《International Journal of Genomics》：Single-Cell and Bulk Transcriptomic Profiling of Urothelial Carcinoma: Immunotherapy Associations and Functional Characterization of LY6E
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背景：将单细胞免疫图谱转化为bulk转录组生物标志物需要区分细胞状态信号与整体免疫丰度。研究人员评估了单细胞来源免疫模块在尿路上皮癌中的恢复能力与临床相关性，并探究LY6E作为功能验证候选基因的潜力。方法：研究人员分析了来自两个GSE223971样本的73,2
背景：将单细胞免疫图谱转化为bulk转录组生物标志物需要区分细胞状态信号与整体免疫丰度。研究人员评估了单细胞来源免疫模块在尿路上皮癌中的恢复能力与临床相关性，并探究LY6E作为功能验证候选基因的潜力。方法：研究人员分析了来自两个GSE223971样本的73,279个单细胞，包括8对匹配的CD45富集单细胞/bulk样本对及来自5例患者的6对更广泛制备样本对。免疫模块经过供体支持过滤、患者水平验证、谱系校正及与参考谱方法的比较。在GSE176307和IMvigor210中评估临床关联，并使用重复交叉验证评估IMvigor210中的增量预测。基于表达筛选及临床和免疫背景评估，优先选择LY6E在5637和J82细胞中进行敲低和回复实验。结果：39个注释状态中13个满足供体支持标准。4个模块通过初步转移筛选，尽管所有4个模块的95% bootstrap置信区间均包含零；11个可测试亚型均未满足谱系内特异性标准。仅Plasma通过跨制备模块筛选（患者水平Spearman rho = 0.900；精确p = 0.083），ProM恢复较弱（rho = 0.700）。在所选IMvigor210亚组中，其与完全缓解 versus 疾病进展的关联在免疫校正后减弱，加入Plasma未产生一致的预测改善。若干免疫评分在未校正GSE176307模型中与生存相关，但无支持的客观缓解关联。LY6E在TCGA-BLCA和GSE13507肿瘤中上调，但其与免疫治疗结局的关联在队列间存在差异。两条shRNA使LY6E转录本丰度降低64%–67%，降低两种细胞系的生长和迁移并增加凋亡。shRNA抗性构建体恢复了LY6E表达和克隆形成生长。结论：单细胞与bulk转录组整合恢复了Plasma相关丰度信号，但未建立亚型特异性或独立免疫治疗预测能力。LY6E在测试的膀胱癌细胞系中支持生长和存活，而其作为免疫治疗生物标志物的相关性仍未确立。
研究背景：膀胱癌是癌症发病和死亡的重要原因，临床病程和治疗反应差异显著。基因组学研究已将肌层浸润性尿路上皮癌分为生物学上不同的转录组，共识分子分型使这种异质性更易于跨队列比较。免疫检查点抑制可在晚期疾病中产生持久缓解，但仅少数患者获益。肿瘤外在因素如转化生长因子-β（TGF-β）驱动的免疫排斥可限制对程序性死亡配体1（PD-L1）阻断的反应，而组织和血液联合分析表明治疗结局不能由单一免疫测量捕获。因此，有用的转录组生物标志物必须提供超出其所测量广泛免疫背景的信息。单细胞RNA测序（scRNA-seq）提供了该背景的详细视图。膀胱癌研究已描述炎症性癌相关成纤维细胞、异质性上皮和免疫群体以及协调的多细胞生态系统。肿瘤相关免疫状态也已从尿液中恢复，提供了跨解剖连接区室的视图。在接受检查点治疗的尿路上皮癌中，bulk和单细胞数据的联合分析已将髓系程序与治疗耐药联系起来。这些研究扩展了疾病的细胞词汇，而大多数具有缓解和生存数据的队列仍仅以bulk表达谱形式可用。单细胞标记集可追踪其来源群体在bulk RNA中的丰度，但提供关于该谱系内变异的信息很少。其性能也可能随组织组成而变化。因此，评估这些评分需要匹配的细胞丰度测量、谱系内特异性测试以及跨制备评估。