《Poultry Science》：Identification of potential substrates of ABHD10 in chicken cells
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蛋白质S-棕榈酰化（S-palmitoylation）是一种可逆的脂质修饰，可调控蛋白质的定位、稳定性与功能。去棕榈酰化酶ABHD10（α/β-水解酶结构域蛋白10，α/β-hydrolase domain-containing protein 10）已被证实
蛋白质S-棕榈酰化（S-palmitoylation）是一种可逆的脂质修饰，可调控蛋白质的定位、稳定性与功能。去棕榈酰化酶ABHD10（α/β-水解酶结构域蛋白10，α/β-hydrolase domain-containing protein 10）已被证实在线粒体氧化还原稳态中发挥作用，但其在调控蛋白质泛素化及内质网（endoplasmic reticulum, ER）加工过程中的角色尚未被探索。本研究采用酰基-生物素交换结合质谱法（acyl-biotin exchange coupled to mass spectrometry, ABE-MS），对稳定过表达Myc-ABHD10的DF1鸡成纤维细胞的S-棕榈酰化蛋白组进行了定量分析。在所定量的6,958种蛋白质中，有347种呈现差异棕榈酰化（199种下调，148种上调；P<0.05，差异倍数≥2.0），其中下调蛋白质主要定位于细胞质（36.8%）、细胞核（27.8%）和质膜（17.3%）。多层生物信息学分析——包括基因本体论（Gene Ontology, GO）富集、KEGG通路分析、基因-通路网络构建及基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）——一致表明，差异棕榈酰化蛋白质显著富集于泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin–proteasome system, UPS）和ER蛋白加工通路。具体而言，ABHD10过表达导致14个核心效应蛋白去棕榈酰化，包括UBE2I、SKP1、CUL1、STUB1/CHIP、PSMD1、COPS3、UBA5和SEC13，其中GSEA显示泛素介导的蛋白水解及Wnt信号通路呈负富集（归一化富集分数<0，P<0.05）。这些发现确立ABHD10作为一种全局性S-去棕榈酰化酶，可协同抑制UPS与ER蛋白加工，并为禽类细胞中ABHD10调控的棕榈酰化蛋白组提供了首个系统级表征，同时为翻译后修饰（post-translational modification, PTM）串扰调控细胞蛋白质稳态提供了机制框架。
**鸡细胞中ABHD10去棕榈酰化底物的全景鉴定及其调控泛素-蛋白酶体系统与内质网蛋白质稳态的功能研究**
## 一、研究背景、现存问题与研究意义
蛋白质翻译后修饰（post-translational modification, PTM）通过在特定氨基酸残基引入共价修饰来调控蛋白质的活性、定位、折叠及与其他生物大分子的相互作用，是细胞功能多样性的重要分子基础。S-棕榈酰化（S-palmitoylation）是一种可逆的脂质修饰，通过不稳定的硫酯键将棕榈酸（C16:0）共价连接至半胱氨酸残基。在哺乳动物细胞中，该过程由23个ZDHHC酰基转移酶家族催化，而去棕榈酰化则由酰基蛋白硫酯酶介导。棕榈酰化稳态的破坏会直接影响跨膜蛋白的构象稳定性，诱导内质网（endoplasmic reticulum, ER）滞留及核孔复合体解体，并触发泛素依赖的蛋白质降解。因此，棕榈酰化广泛参与代谢、转录调控、囊泡运输等基础细胞过程，并与癌症和神经退行性疾病密切相关。
ER是 eukaryotic 细胞中最大的膜性细胞器，负责分泌蛋白和膜蛋白的合成、折叠、修饰及质量控制。ER蛋白加工通路涵盖新生多肽向ER腔内的转运、N-糖基化、分子伴侣辅助折叠，以及通过ER相关降解（ER-associated degradation, ERAD）对错误折叠蛋白的识别和逆行转运降解。正确折叠的蛋白质经由COPII囊泡输出至高尔基体，而错误折叠蛋白则由VCP/p97 ATP酶逆行转运至细胞质，随后由泛素系统处理。
泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin–proteasome system, UPS）是 eukaryotic 细胞中主要的选性蛋白降解途径，由E1泛素激活酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶级联催化底物多聚泛素化，标记蛋白质供26S蛋白酶体识别与降解。大量证据表明，棕榈酰化在ER蛋白加工中发挥重要调控作用，并与UPS形成双向串扰：E3连接酶的棕榈酰化影响其膜定位和底物识别，而去棕榈酰化酶活性可能调控底物蛋白的降解速率。例如，Wnt通路跨膜蛋白LRP6棕榈酰化的缺失导致严重ER滞留，单泛素化是其滞留和降解的前提；ZDHHC2介导的USP19棕榈酰化则破坏其底物结合口袋，减弱USP19对ACSL4的去泛素化活性，从而调控前列腺癌细胞铁死亡敏感性。
ABHD10是一种去棕榈酰化酶，最初通过人肝脏蛋白色谱纯化鉴定为水解霉酚酸酰基葡萄糖醛酸的功能性酯酶，随后被表征为具有S-去棕榈酰化酶活性的线粒体和细胞质蛋白。已有研究证明ABHD10控制PRDX5亲核活性位点的S-棕榈酰化状态以调节其抗氧化能力，并介导SPATA19、GK2和PDHX的S-去棕榈酰化以调控精子线粒体鞘形成和雄性生育力，还参与药物代谢和酒精性肝病。然而，现有研究主要集中于线粒体代谢，ABHD10在调控ER稳态和UPS中的作用依然未知。因此，进一步阐明ABHD10的底物谱对于理解其在蛋白质质量控制中的调控功能至关重要。
## 二、研究策略与核心结论
基于上述背景，研究人员提出ABHD10是否超出线粒体氧化还原稳态、作为细胞蛋白质稳态的全局调控因子发挥作用这一科学问题。为此，研究人员建立了Myc-ABHD10过表达的DF1鸡胚成纤维细胞模型，并将基于酰基-生物素交换的定量棕榈酰化蛋白组学与多层生物信息学分析相结合，包括亚细胞定位、GO和KEGG富集、基因-通路网络构建及GSEA。研究旨在：(i) 系统编目ABHD10重塑棕榈酰化的蛋白质；(ii) 确定这些底物是否汇聚于泛素-蛋白酶体系统和ER蛋白加工通路；(iii) 鉴定核心效应蛋白，如UBE2I、SKP1、CUL1、STUB1、PSMD1和SEC13，通过它们ABHD10耦联胞质和ER相关降解。研究结果确立了ABHD10作为全局性S-去棕榈酰化酶的地位，可协调抑制UPS和ER蛋白加工，为禽类细胞中ABHD10调控的棕榈酰化蛋白组提供了首个系统级表征。这一发现建立了S-棕榈酰化与泛素化串扰调控蛋白质质量控制的机制框架，并为家禽蛋白质稳态研究提供了候选底物资源。
## 三、关键技术方法（不超过250字）
研究人员采用的主要技术方法包括：酰基-生物素交换结合质谱法（ABE-MS）——利用羟基胺（HA）特异性裂解硫酯键，以生物素-HPDP标记新暴露的巯基，经链霉亲和素富集、胰蛋白酶酶解后进行LC-MS/MS定量分析；MaxQuant v2.1软件结合UniProt鸡蛋白质数据库进行鉴定和标记-free定量，limma包进行差异蛋白分析（阈值P<0.05，差异倍数≥2.0）；通过Western blot验证ABHD10过表达；DF1细胞由北京市中国农业科学院畜牧兽医研究所提供；生物信息学分析采用Fisher精确检验进行GO和KEGG富集，在线平台进行数据可视化，R包ggplot2和pheatmap绘制火山图、散点图及层次聚类热图。
## 四、研究结果
**（一）ABHD10过表达重塑DF1细胞的棕榈酰化蛋白组**
Western blot证实Myc-ABHD10-OE组中ABHD10蛋白水平较Myc-EV对照组显著升高。Venn图分析显示Myc-ABHD10-OE与Myc-Vector组共有4,784个棕榈酰化蛋白，448个蛋白仅在Myc-ABHD10-OE组中检出，906个仅在Myc-Vector组中检出。主成分分析和聚类热图显示两组间棕榈酰化谱存在显著差异，PC1解释了78.65%的总方差。以P<0.05和差异倍数≥2.0为标准，共鉴定347个差异棕榈酰化蛋白，包括148个上调和199个下调蛋白，表明ABHD10过表达显著改变细胞棕榈酰化谱。
**（二）差异棕榈酰化蛋白的亚细胞定位与功能注释**
亚细胞定位分析显示，下调蛋白中占比最高的3个区室为细胞质（36.8%）、细胞核（27.8%）和质膜（17.3%），另有分布于ER、线粒体和细胞骨架。KEGG和GO功能注释进一步表明，棕榈酰化下调蛋白主要参与内吞作用、ER蛋白加工、泛素介导的蛋白水解、核质转运和mRNA监视通路。这些发现表明ABHD10调控的蛋白高度富集于泛素介导的蛋白水解和ER蛋白加工通路，定位于胞质和核区室，通过泛素-蛋白酶体活性、锌离子结合及相关分子功能发挥调控作用。
