《Plant Physiology and Biochemistry》：Coupled RNA editing and splicing within plant chloroplasts by the MORFs-CFM2 interaction module
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高等植物叶绿体基因表达依赖于转录后RNA编辑、RNA剪接、5'和3'端修剪以及顺反子间切割等精确调控。其中，RNA剪接和RNA编辑是严格决定植物生存能力、叶绿体生物发生和光合效率的两个关键步骤。RNA剪接是一种必需的酯交换反应，从前体mRNA中去除内含子并连接
高等植物叶绿体基因表达依赖于转录后RNA编辑、RNA剪接、5'和3'端修剪以及顺反子间切割等精确调控。其中，RNA剪接和RNA编辑是严格决定植物生存能力、叶绿体生物发生和光合效率的两个关键步骤。RNA剪接是一种必需的酯交换反应，从前体mRNA中去除内含子并连接外显子以产生成熟mRNA。在叶绿体中，剪接依赖于核编码的蛋白辅因子，包括含有叶绿体RNA剪接和核糖体成熟（CRM）结构域的蛋白。CFM2（CRM Family Member 2）对多种植物（包括玉米（Zea mays）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）和水稻（Oryza sativa））中特定叶绿体I类和II类内含子的切除至关重要。因此，CFM2的缺失会损害内含子去除，导致叶绿体发育异常等表型缺陷。叶绿体RNA编辑涉及器官RNA转录本编码区和非编码区内特定的胞嘧啶到尿苷（C-to-U）变化。这些编辑创建起始/终止密码子、纠正氨基酸变化并维持有效的RNA二级结构。因此，编辑需要由多种蛋白组成的复合体，统称为编辑体（editosome），主要由位点特异性五肽重复蛋白（PPRs）、器官RNA识别基序蛋白（ORRMs）、器官锌指蛋白（OZs）、原卟啉原氧化酶1（PPO1）和多重器官RNA编辑因子（MORFs，也称为RIPs）组成。关键的是，MORF蛋白作为该机器的辅助组分发挥作用。特别是MORF2和MORF9紧密关联形成异二聚体或多聚体编辑体支架，将靶标特异性PPRs和其他辅助因子招募到正确的编辑位点。目前，叶绿体RNA编辑与剪接之间的关系受到越来越多关注，因为越来越多的研究发现编辑因子的缺失可同时影响内含子剪接。例如，水稻编辑因子YLWS、SSA1、WSP1/OsMORF2和OsMORF9已被证明同时影响叶绿体转录本的RNA编辑和剪接。此外，拟南芥和玉米中的编辑因子PPR647、PDM1、ISE2、AEF1和OTP70同时影响RNA编辑和剪接。尽管这些遗传学证据表明编辑与剪接之间存在联系，但这两个过程如何连接的分子细节仍不清楚。本研究旨在探究RNA编辑与剪接之间的交叉对话是否由CFM2（一种已知的剪接因子，此前未报道在RNA编辑中具有功能）与MORF编辑体组分MORF2和MORF9之间的直接蛋白-蛋白互作所介导。通过免疫沉淀-质谱联用、双分子荧光互补和突变分析在拟南芥和水稻中的实证研究，该研究首次证明RNA编辑和剪接通过叶绿体MORF2/MORF9编辑体核心与CFM2剪接因子之间的直接互作在物理上耦联。其次，耦联的编辑-剪接机制存在于单子叶和双子叶植物的叶绿体中。因此，研究人员提出MORF编辑体锚定剪接机器以实现重要叶绿体转录本的同步高效成熟。
