《European Journal of Wildlife Research》：Studying invasive species by non-invasive methods: Real-time qPCR successfully detects protected vertebrate species in raccoon scats
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入侵外来物种对生物多样性构成重大威胁，尤其是通过对稀有和濒危物种的捕食。在欧洲，关于浣熊等入侵性哺乳类捕食者影响的研究仍然匮乏，且现有的饮食分析方法往往无法检测到此类捕食事件。因此，本研究评估了实时荧光定量PCR（qPCR）作为检测稀有物种捕食事件的灵敏方法的
入侵外来物种对生物多样性构成重大威胁，尤其是通过对稀有和濒危物种的捕食。在欧洲，关于浣熊等入侵性哺乳类捕食者影响的研究仍然匮乏，且现有的饮食分析方法往往无法检测到此类捕食事件。因此，本研究评估了实时荧光定量PCR（qPCR）作为检测稀有物种捕食事件的灵敏方法的适用性。研究分析了来自两只圈养浣熊投喂实验的粪便样本，以及来自德国中部自由放养个体的粪便样本（2021–2023年）。在投喂实验中，提供了参考鸟类物种（Gallus gallus domesticus）和两栖动物（Pelophylax ridibundus）。此外，对野外样本应用了七种鸟类和两栖动物物种的标记系统。两种参考物种的DNA均被检测到，尽管与G. gallus domesticus相比，P. ridibundus的检测表现出延迟且一致性较低。在野外样本中，52份样本里有5份检测到三种目标物种（Anas strepera、Triturus cristatus、Bufo bufo）的DNA。这些结果表明，qPCR能够检测稀有物种的捕食事件，尽管实际捕食率可能被低估。该方法是一种有价值的靶向工具，但需要进一步验证以改进解释。
研究背景方面，入侵外来物种的引入对全球本土物种的灭绝构成重大威胁，理解其影响对于减少生物多样性丧失具有重要意义。入侵性哺乳类捕食者被认为对许多脊椎动物物种构成特别高的灭绝风险。在中欧，三种引入的哺乳类捕食者已成为稳定种群：浣熊（Procyon lotor）、貉（Nyctereutes procyonoides）和美洲水貂（Neogale vison），三者均被欧盟列为入侵物种并受管理。由于其在觅食和栖息地方面的适应性，这些物种目前仍在进一步扩散。然而，关于欧洲入侵性哺乳类捕食者对本土动物区系特别是稀有物种影响的科学研究的匮乏，且目前用于研究入侵性哺乳类捕食者对本土猎物物种影响的方法有限。此外，捕食者在不同栖息地类型中可能表现不同，这反映在关于浣熊在欧洲新分布区捕食影响的研究结果存在差异：一些关于浣熊觅食行为的研究未发现对稀有或濒危物种存在负面捕食影响的证据，而其他研究则认为浣熊能够对当地猎物种群施加高捕食压力。然而，某一物种未出现在入侵性捕食者的饮食中并不一定表明该物种没有受到威胁，这尤其适用于泛化种和稀有物种的捕食情况。因此，需要适当的方法来评估入侵物种的捕食影响。迄今为止，有多种用于饮食分析的方法，各有优缺点。传统上，许多关于哺乳类捕食者饮食的研究采用对粪便或胃中未消化残骸的视觉饮食分析，包括对入侵性浣熊和貉饮食的研究。然而，准确性和在物种水平上识别猎物的能力取决于样本中残留物的质量以及操作者的分类学技能。例如，高度消化的猎物项目或不含硬质残留物的样本（如无壳的卵或卵块）用该方法更难检测。较新的研究使用宏条形码（metabarcoding）分析哺乳类捕食者的饮食，仅有一项研究使用宏条形码研究入侵性浣熊的饮食。与视觉饮食分析相比，宏条形码通常具有更高的猎物检测率，并能在更精确的分类学水平上确定猎物。另一种用于饮食分析的灵敏分子方法——实时定量聚合酶链反应（qPCR），提供了一种更有针对性的方法，即使靶标物种DNA浓度很低也具有高检测概率。虽然视觉饮食分析和宏条形码为确定主要饮食成分提供了高效方法，但qPCR有潜力在物种水平上检测被较少和较少大量捕食的猎物项目，例如濒危物种。此外，宏条形码方法从下一代测序（NGS）制备到生物信息学分析的相关工作流程技术复杂，在标准化和数据解释方面存在局限。相比之下，靶向qPCR方法在初始检测体系建立后提供了一种稳健、易于标准化且可透明评估的方法，特别适用于常规化和假设驱动的问题。qPCR分析已被用于解决捕食者-猎物关系的问题，但仅有少数研究使用它来解决入侵性哺乳类捕食者的饮食和潜在影响问题。由于qPCR具有高灵敏度、靶向性和稳健性，它可能成为检测稀有和特定猎物物种捕食事件的有效方法，并可能特别适合回答入侵性哺乳类捕食者对特定稀有和濒危本土物种捕食影响的问题。自浣熊引入以来，在其新分布区关于对稀有脊椎动物物种捕食的观察越来越多地被发表。