在临床队列中，相关问题是评分是否在整体免疫内容和其他可用协变量之外增加信息。研究人员在尿路上皮癌中使用精确匹配的scRNA-seq和bulk RNA谱、第二个具有匹配bulk数据的单细胞制备以及两个免疫检查点抑制剂队列评估了这些特性。状态标记在不参考临床结局的情况下选择，并通过重采样、患者水平标记重新推导、亲本谱系校正、替代评分规则和参考谱方法进行检查。临床关联与样本外预测分别评估。在平行分析中，采用不依赖结局的表达和上皮兼容性筛选，随后评估生存、外部表达和免疫背景证据以优先选择LY6E。然后通过敲低和回复实验测试其在膀胱癌模型中的细胞内在效应。
研究人员开展的研究及结论与意义：研究人员通过多队列设计将技术转移与临床评估分离，利用GSE223971作为唯一具有精确单细胞/bulk配对的技术基准，结合GSE176307和IMvigor210进行临床关联分析。研究发现，匹配的单细胞和bulk分析恢复广泛免疫群体信号比谱系内变异更一致。四个模块在8对CD45富集样本中方向一致，但不确定性宽；所有可测试亚型在亲本谱系校正后均未保持特异性，仅Plasma在更广泛制备中保留阳性模块水平结果。在IMvigor210中，Plasma与完全缓解 versus 疾病进展的未校正关联在免疫校正后减弱，重复交叉验证未显示一致的预测改善。LY6E分析显示，两种非重叠shRNA在5637和J82细胞中产生一致的生长、克隆形成和迁移降低以及凋亡增加，shRNA抗性LY6E构建体恢复了转录本丰度和克隆形成生长。研究意义在于，单细胞与bulk转录组整合恢复了Plasma相关免疫丰度信号，但未建立亚型特异性或独立免疫治疗预测能力；LY6E在测试的膀胱癌细胞系中支持生长和存活，而其作为免疫治疗生物标志物的相关性仍未确立。
关键技术方法：研究人员主要采用以下技术方法：（1）单细胞RNA测序数据分析，使用Seurat 5.4.0处理GSE223971 deposited对象，保留原始注释和UMAP坐标，进行供体贡献评估；（2）bulk表达谱预处理与模块评分，采用z-mean、rank-mean和mean-log三种评分规则；（3）匹配单细胞到bulk转移基准分析，使用Spearman相关和bootstrap重采样；（4）嵌套标记重新推导与稳定性分析，采用留一患者交叉验证和Jaccard重叠评估；（5）亲本谱系特异性分析，比较状态评分与亲本模块评分的差异和残差；（6）跨制备可转移性分析，使用患者聚类bootstrap和精确置换检验；（7）参考谱非负最小二乘（NNLS）和ProM方法比较；（8）临床关联和生存分析，使用逻辑回归和Cox比例风险回归；（9）重复交叉验证评估增量预测；（10）细胞实验，包括瞬时LY6E敲低和回复、RT-qPCR、CCK-8测定、 colony formation assay、Transwell迁移测定和Annexin V-FITC/碘化丙啶凋亡测定。样本队列来源包括GSE223971、GSE176307、IMvigor210、GSE176178、GSE244895、GSE199471、GSE145281、GSE269877、TCGA-BLCA和GSE13507。
研究结果：
3.1 多队列设计将技术转移与临床评估分离：GSE223971是唯一具有精确单细胞/bulk配对的资源，而缓解、生存、纵向采样和肿瘤突变负荷分布在其他队列中。CD45富集和更广泛GSE223971制备分别包含43,827和29,452个细胞，但配对分析基于8个独立CD45富集对和来自5例患者的6个更广泛制备样本。两个制备在免疫、上皮和基质区室的代表性上也存在差异。临床类别不平衡在两个治疗分析中均明显：GSE176307包含89例患者中16例客观缓解者，IMvigor210亚组包含25例完全缓解（CR）和167例疾病进展（PD）病例。精确配对仅用于技术基准，而非临床队列。