研究背景方面，高等植物叶绿体基因表达依赖于转录后RNA编辑、RNA剪接、5'和3'端修剪以及顺反子间切割等精确调控过程，其中RNA剪接和RNA编辑是严格决定植物生存能力、叶绿体生物发生和光合效率的两个关键步骤。RNA剪接是一种必需的酯交换反应，从前体mRNA中去除内含子并连接外显子以产生成熟mRNA，在叶绿体中依赖于核编码的蛋白辅因子，包括含有叶绿体RNA剪接和核糖体成熟（CRM）结构域的蛋白。CFM2（CRM Family Member 2）对多种植物中特定叶绿体I类和II类内含子的切除至关重要，其缺失会损害内含子去除，导致叶绿体发育异常等表型缺陷。叶绿体RNA编辑涉及特定的胞嘧啶到尿苷（C-to-U）变化，需要由位点特异性五肽重复蛋白（PPRs）、器官RNA识别基序蛋白（ORRMs）、器官锌指蛋白（OZs）、原卟啉原氧化酶1（PPO1）和多重器官RNA编辑因子（MORFs）组成的编辑体复合体。MORF2和MORF9紧密关联形成异二聚体或多聚体编辑体支架，招募靶标特异性PPRs和其他辅助因子到正确编辑位点。目前越来越多的研究发现编辑因子的缺失可同时影响内含子剪接，例如水稻编辑因子YLWS、SSA1、WSP1/OsMORF2和OsMORF9以及拟南芥和玉米中的PPR647、PDM1、ISE2、AEF1和OTP70均被证明同时影响RNA编辑和剪接。尽管存在这些遗传学证据，但编辑与剪接之间连接的分子细节仍不清楚。本研究旨在探究RNA编辑与剪接之间的交叉对话是否由CFM2与MORF2/MORF9之间的直接蛋白-蛋白互作所介导。研究人员通过免疫沉淀-质谱联用（IP-MS）、双分子荧光互补（BiFC）和突变分析在拟南芥和水稻中证明RNA编辑和剪接通过叶绿体MORF2/MORF9编辑体核心与CFM2剪接因子之间的直接互作在物理上耦联，且该耦联机制存在于单子叶和双子叶植物叶绿体中，提出MORF编辑体锚定剪接机器以实现重要叶绿体转录本的同步高效成熟。关键技术方法方面，研究人员采用免疫沉淀偶联LC-MS/MS（IP-MS）鉴定MORF编辑体互作蛋白，利用T-DNA插入突变体和CRISPR/Cas9基因编辑水稻突变体进行遗传分析，通过RT-PCR和Sanger测序分析RNA剪接效率与编辑效率，采用双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交（Y2H）验证蛋白互作，并通过亚细胞定位和组织特异性GUS染色分析CFM2的表达模式。研究结果方面，通过IP-MS鉴定与MORF编辑体互作的候选叶绿体编辑因子：利用表达MYC标签MORF2、MORF9和PDM1的转基因拟南芥进行IP-MS，以不参与RNA编辑的ECB1作为阴性对照消除背景信号，发现93个蛋白与MORF2和MORF9均互作，18个蛋白为三个诱饵共有的高置信度编辑体组分，从中选择8个蛋白（SVR11、P2Y、DRT112、CPHSC70-2、PTAC16、RPL12-A、FBA2和CFM2）进一步验证。八个候选蛋白的突变体分析：从ABRC获取T-DNA插入突变体，RT-qPCR确认除svr11外各突变体转录本水平降低，大多数突变体在标准长日照条件下无明显形态缺陷，但fba2表现矮化生长，cfm2表现白化致死表型。cfm2突变体的叶绿体RNA编辑缺陷：RT-PCR产物直接测序显示ndhD-2位点C-to-U编辑能力仅在cfm2突变体中丧失，对34个已知叶绿体位点的测序显示ndhD-2、ndhB-467、ndhB-586、ndhB-1255、petL-5和rpl23-89位点编辑几乎丧失，16个位点编辑显著降低且这些位点在morf2和morf9突变体中同样缺陷，表明CFM2是大部分MORF依赖编辑位点高效编辑所必需的。水稻CFM2同源物为叶绿体RNA编辑所必需：通过CRISPR/Cas9构建水稻oscfm2敲除突变体，表现白化表型，ndhA-473位点编辑丧失，ndhA-2057和rps14-80位点编辑降低约60%，表明CFM2在叶绿体RNA编辑中的功能在双子叶和单子叶植物中保守。CFM2的表达模式与亚细胞定位：35S:CFM2-GFP在烟草叶片瞬时表达显示GFP信号与叶绿素自发荧光共定位，确认CFM2靶向叶绿体；RT-qPCR显示CFM2在叶片和花中表达最高，根中极低；ProCFM2:GUS转基因植株组织化学染色显示在子叶、莲座叶、茎生叶和花等光合组织中强GUS活性，根和角果中极少。CFM2与MORF2和MORF9直接关联：BiFC实验显示CFM2-nYFP与MORF2-cYFP或MORF9-cYFP共表达产生与叶绿素荧光共定位的YFP信号，阴性对照无信号；Y2H实验进一步确认CFM2与MORF2/9在酵母中的互作，表明CFM2与MORF2和MORF9在叶绿体内发生直接互作。