显示si-CD248显著抑制NP细胞增殖；si-CD248处理后加入H3K18R可逆转对CD248的转录抑制，CD248蛋白表达增加，对NP细胞凋亡和ECM降解有部分抑制作用；流式细胞术显示H3K18 WT+si-CD248组凋亡水平较高，H3K18R显著改善NP细胞凋亡。
3.6 CD248过表达通过Hedgehog通路调控NP细胞凋亡和ECM合成——CD248-OE抑制NP细胞凋亡、促进ECM合成并抑制ECM降解；划痕实验显示CD248-OE增强NP细胞迁移能力；CD248-OE可逆转乳酸诱导的NP细胞凋亡和ECM降解；EdU显示CD248-OE改善乳酸处理下NP细胞增殖；流式细胞术证实CD248-OE显著逆转乳酸升高的NP细胞凋亡；KEGG通路富集分析显示Hedgehog通路显著富集；WB显示乳酸下调Hedgehog通路核心蛋白（GLI1、SHH和SMO），CD248-OE恢复其表达；GANT61（特异性GLI1抑制剂）处理CD248过表达NP细胞后，WB显示GANT61有效降低CD248-OE升高的GLI1水平并增加CD248-OE抑制的CAS3表达，流式细胞术显示GANT61显著促进NP细胞凋亡，表明CD248通过激活Hedgehog通路抑制NP细胞凋亡并促进ECM合成。
3.7 体内实验——建立大鼠尾椎针刺IVDD模型，实验组椎间盘内注射AAV9-CD248-OE（滴度：1.70 × 10
13 vg/mL），6周后处死；Masson三色、番红O-固绿和H&E染色显示穿刺椎间盘结构显著破坏，治疗组虽存在NP组织损伤但NP、纤维环和软骨终板维持相对正常结构；WB分析显示CD248-OE显著缓解IVDD进展；免疫组化显示退变NP组织中COL2降低、MMP3升高，而CD248-OE组COL2表达显著高于退变组。
讨论部分总结：研究人员证实退变NP细胞中乳酸代谢和组蛋白乳酸化（特别是H3K18）升高；外源性乳酸补充增加乳酸化，糖酵解抑制剂2-DG通过阻断乳酸产生抑制乳酸化；通过H3K18点突变（K→R）观察到全局乳酸化降低，H3K18R显著抑制NP细胞凋亡和ECM降解，表明乳酸通过H3K18la加重椎间盘退变，抑制该乳酸化修饰可减缓退变进程。CD248（又称Endosialin或TEM1）为含C型凝集素样结构域的单次跨膜糖蛋白，在组织重塑中发挥作用并与基质细胞增殖和迁移相关；GO分析显示CD248蛋白功能主要与发育过程、细胞增殖和ECM调控相关。ChIP-qPCR结果显示乳酸增加H3K18la在CD248启动子的富集，但转录组测序和qPCR显示乳酸抑制CD248 mRNA表达，与既往报道矛盾，促使研究人员假设H3K18la可能招募转录抑制因子。Co-IP/MS揭示H3K18la与SMARCA5和p53的关联；SMARCA5为具有核小体重定位活性的关键染色质重塑酶，通过水解ATP滑动核小体改变染色质结构和可及性；p53作为经典转录抑制因子，ChIP-WB显示其表达不受实验干预影响，而SMARCA5在外源性乳酸处理组和H3K18 WT细胞中富集显著增加；ChIP-reChIP-qPCR证实乳酸诱导的H3K18la招募SMARCA5至CD248启动子区域，解释了乳酸增加H3K18la启动子富集却抑制CD248转录的矛盾现象。SMARCA5敲低后CD248 mRNA恢复但蛋白表达不变，提示SMARCA5主要调控CD248转录而非蛋白稳定性；CHX追踪实验证实乳酸加速CD248蛋白降解；MG132逆转乳酸诱导的CD248降解并促进泛素化蛋白累积，H3K18R显著降低泛素化水平；UPP作为主要非溶酶体蛋白水解途径，调节细胞周期进程、DNA修复、生长和分化等关键细胞功能，研究人员结果表明H3K18la在高乳酸条件下通过UPP促进CD248蛋白降解，揭示了NP细胞退变中的双重调控机制：乳酸通过转录（SMARCA5介导）和翻译后（UPP依赖）修饰调控CD248表达。Hedgehog信号通路在脊椎动物胚胎发育和肿瘤发生中起关键作用，NP细胞起源于胚胎脊索，研究显示NP细胞的Sonic hedgehog信号在小鼠发育中控制其生长和分化；本研究揭示乳酸抑制Hh通路激活，而CD248-OE拮抗此抑制并促进下游效应因子GLI1激活；通过GANT61证实CD248通过Hh通路激活抑制NP细胞凋亡并增强ECM合成。研究局限性包括：未进行全面的LC-MS/MS乳酸化位点筛选而是基于文献选择五种商业抗体的已知位点；乳酸通过蛋白酶体途径促进CD248降解的具体分子机制有待进一步研究；6–8周龄幼年大鼠仍处于青春期前阶段，保留富含脊索细胞的NP，该穿刺模型不能完全重现成人IVDD的细胞组成或慢性自然病程。
研究结论翻译：综上所述，本研究证明退变椎间盘中乳酸水平升高诱导NP细胞组蛋白乳酸化修饰，H3K18被确定为特异性修饰位点。外源性乳酸补充进一步证实增加乳酸浓度增强NP细胞乳酸化，而糖酵解抑制剂2-DG有效抑制该修饰。研究人员进一步揭示H3K18la通过双重机制调控CD248表达：（1）在转录水平通过招募转录抑制因子SMARCA5抑制CD248 mRNA合成；（2）在蛋白质水平通过UPP促进CD248降解。结合转录组测序数据和现有文献，研究人员验证了CD248通过激活Hedgehog通路调控NP细胞凋亡和ECM合成。