3.2 供体感知质量审查保留13个状态用于转移基准：CD45富集图谱解析了淋巴样、髓样、树突状、基质和Plasma区室。 eligible minor states分布在UMAP上而非集中在一个区域。标记点图显示进入模块推导的状态具有独特表达模式。样本水平组成在各标本间差异显著。供体贡献矩阵识别了跨患者支持的状态和由较小子集供体主导的状态。应用最小细胞数、最小患者数和最大供体份额规则后，39个状态中保留13个。这13个状态而非所有deposited注释构成预定义转移集。
3.3 更广泛制备改变了细胞组成和状态可检测性：第二个GSE223971对象包含更大的基质成分和与CD45富集图谱不同的上皮代表性。仅一部分CD45来源免疫状态可在此更广泛混合物中恢复。样本水平组成确认添加的区室不均匀表示而非以恒定比例引入。中位谱系分数量化了这种组成变化。样本到患者映射覆盖来自10例患者的13个单细胞样本，包括重复样本。状态分数和检测计数显示若干预定义状态在个别样本中缺失。仅来自5例患者的6个样本满足精确单细胞/bulk匹配规则，需要在后续分析中进行患者聚集和精确患者水平推断。
3.4 亲本谱系校正未支持亚型特异性恢复：与all-captured-cell分数的相关性通常强于与within-parent分数的相关性。减去亲本谱系评分或对状态评分进行残差化未一致恢复within-parent一致性。匹配的DC2和DC1示例显示bulk评分与all-captured-cell分数之间一致性有限。其在捕获细胞池中的贡献在各患者间变化。初始丰度筛选保留的三个可评估亚型低于特异性阈值；Plasma作为单例谱系不可评估。T-CD8_GZMK、T-CD8_FGFBP2和B_CD27在8对中与亲本谱系评分完全秩相关（每个rho = 1.000）。因此，配对水平视图支持广泛谱系相关排序但不支持预期亚型的独立恢复。当转移、嵌套重新推导和特异性一起考虑时，11个非单例亚型均未满足特异性标准。DC1: DC2平衡同样未在bulk RNA中可靠重现。
3.5 四个状态模块满足初始转移标准尽管不确定性宽：在13个 eligible states中，最强的20基因z-mean相关性见于T-CD8_GZMK（rho = 0.714）、Plasma（rho = 0.690）、T-CD8_FGFBP2（rho = 0.690）和B_CD27（rho = 0.667）。这四个满足预定义筛选标准，但其95% bootstrap区间下限分别为?0.105、?0.037、?0.151和?0.215。因此，尽管80%筛选区间下限为正，每个推断区间均包含零。转移方向在z-mean、rank-mean和mean-log评分下仍保持一致。配对水平秩误差随状态和患者变化，无单一标本解释所有四个信号。留一配对最小值范围为0.500至0.571，而状态大小和供体支持与转移性能无简单关系。Plasma、T-CD8_GZMK、T-CD8_FGFBP2和B_CD27的匹配图显示8例患者间单调但不完美排序。
3.6 标记成员在嵌套重新推导中保持稳定：模块长度分析显示小签名对保留基因数和评分规则更敏感。在从标记推导和bulk标准化中排除留出患者后，嵌套相关性对T-CD8_GZMK（rho = 0.571）、Plasma（rho = 0.690）、T-CD8_FGFBP2（rho = 0.690）和B_CD27（rho = 0.643）保持为正。Plasma与其全数据标记集的Jaccard重叠中位数最高（1.000），其次是T-CD8_FGFBP2（0.905）、B_CD27（0.861）和T-CD8_GZMK（0.779）。跨折基因水平复发产生相同的稳定性总体排序。使用20个标记时，所有四个状态在三种评分规则下仍受支持，其留出预测保持正序。
