《Molecular Ecology Resources》：Non-Linear Epigenetic Aging Clocks: A Case Study in Atlantic Halibut (Hippoglossus hippoglossus)
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年龄信息在种群生物学中至关重要。在渔业管理中，稳健有效的资源评估模型依赖于对繁殖力、存活率及其他生活史特征的准确估算，而这些特征多随年龄变化。因此，可靠的年龄测定对于理解种群动态、支撑科学管理与保护决策不可或缺。鱼类年龄通常通过计数耳石生长轮来估算，该方法耗时
年龄信息在种群生物学中至关重要。在渔业管理中，稳健有效的资源评估模型依赖于对繁殖力、存活率及其他生活史特征的准确估算，而这些特征多随年龄变化。因此，可靠的年龄测定对于理解种群动态、支撑科学管理与保护决策不可或缺。鱼类年龄通常通过计数耳石生长轮来估算，该方法耗时耗力，需进行致死采样并依赖高度专业化的物种特异性经验。为补充现有的基于耳石的年龄鉴定工作，研究人员开发了一种基于DNA甲基化的大西洋庸鲽年龄鉴定方法。研究人员对106尾野生捕获个体进行了全基因组甲基化测序，这些个体的耳石年龄估计值介于4至29岁之间。利用弹性网络回归和广义加性模型将CpG位点作为候选年龄预测因子进行评估，后者能够纳入CpG甲基化与年龄之间的非线性关系。弹性网络回归所鉴定的年龄相关位点主要位于可能的亚端粒区和内含子区域。重要的是，数据集中纳入更年长个体导致所选CpG位点发生变化，但其所在染色体区域并未改变，这表明与年龄相关的是染色体上的甲基化模式，而非特定CpG位点。按性别分离的广义加性模型表现优于弹性网络回归，其每年龄中位数误差最低（MAE < 1年，即低于大西洋庸鲽平均寿命的2%）。该表观遗传时钟校准框架可实现稳健的、系统特异性的时钟校准，可用于其他受开发和保护关注的非模式生物。
研究背景与目的
年龄信息是种群生物学的基础参数，在渔业管理中，准确的年龄数据对于构建基于年龄的资源评估模型、设定捕捞目标以及评估种群可持续性至关重要。传统的鱼类年龄鉴定主要依赖对耳石生长轮的计数，该方法不仅劳动强度大、耗时长，而且需要进行致死采样，并依赖高度专业化的物种特异性经验。尽管耳石判读被认为是鱼类年龄估测的最佳方法之一，但其高昂的成本和时间消耗使其难以满足大规模种群评估所需的海量年龄数据需求。
近年来，表观遗传衰老时钟作为一种新兴的替代方法在渔业科学中迅速兴起。该方法基于DNA甲基化——一种不改变碱基序列但可影响基因表达的化学修饰。研究表明，甲基化水平可随年龄、性别、成熟状态及环境条件而变化。然而，现有的大多数鱼类表观遗传时钟研究主要采用靶向测序或线性回归模型，忽略了甲基化与年龄之间可能存在的非线性关系。此外，针对长寿鱼类的表观遗传时钟校准仍面临挑战，尤其是在考虑性别差异和非线性效应方面。
为此，本研究以大西洋庸鲽（Hippoglossus hippoglossus）为研究对象，旨在开发一种基于全基因组甲基化测序的非线性表观遗传衰老时钟，以补充现有的耳石判读方法，并探索非线性模型在提高年龄预测精度方面的潜力。
研究方法与技术路线