**（三）富集分析鉴定ABHD10调控的棕榈酰化靶标**
通路-基因关联网络分析显示泛素介导的蛋白水解作为中枢调控枢纽，内吞、溶酶体、沙门菌感染、核质转运和mRNA监视通路的关键功能基因显著下调，包括分选nexin（SNX）家族、液泡蛋白分选（VPS）家族和NPC2。Mfuzz软聚类分析将差异表达蛋白分为8个簇，Myc-ABHD10-OE和Myc-Vector组在所有簇中均呈现不同表达模式。这些结果证明ABHD10通过改变禽类细胞中靶蛋白的棕榈酰化状态来调控多种生物学过程。
**（四）ABHD10调控泛素-蛋白酶体系统和内质网稳态**
GO生物学过程富集分析显示差异棕榈酰化蛋白显著富集于ER蛋白加工和UPS过程，最显著富集项为“小蛋白缀合或移除介导的蛋白修饰”（涵盖泛素化和去泛素化），伴随“细胞大分子分解代谢过程”等ERAD相关条目富集。弦图分析鉴定出14个介导该表型的核心效应蛋白，包括UBE2I（唯一的SUMO化E2结合酶）、SKP1和CUL1（Skp1-Cullin1-F-box [SCF] RING连接酶家族的支架和衔接亚基）、STUB1/CHIP（参与胞质和ER相关降解的U-box E3连接酶）、PSMD1（26S蛋白酶体19S调节颗粒亚基）、COPS3（COP9信号复合体亚基）、UBA5（类泛素修饰激活酶）和SEC13（COPII囊泡外壳成分）。这些蛋白的棕榈酰化水平在ABHD10过表达细胞中均显著降低。KEGG分析证实差异棕榈酰化蛋白显著富集于“内吞-溶酶体-蛋白酶体”降解链和ER蛋白加工通路，两者共享核心E3泛素连接酶分子SKP1、CUL1和STUB1。GSEA进一步显示Wnt信号通路和泛素介导的蛋白水解在ABHD10诱导棕榈酰化下调基因中呈负富集（归一化富集分数<0，P<0.05）。这些结果表明，ABHD10通过UPS调控ER错误折叠蛋白加工和ERAD，同时通过COPII组分SEC13的去棕榈酰化影响ER蛋白输出，参与禽类细胞蛋白质稳态的综合调控。
## 五、讨论与结论
讨论部分总结指出，多层富集分析最显著且趋同的发现是UPS的一致参与。KEGG通路富集鉴定泛素介导的蛋白水解在差异棕榈酰化蛋白中显著富集，GSEA进一步显示该通路在ABHD10过表达细胞中呈负富集，表明其受到协调性抑制。GO分析中最显著富集的条目包括“泛素依赖的蛋白质分解代谢过程”和“小蛋白缀合或移除介导的蛋白修饰”等生物学过程，以及“泛素样蛋白转移酶活性”“泛素蛋白连接酶活性”等分子功能。弦图和基因-通路网络突出显示了14个核心效应蛋白，其棕榈酰化水平在ABHD10过表达细胞中显著降低。据此提出模型：ABHD10介导的关键E2/E3酶S-棕榈酰化移除损害了其膜关联、底物募集或催化周转效率。ABHD10作为上游脂质编辑酶，广泛削弱泛素化能力。同时，ER蛋白加工通路作为第二主轴，SEC13去棕榈酰化预计减缓ER-高尔基体转运，STUB1/CHIP去棕榈酰化则可能损害ERAD效率，两者汇聚导致ER蛋白质稳态破坏。STUB1、SKP1和CUL1作为ERAD和通用UPS共享节点，构成两条通路耦联的机制连接点。GSEA还揭示Wnt信号通路显著负富集，与Wnt组分依赖棕榈酰化进行膜募集和信号复合体组装的已知机制一致。研究局限性包括：ABE-MS捕获稳态棕榈酰化水平，无法区分棕榈酰化周转率与总蛋白丰度变化；结论基于过表达模型；通路和网络层面结论为相关性，需靶向生化实验建立因果关系；DF1模型需在原代禽类细胞和体内进一步验证。
研究结论部分可翻译为：综上，本研究提供了禽类细胞中ABHD10调控棕榈酰化蛋白组的首次系统级表征，并确立ABHD10作为一种全局性S-去棕榈酰化酶，通过E2/E3组分和蛋白酶体亚基PSMD1的去棕榈酰化（UBE2I、SKP1、CUL1、STUB1）协调重塑细胞蛋白质稳态的两大核心分支——泛素-蛋白酶体系统（UPS）；以及通过COPII组分SEC13和ERAD E3连接酶STUB1调节内质网（ER）蛋白加工。这些调控轴汇聚于STUB1、SKP1和CUL1等共享节点，耦联胞质和ER相关降解，并延伸至内吞作用和Wnt信号通路。总之，这些发现确立了ABHD10作为S-棕榈酰化依赖性PTM串扰的关键整合因子，并为家禽蛋白质稳态的未来研究提供了候选底物资源。