3.7 Plasma是细胞混合物改变后唯一保留的模块：CD45富集对中的转移性能不能可靠预测更广泛制备中的性能。样本水平相关性对若干状态为正，包括Plasma（rho = 0.714）和B_CD27（rho = 0.543）。聚类bootstrap区间宽，且同一患者重复样本聚集后估计值改变。在患者水平，Plasma达到rho = 0.900，而B_CD27、T-CD8_GZMK和T-CD8_FGFBP2分别达到0.400、0.300和?0.500。在所有120个患者标签置换中，观察到的Plasma相关性给出精确双侧p值为0.083。Plasma是唯一满足患者水平探索性转移标准的模块。
3.8 转移估计对评分和参考方法保持敏感：没有方法在所有状态和制备中统一排名第一。当模块评分与基于谱的估计比较时，状态间范围扩大，方法排名在CD45富集和更广泛混合物之间改变。ProM combined在CD45富集对中估计Plasma rho = 0.786，在跨制备集中患者聚集后rho = 0.700，精确p值为0.233。Profile-only和combined ProM对某些状态一致但其他状态分歧。使用固定CD45参考，Plasma profile-NNLS相关性在8个发现对中为0.627，在5个更广泛制备患者中为0.975。Plasma是唯一在两种技术设置中z-mean模块和profile-NNLS正一致的状態。可估计状态数因方法而异。
3.9 GSE176307将预后免疫背景与治疗缓解关联分离：四个初始转移状态在GSE176307中均未显示与客观缓解的统计学支持关联。每标准差未校正比值比为T-CD8_GZMK 1.242、Plasma 1.146、T-CD8_FGFBP2 1.261和B_CD27 1.132，所有p值高于0.40。对总免疫表达和亲本谱系的校正未产生稳定的独立效应，Plasma分布在缓解组间广泛重叠。生存结果与缓解结果不同。未校正总生存风险比为T-CD8_GZMK 0.715（95% CI 0.550–0.928；FDR = 0.040）、Plasma 0.740（95% CI 0.575–0.952；FDR = 0.042）和T-CD8_FGFBP2 0.697（95% CI 0.534–0.910；FDR = 0.040）；B_CD27方向相似（HR = 0.771，95% CI 0.600–0.991）但FDR为0.053。无进展生存关联较弱。缓解效应估计在各校正层级间偏移，筛选评分彼此相关并与总免疫表达相关；Plasma–总免疫相关性为rho = 0.757。排序患者显示和比例风险诊断进一步表征了缓解和生存分析。当两个结局一起绘制时，有利生存方向不意味着缓解区分。
3.10 Plasma未在IMvigor210中一致改善CR versus PD区分：Plasma对CR versus PD的未校正比值比为1.597（95% CI 1.073–2.376；p = 0.021）。对总免疫表达的校正将估计值降至1.286（95% CI 0.804–2.058；p = 0.294；delta AUC = ?0.003），免疫加肿瘤突变负荷模型给出比值比1.325（95% CI 0.684–2.567；p = 0.404）。重复交叉验证显示无一致预测改善。无肿瘤突变负荷时，加入Plasma将AUC从0.672降至0.650，而平均精度从0.214升至0.227；Brier评分从0.1112略升至0.1117。在150例有肿瘤突变负荷的完整病例中，AUC从0.791降至0.783，平均精度从0.531降至0.492，而Brier评分从0.0918升至0.0931。观察到的CR频率跨概率五分位数未显示改善校准。加入Plasma产生小的、双向的患者水平概率变化。Plasma与总免疫表达相关（rho = 0.566）但与肿瘤突变负荷不相关（rho = ?0.042），与广泛免疫背景关联而非独立预测一致。