研究人员从一项正在进行的亲缘关系标记重捕研究中选取了106尾野生大西洋庸鲽个体，采集其鳍条组织用于DNA提取，同时获取耳石用于传统年龄鉴定。所有个体均来自加拿大渔业与海洋部组织的生态系统调查和商业延绳钓调查，地理范围涵盖斯科舍陆架和南部大浅滩。研究首先通过全基因组甲基化测序获得每个个体的甲基化图谱，随后利用弹性网络回归从超过11000个共享CpG位点中筛选出与年龄和体长相关的候选位点。在此基础上，研究人员进一步采用广义加性模型拟合CpG甲基化与年龄之间的非线性关系，并通过逐步筛选确定最终用于年龄预测的最优CpG组合。模型训练与验证采用分层随机抽样策略，以80%个体为训练集、20%为测试集，重复100次以降低单次划分带来的偏差。
研究结果
3.1 CpG位点的鉴定
通过对106个个体的全基因组甲基化测序，共获得超过75亿条读段，平均每个个体约7130万条读段。经比对和过滤后，共识别出超过500万个CpG位点，其中20604个位点在所有个体中共享。去除未定位的支架、反转区、性别决定区和线粒体区域后，最终保留11832个CpG位点用于后续分析。
3.2 弹性网络回归模型估算表观遗传年龄
弹性网络回归在100次重复中每次保留8至37个CpG位点，共产生271个候选位点。其中66个位点在超过20次重复中被选中。当以体长为响应变量时，额外鉴定出92个位点。虽然年龄相关和体长相关的具体CpG位点不同，但它们往往位于相同的染色体区域。值得注意的是，当排除年龄大于15岁的个体后，弹性网络回归选中的位点发生了变化，但这些位点仍与全年龄范围分析中选中的位点共享相同的基因组区域。
3.3 CpG位点的区域分布与新颖性
选中的CpG位点遍布整个基因组，但在多个染色体的八个区域出现了高密度簇集（n>4）。其中六个区域位于染色体的起始或末端，经比对确认属于亚端粒区；另外两个区域则位于注释的内含子区域。这些结果表明，大西洋庸鲽的年龄相关甲基化信号主要集中在非编码调控区域。
3.4 模型比较
在弹性网络回归模型中，合并性别模型与分性别模型的性能相近，但分性别模型在年龄范围扩大时表现出更优的性能，且训练集与测试集之间的相关性差距更窄。然而，弹性网络模型倾向于低估年轻个体的年龄并高估老年个体的年龄，表明存在系统性偏差。相比之下，广义加性模型的表现显著优于弹性网络回归：合并数据的广义加性模型的中位数绝对误差为1.28年，相关性达到0.936，且不存在年龄依赖性偏差。分性别的广义加性模型进一步降低了误差，中位数绝对误差仅为0.90-0.92年，相关性提升至0.954-0.966。值得注意的是，雌性和雄性广义加性模型选中的CpG位点各不相同，但它们均与合并性别模型中的位点共享相同的基因组区域，进一步证实了染色体区域而非特定位点与年龄的相关性。
讨论与结论
本研究表明，表观遗传时钟的成功校准需要充分考虑物种的生活史特征和系统特异性因素。广义加性模型相比弹性网络回归在年龄预测精度上具有明显优势，特别是在消除年龄依赖性偏差方面效果显著。这一发现对于长寿鱼类的年龄鉴定尤为重要，因为随着年龄增长，甲基化与年龄之间的关系往往趋于非线性，甚至接近渐近线。此外，研究发现重要的年龄相关CpG位点倾向于聚集在亚端粒区和内含子区域，且随着样本年龄范围的扩大，选中的位点会发生变化但区域保持稳定，这暗示着染色体区域的甲基化模式而非单个CpG位点是更稳定的年龄预测标志。研究还发现，大西洋庸鲽并不存在像哺乳动物那样广泛保守的通用年龄相关CpG位点，表明鱼类可能缺乏跨物种保守的表观遗传衰老标志。因此，针对新物种或新种群的表观遗传时钟开发必须进行严格的物种特异性校准。本研究提出的校准框架为长寿和非模式生物，特别是那些受开发压力或处于保护关注下的物种，提供了建立非线性表观遗传时钟的有效范例。该时钟覆盖了4至29岁的年龄范围，涵盖了西北大西洋大西洋庸鲽资源评估中最常见的个体年龄区间，具有良好的实际应用价值。
