视网膜细胞成像技术的进展：迈向单细胞分辨率和功能性生物标志物的检测

《Progress in Retinal and Eye Research》：Advances in Retinal Cellular Imaging: Towards Single-Cell Resolution and Functional Biomarkers

• •
  自适应光学技术实现了活体细胞的视网膜成像
• •
  AO-OCT、AOSLO和FIAO提供了互补的细胞成像平台
• •
  DARC技术实现了视网膜细胞凋亡的分子成像
• •
  ICG和姜黄素提高了视网膜成像的分子对比度
• •
  人工智能改善了视网膜图像的重建、分割和量化

引言

在过去的几十年中，各种视网膜成像技术，包括眼底摄影（Miller等人，1996年）、光学相干断层扫描（OCT）（Huang等人，1991年）和扫描激光检眼镜（SLO）（Wade和Fitzke，1998年），通过详细的视网膜解剖结构和血管可视化显著推动了眼科诊断的发展。然而，这些临床成像系统主要提供组织级别的信息（例如大型血管或分层的视网膜结构），缺乏在活体中识别单个细胞所需的分辨率（Williams，2011年）。虽然标准眼底照片上可以观察到主要的视网膜动脉和静脉，但毛细血管网络超出了传统眼底相机的分辨率范围。同样，临床OCT可以提供微米级轴向分辨率的视网膜层横截面细节，但由于眼睛的像差问题，其横向分辨率不足以区分单个细胞（Williams，2011年）。简而言之，传统的视网膜成像主要停留在宏观或介观层面，捕捉组织级别的病理变化，而真正意义上的活体人眼的微观（细胞级别）成像仍然难以实现。

自适应光学（AO）视网膜成像技术现在通过实现接近衍射极限的活体视网膜视图改变了这一现状（Liang等人，1997年）。AO技术能够实时校正眼睛的光学像差，使得横向分辨率达到约3微米。在最佳条件下，当瞳孔最大扩张超过7毫米且参与者年轻健康时，横向分辨率可接近2微米（Roorda等人，2002年）。这种改进足以在活体中观察到正常视网膜的细胞甚至亚细胞结构；这些细节以前只能通过组织切片或动物模型来观察。这一进展的影响是深远的：视网膜成像已经从观察粗略特征（血管、水肿、大体病变）转变为直接分辨单个视网膜细胞，如视网膜色素上皮（RPE）细胞（Morgan等人，2009年；Scoles等人，2013年）、感光细胞（Merino等人，2011年；Dobre等人，2011年）、视网膜神经节细胞（Rossi等人，2017年；Liu等人，2017b年）、免疫细胞（Migacz等人，2022年；Rui等人，2024年）以及毛细血管（Salas等人，2017年；Migacz等人，2022年；Rui等人，2024年；Tam和Roorda，2011年；Chui等人，2012年）。新兴的功能扩展，包括基于AO的光视网膜成像技术，进一步表明细胞分辨率成像最终可能提供视网膜健康的结构和功能生物标志物，尽管这些方法在技术上仍然具有挑战性，并且仍在尝试将其应用于更广泛的临床领域（Jonnal，2021年）。

重要的是，AO本身并不是一种独立的成像技术，而是一种可以集成到各种成像平台中的灵活技术。它已成功应用于所有主要的临床视网膜成像技术中，包括眼底相机（Liang等人，1997年）、扫描激光检眼镜（Roorda等人，2002年）和OCT系统，显著提高了它们的分辨率（Hermann等人，2004年；Zhang等人，2005年）。因此，本综述首先探讨了主要的AO增强型视网膜成像平台，包括漫射照明自适应光学（FIAO）、自适应光学OCT（AO-OCT）和自适应光学扫描激光检眼镜（AOSLO），然后讨论了如何通过分子对比度和计算方法进一步扩展细胞视网膜成像。最近，图像配准、自动化分割、人工智能辅助重建和定量分析在将高分辨率视网膜图像转换为可重复的细胞生物标志物方面变得越来越重要。