3.11 次要临床关联未通过多重性校正：队列×程序矩阵包含许多不可用组合，因为数据集测量不同的生物区室和终点。在35个有可用p值的测试中，仅一个名义上低于0.05，且在校正后均未保持显著。GSE176178中基线BCG缓解AUC均低于0.50。Effector_T_NK在GSE244895中增加（中位配对变化 = 0.058；名义p = 0.042），但校正后p值为0.246。GSE199471中无复发相关程序变化显著。外周血细胞分数按缓解组分别比较。在10例患者外周血队列中，Bcell_plasma和APC_effector_minus_IL8各达到AUC 0.88，但两者精确p值均为0.056，校正后p值为0.306。GSE269877贡献细胞类型表达和基因覆盖信息而非可比较的模块水平结局测试。
3.12 表达和临床证据优先选择LY6E进行功能测试：初始表达和上皮筛选（不包括临床结局）将起始集减少至429个基因。P4HB和LY6E是唯一满足所有七个统计和生物学标准的候选基因；发表重叠审查随后排除P4HB并保留LY6E。在TCGA-BLCA中，LY6E在407例原发肿瘤中高于19例癌旁正常组织（log2 fold change = 1.017；FDR = 0.026）。19个匹配对显示肿瘤减正常中位差异为0.629（p = 0.038）。GSE13507独立显示165例肿瘤、58例周围正常黏膜和9例良性对照中肿瘤表达更高（肿瘤减正常中位差异 = 0.370；p = 0.00375）。LY6E表达占据跨制备UMAP的上皮和免疫区域。检测在15个注释谱系间变化；在上皮细胞中，42.9%表达LY6E，平均log归一化表达为0.800。上皮和免疫群体均贡献于观察到的LY6E表达模式。GSE13507中位分割曲线不显著（log-rank p = 0.307）。连续校正TCGA模型给出每标准差风险比：总生存1.170（95% CI 1.010–1.356；p = 0.036）和无进展间期1.188（95% CI 1.020–1.385；p = 0.027）。在GSE13507中，未校正总生存风险比为1.289（p = 0.050），而校正估计为1.197（p = 0.145）；GSE176307估计反向且不显著。LY6E与七个免疫程序中六个相关，最强与APC/MHC-II（rho = 0.443）。其GSE176307缓解关联在免疫校正后减弱，而IMvigor210中CR versus PD关联方向相反。肿瘤上调和上皮表达支持LY6E的功能测试，尽管其临床关联在队列间变化。
3.13 LY6E敲低降低膀胱癌细胞生长和迁移并增加凋亡：在筛选的四株膀胱癌细胞系中，相对LY6E转录本丰度在5637（1.987 ± 0.105）和J82（2.443 ± 0.493）细胞中最高，相比T24（1.000 ± 0.155）和UM-UC-3（0.647 ± 0.078）；因此5637和J82被推进（n = 3独立实验）。在5637细胞中，sh-LY6E-1和sh-LY6E-2将相对表达从1.000 ± 0.070分别降至0.363 ± 0.025和0.353 ± 0.038（均p < 0.001）。J82中对应值为1.003 ± 0.194、0.343 ± 0.042和0.330 ± 0.078（两个敲低组p < 0.01），代表两个模型中约64%–67%的降低。两种shRNA在5637和J82细胞中产生比sh-NC逐渐降低的CCK-8吸光度。在96 h，5637细胞中sh-NC平均OD450值为2.973 ± 0.190，sh-LY6E-1为1.363 ± 0.083，sh-LY6E-2为1.280 ± 0.046；J82对应值为3.057 ± 0.191、1.260 ± 0.098和1.517 ± 0.092。长期克隆形成生长显示相同方向。5637 sh-NC细胞中克隆阳性面积从46.463% ± 8.118%降至sh-LY6E-1和sh-LY6E-2后的6.863% ± 0.616%和12.360% ± 4.035%。在J82中，从49.447% ± 5.939%降至12.493% ± 3.552%和4.260% ± 1.784%（所有敲低比较p < 0.001）。LY6E敲低还降低两个模型中的Transwell迁移。