CFM2、MORF2和MORF9均影响质体转录本剪接：RT-qPCR分析显示ycf3.1剪接在morf2和cfm2中严重受损，ndhA在cfm2、morf2和morf9中未完全剪接，ndhB剪接在所有三个突变体中显著降低，剪接效率降低超过50%，而clpP1.1、clpP1.2、rpoC1、atpF剪接不受影响，表明MORF2和MORF9除RNA编辑外还是特定质体转录本高效剪接所必需的，该功能很可能通过其与CFM2的直接关联介导。讨论部分总结：叶绿体基因表达是一系列 tightly 精确调控的转录后加工事件，涉及RNA编辑、内含子剪接和外显子连接以产生功能性mRNA。历史上RNA编辑和剪接被认为是独立事件，尽管存在遗传学证据表明两个过程可能相互关联。本研究聚焦于CFM2这一在RNA编辑中无报道功能但在转录后剪接中已确立作用的因子，证明CFM2直接与核心编辑体组分MORF2和MORF9互作，且该互作在一部分叶绿体位点中对RNA编辑和剪接均为功能所需，从而确立CFM2作为植物叶绿体中两个重要RNA加工事件之间的分子连接。尽管先前研究已确立CFM2作为剪接因子对叶绿体中特定II类内含子切除至关重要，但其在RNA编辑中的作用尚未报道。本研究的IP-MS分析高置信度鉴定CFM2为MORF2和MORF9的互作蛋白，与此一致，cfm2突变体在16个morf2和morf9突变体同样缺陷的叶绿体位点表现严重编辑缺陷，但cfm2的编辑缺陷并非普遍性的，部分位点不受影响，表明CFM2选择性影响一部分MORF依赖编辑事件，这些发现明确将CFM2定义为编辑和剪接均需要的双功能蛋白，其选择性可能反映CFM2结合位点相对于前体mRNA上各编辑靶标三维形状的特定空间排列。CFM2为编辑和剪接所需这一观察提出CFM2作为双功能衔接蛋白在编辑体与剪接机器之间形成连接的可能性，BiFC实验首次证明CFM2与MORF2和MORF9之间的直接互作，且morf2和morf9突变体中观察到的剪接缺陷表明MORF蛋白本身也是高效内含子切除所需的，因此RNA编辑与剪接之间不可分割的联系可能是双向的：MORF蛋白不仅作为编辑因子发挥作用，还可能通过与CFM2形成的直接互作参与剪接。基于这些观察，研究人员提出工作模型：MORF2和MORF9形成编辑体核心的中央支架，特定RNA序列通过关联的PPR蛋白结合其上，形成耦联RNA加工事件的大分子枢纽；该支架不仅允许招募胞苷脱氨酶活性进行C-to-U编辑，还通过蛋白-蛋白互作直接接合剪接因子CFM2；CFM2进而通过稳定II类内含子核酶的催化活性构象或招募额外剪接辅因子来介导相邻内含子的切除；这种空间束缚确保编辑和剪接在同一前体mRNA分子上协调发生，类似于核系统中描述的共转录加工工厂。只有一部分内含子（ycf3.1、ndhA、ndhB）受MORF2/9或CFM2缺失影响，表明耦联并非普遍性的而是局限于特定位点，MORF蛋白也不与先前报道的其他CFM2结合蛋白关联，这种特异性可能通过编辑位点与内含子边界的邻近性或通过促进MORF2•9•CFM2三元复合体招募的额外RNA结构元件所赋予，但对该选择性决定因素的更深入理解有待未来对靶标RNA上CFM2和MORF结合位点的实验定位研究。尽管数据与所提模型一致，但cfm2、morf2和morf9突变体的严重叶绿体缺陷表型可能对RNA编辑、剪接和稳定性产生次级效应，因此虽然发现支持MORF-CFM2模块作为编辑与剪接之间的关键连接，但不能正式排除部分观察到的缺陷部分受叶绿体发育受损影响的可能，未来使用诱导型株系或互补实验区分初级和次级效应将很重要。结论部分翻译：RNA编辑和剪接是叶绿体中两个重要的转录后加工步骤。近年积累的证据表明这两个步骤通常紧密相连，但其潜在机制仍不清楚。本文通过实证研究方法解决了这一问题。研究人员证明RNA编辑和剪接通过叶绿体MORF编辑因子与剪接因子CFM2之间的直接互作而耦联。同时，这种耦联的编辑-剪接机制在单子叶和双子叶植物的叶绿体中保守存在。