随着光学分辨率的提高，分子标记策略可以通过突出仅通过反射、散射或自发荧光无法看到的过程，使视网膜成像更具生物学信息性。吲哚花青绿（ICG）是一种临床应用的近红外血管造影染料（Destro和Puliafito，1989年；Bischoff和Flower，1985年），已被用于辅助可视化视网膜色素上皮（RPE）镶嵌结构中的晚期异质荧光模式（Tam等人，2016年；Jung等人，2018年）。检测凋亡视网膜细胞（DARC）使用基于荧光 annexin V 的探针来检测活体中的视网膜细胞应激和凋亡，提供细胞应激和退化的功能性分子指标（Cordeiro等人，2004年；Cordeiro等人，2022年；Guo和Cordeiro，2008年）。基于姜黄素的视网膜成像代表了一种更多的探索性分子标记方法，用于检测阿尔茨海默病中的淀粉样蛋白相关视网膜信号，针对的是蛋白质聚集而不是特定的视网膜细胞或细胞应激状态（Koronyo等人，2012年；Koronyo等人，2017年；Koronyo-Hamaoui等人，2011年）。

本综述讨论了人类视网膜细胞成像的最新进展，重点介绍了能够实现单细胞分辨率的方法、高分辨率检眼镜的技术创新以及对比剂策略，并展示了初步的临床应用，这些应用有助于早期疾病检测、疾病活动评估和治疗监测。最终，本综述旨在强调视网膜成像是如何从结构评估发展到包含功能和分子信息的细胞分辨率分析的，同时也强调了在这些技术得到广泛采用之前，标准化采集、生物学验证和临床意义明确的终点的重要性。

部分摘录

用于视网膜细胞成像的自适应光学系统

在视网膜成像中，人眼的光学系统，主要是角膜和晶状体，引入了像差，这限制了传统眼科成像系统的横向分辨率，并降低了细胞视网膜结构的可见性（Liang等人，1997年；Artal和Guirao，1998年）。自适应光学（AO）系统最初是作为天文望远镜的组件开发的（Gonsalves，1982年；Beckers，1993年；Babcock，1953年），利用波前传感器和可变形

视网膜成像中的分子标记策略

直接视网膜成像技术，如FIAO、AO-OCT和AOSLO，可以揭示细胞或微米级的微观结构，但其对比度主要由内在的光学属性产生，包括反射、散射、导光和自发荧光。因此，它们可能无法直接显示分子活性、细胞应激或生理状态。分子标记策略可以通过引入靶向或半靶向对比度来补充这些技术，从而

结论

视网膜成像正在从结构可视化向活体人眼的细胞和分子评估方向发展。自适应光学技术在实现活体视网膜微观结构的成像方面发挥了核心作用，而分子标记策略则增加了仅靠形态学无法捕捉的生物学对比度。这两种方法共同推动视网膜成像从简单地分辨细胞向测量细胞状态、组织活性等方向发展

CRediT作者贡献声明

Ethan Rossi：撰写——审阅与编辑，可视化。Daniel Hill：撰写——审阅与编辑，初稿撰写。Kun Pei：撰写——审阅与编辑，初稿撰写，项目管理。Maria Francesca Cordeiro：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，概念构思。Liwei Zhang：初稿撰写。Evelyn Markle：可视化

利益冲突声明

MFC是DARC和算法专利的命名发明者，这些专利最初归UCL所有，并于2020年授权给Novai Ltd，MFC是该公司的一名董事股东。EAR是视网膜成像技术的命名发明者，这些技术目前归罗切斯特大学所有，尚未授权给任何实体（US10,772,496；US10,123,697；US10,092,181），并且曾获得Robotrak Technologies Inc的旅行支持。作者没有其他相关关联或财务利益

致谢

Wellcome Trust（WT099729；WT088029）为DARC项目提供了从临床前开发到第二阶段临床试验的资助，随后Novai Ltd将这项技术商业化。EAR和EM得到了匹兹堡大学眼科系国家眼科研究所核心的Vision Research P30项目（EY08098）、匹兹堡眼耳基金会以及纽约市的研究机构“Research to Prevent Blindness”的支持。我们感谢Donald T Miller提供的帮助

Kun Pei|Ethan A. Rossi|Daniel Hill|Liwei Zhang|Evelyn M. Markle|M.Francesca Cordeiro