5637 sh-NC细胞中迁移面积从51.527% ± 4.997%降至8.323% ± 1.351%和11.797% ± 4.842%，J82 sh-NC细胞中从46.053% ± 5.151%降至9.843% ± 1.725%和15.917% ± 2.226%（均p < 0.001）。Annexin V/碘化丙啶流式细胞术显示凋亡 reciprocal 增加：5637细胞中凋亡分数从1.287% ± 0.677%升至20.837% ± 2.071%和26.020% ± 2.814%，J82细胞中从3.180% ± 0.964%升至42.837% ± 3.535%和45.617% ± 4.774%（均p < 0.001）。因此，两个独立LY6E靶向构建体在两个测试细胞系中对生长、迁移和凋亡产生一致效应。
3.14 LY6E重新表达在敲低后恢复克隆形成生长：使用shRNA抗性LY6E构建体测试克隆形成表型是否依赖LY6E耗竭。在5637细胞中，相对LY6E表达在sh-NC + Vector中为1.000 ± 0.184，sh-LY6E-1 + Vector中为0.280 ± 0.066，sh-LY6E-1 + LY6E-rescue中为0.973 ± 0.035（敲低 versus 对照或回复p < 0.001）。J82对应值为1.000 ± 0.108、0.353 ± 0.023和0.980 ± 0.180（p < 0.01）。代表性克隆形成图像显示5637和J82细胞中sh-LY6E-1后克隆形成生长丧失及LY6E重新表达后恢复。在5637中，克隆阳性面积在sh-NC + Vector中为35.123% ± 6.005%，sh-LY6E-1 + Vector中为10.540% ± 2.446%，回复后为32.310% ± 2.781%（敲低 versus 回复，p < 0.01）。J82值分别为50.737% ± 7.278%、9.610% ± 2.477%和52.753% ± 2.188%（敲低 versus 回复，p < 0.001）。转录本丰度和克隆形成生长的恢复支持LY6E在两个细胞系中对集落形成的贡献。
讨论部分总结：匹配的单细胞和bulk分析恢复广泛免疫群体信号比谱系内变异更一致。其有限的特异性和对组织组成的敏感性有助于解释为何技术转移未转化为缓解预测的一致增益。四个模块在8对CD45富集样本中方向一致，但不确定性宽；所有可测试亚型在亲本谱系校正后均未保持特异性，仅Plasma在更广泛制备中保留阳性模块水平结果。LY6E单独评估：其耗竭在两个膀胱癌细胞系中产生一致表型，shRNA抗性构建体恢复了克隆形成生长。亲本谱系分析是該解释的核心。高匹配相关性可能源于模块追踪广泛谱系大小而非其内部组成。这在CD8和B细胞模块中尤为明显，其状态评分与相应亲本评分几乎不可区分。模拟研究表明细胞状态粒度和参考构建实质性影响去卷积性能，多测定基准在转录组估计与正交细胞丰度测量比较时得出类似结论。可用方法也编码不同假设：CIBERSORT使用基于回归的枚举，而EPIC明确容纳免疫和恶性区室。MCP-counter和xCell使用标记或富集表示，而MuSiC、SCDC和CIBERSORTx以不同方式整合单细胞参考信息。研究人员的经验比较限于模块评分、profile-NNLS和ProM。在此集合内，信号表示的差异改变了与细胞丰度的估计一致性。CD8和B细胞评分与亲本谱系的紧密耦合表明其大部分bulk变异反映谱系丰度。Plasma在若干方面不同于其他转移状态。其标记在留一患者重新推导中高度复发，正关联在三种模块评分方法中持续存在，profile-NNLS在两种技术设置中一致。免疫球蛋白丰富转录可能使该群体比密切相关的T细胞状态更容易从背景bulk表达中区分。该转录信号的生物学意义也取决于细胞组织。B细胞丰富三级淋巴结构与黑色素瘤中检查点缓解和生存相关，独立分析同样将B细胞组织与治疗缓解联系。此类结构包含多个B细胞状态并与T细胞、树突状细胞和基质区室相互作用。需要空间测量将Plasma评分与这些组织化免疫结构联系。更广泛制备分析检查了对改变细胞混合物的稳健性而非提供传统外部验证。添加上皮和基质材料改变了单细胞分数的分母和bulk样本的转录背景。Plasma保留强患者水平模块相关性，但仅5例独立患者可用，精确推断因表示而异：模块结果满足预定义探索性标准，而ProM未满足。此差异表明信号方向可重现，但其幅度和推断支持在参考模型或组织制备间不一致。Plasma与保留IMvigor210亚组中CR versus PD的关联在总免疫表达校正后减弱。在重复交叉验证中，加入Plasma在两个模型比较中降低ROC AUC并增加Brier误差。无肿瘤突变负荷时平均精度的微小增加未在肿瘤突变负荷模型中保留，因此指标不支持一致增益。GSE176307也将预后与治疗缓解分离；若干免疫评分在未校正模型中与较长生存相关而未显示客观缓解区分。由于生存模型未校正，患者间临床差异可能部分解释这些关联。次要分析检查了BCG治疗非肌层浸润性疾病、纵向组织样本、外周血和额外单细胞队列中的单独预定义程序。无临床关联在其分析家族内通过校正。程序定义、生物区室和终点的差异限制了这些数据集间的比较；结果描述不同设置中的相关免疫过程而非主要状态模块的复制。LY6E分析解决了一个互补问题：在上皮细胞中表达的肿瘤上调基因是否贡献于癌细胞表型。选择标准倾向于具有肿瘤相关表达、上皮兼容性、外部表达支持和不良临床方向的可扰动基因。在5637和J82细胞中，两种非重叠shRNA产生短期生长、集落形成和迁移的一致降低同时增加凋亡。shRNA抗性LY6E构建体的重新表达在sh-LY6E-1后恢复了转录本丰度和克隆形成生长，加强了LY6E耗竭与集落表型之间的联系。实验工作已独立将肿瘤细胞LY6E与受损抗肿瘤T细胞反应联系，胃癌模型提供增殖和转移效应的先例，其表面定位支持实体瘤中抗体-药物偶联物开发。敲低和回复发现将此功能证据扩展到两个膀胱癌细胞系。临床解释不太直接。GSE13507生存曲线和校正估计不显著，LY6E在免疫和上皮细胞中均表达，IMvigor210和GSE176307在不同缓解定义下显示相反关联方向。这些差异可能反映细胞组成或队列背景，需要在共同终点下评估。生存证据也贡献于候选选择，因此不是预指定基因的独立评估。主要限制是独立匹配标本数量。8对CD45富集产生宽bootstrap区间，5例跨制备患者产生粗略精确置换分布。两个单细胞制备无共享供体，但参考和配对bulk谱来自同一研究。状态资格在留一患者标记检查前固定，因此这些检查未独立验证整个选择程序。其观察分数取决于组织解离、富集和细胞恢复；deposited注释、环境RNA、双细胞和供体特异性表达可能传播到模块中。IMvigor210分析省略部分缓解、疾病稳定和不可评估病例，因此不能推广到完整试验队列中的客观缓解。在临床队列中，少数结局阳性病例、相关免疫预测因子和不完整肿瘤突变负荷数据限制多变量精度。预测性能通过内部交叉验证评估；具有相同终点和预处理管线的外部验证仍必要。空间定位、免疫球蛋白克隆性、蛋白表达和组织学Plasma细胞密度不可用。细胞实验限于两个膀胱癌模型。每个条件由三个独立实验代表，扰动是瞬时的，敲低在转录本而非蛋白水平验证。回复实验解决克隆形成生长；迁移和凋亡仅在敲低后评估。未包括正常尿路上皮模型、直接通路测定、动物实验或患者来源验证。这些实验支持对测量表型的体外贡献但留下肿瘤选择性和下游信号未解决。它们未测试免疫细胞相互作用或检查点抑制剂缓解。来自同标本的匹配bulk RNA、未分选单细胞或单核谱、组织学和正交细胞密度测量可阐明Plasma相关转录如何与细胞丰度和空间组织相关。对于LY6E，跨额外表型和尿路上皮模型的蛋白水平扰动和回复将有助于区分对细胞适应性的普遍效应与更特异功能。
研究结论翻译：匹配的单细胞和bulk转录组在尿路上皮癌中恢复了Plasma相关免疫丰度，但该评分在IMvigor210中未提供CR versus PD预测的一致改善。LY6E敲低和回复支持其在测试的膀胱癌细胞系中对克隆形成生长的贡献。