在脊椎动物中，对各种两栖动物和鸟类物种的捕食，包括巢卵捕食，记录尤为详尽。这些例子还包括被列入红色名录的濒危、极危或面临灭绝威胁的物种。以往关于入侵性浣熊的科学研究主要集中在其一般饮食上，而非更详细地检查特定捕食事件或稀有物种的捕食。较近期的研究记录了入侵性浣熊对积累食物资源的捕食事件，包括对稀有动物物种的捕食。然而，由于现有饮食研究方法的局限性，浣熊等入侵性哺乳动物对稀有动物物种的捕食事件存在未被检测到的风险。由于这些捕食事件可能对本土稀有和濒危物种产生重大影响，至少在局部层面上如此，因此有必要开发更好的方法来检测入侵物种的捕食事件。因此，本研究旨在评估一种实时qPCR方法用于检测入侵性浣熊对稀有和濒危动物物种捕食事件的适用性。为此，研究使用来自圈养浣熊投喂实验的已知成分粪便样本以及自由放养浣熊的粪便样本，通过回答以下假设来测试qPCR方法在入侵性哺乳类捕食者饮食方面的有效性：（1）使用qPCR方法能够在浣熊粪便中在物种水平上检测到脊椎动物物种；（2）使用qPCR方法能够在浣熊粪便中在物种水平上检测到稀有和濒危脊椎动物物种。
研究人员开展了以下研究：投喂实验方面，两只圈养浣熊于2021年11月和2022年3月在德国Knüll自然公园（50.99; 9.43）的野生动物园中投喂含有特定物种的饮食。为代表性稀有脊椎动物物种作为浣熊潜在猎物，两只动物在投喂实验期间分别被喂以一种参考鸟类物种（Gallus gallus dom.）和一种参考两栖动物物种（Pelophylax ridibundus）。目标之一是确定是否可以使用qPCR方法在已知成分的浣熊粪便样本中检测到两种目标物种的DNA，该方法也是选定的自由放养浣熊饮食分析方法。为确定两栖动物DNA是否可检测及可检测多长时间，第一只浣熊（A）在一天后停止投喂P. ridibundus，第二只浣熊（B）在13天后停止。随后P. ridibundus被添加鸡蛋所替代，增加G. gallus dom.的饲料量。因此，当使用Gallus gallus dom.增加饲料量时，评估Ct值的变化。投喂实验中使用的浣熊已单独饲养在动物公园已知围栏中。饮食中所有投喂成分，包括鸟类和两栖动物，均为浣熊自然饮食的一部分。投喂实验开始前两天，两只浣熊被喂以素食形式的中性饮食（水果和玉米），可轻易与两种参考物种区分。投喂实验开始时，第一只浣熊（A）连续三天被喂以含有目标动物的饮食，第二只浣熊（B）在21天内被喂以目标动物。两只动物每天喂食一次。对于浣熊A，投喂实验第一天的饮食和浣熊B在投喂实验前13天的饮食包含以下成分：一日龄雏鸡（Gallus gallus dom., 90–160 g）、植物性食物（水果和坚果, 200–250 g）和沼泽蛙（Pelophylax ridibundus, 50–80 g）。沼泽蛙来源于路杀，被发现时刚死亡后冷冻。最初，食物项目以匀浆混合物形式提供以防止选择性进食。然而，由于浣熊对混合饮食接受度低，野生动物园工作人员随后将食物项目分开提供并确保每次食物均被消耗。在投喂实验的后半段，沼泽蛙被鸡蛋（G. gallus dom., 60 g）替代。一日龄雏鸡和植物性食物的量在后半段保持不变。尽管浣熊为杂食性，其全肠道通过时间很快，液体和颗粒标记物的平均通过时间均不超过24小时，平均滞留时间约为15小时，介于家养食肉动物的通过特征之间。相应地，每次喂食后24小时，从围栏中收集所有新鲜粪便样本。所有粪便样本置于装有乙醇的塑料容器中，标记后于-22 °C冷冻。样本随后在Senckenberg研究所和自然历史博物馆法兰克福保护遗传学组进行分析，以确定是否可在粪便样本中检测到Gallus gallus dom.的DNA和P. ridibundus的DNA。野外粪便样本采集方面，研究区域位于德国中部黑森州"Wetterau"地区（50.42 N, 8.89 E; 178 m a.s.l.；年均温10.5°C；年降水量578.6 mm）。研究区域的洪泛区用于 Extensive 放牧和草甸，形成"Wetterau洪泛区网络"（7369 ha），已被指定为景观保护区。与指定的自然保护区一起，这些区域构成了黑森州水禽和涉禽最重要的繁殖和休息区以及稀有两栖动物物种的产卵场。浣熊自1930年代以来在黑森州野外被发现，此前成功在北黑森释放了一对浣熊。此后黑森州猎获的浣熊数量稳步上升，目前为每年30,427只。在2014/15和2017/18狩猎年度，Wetterau区每100 ha可狩猎面积的浣熊密度为1.5至6.23只，目前是浣熊密度最高的地区之一。粪便样本于2021年、2022年和2023年春季和夏季（分别为3月1日至7月10日）采集，以覆盖当地鸟类和两栖动物物种的繁殖和产卵季节。使用形状、大小和发现地点等标准来识别浣熊粪便。为避免繁殖和产卵季节的干扰，未进入自然保护区本身，而是在相邻区域采集粪便。利用研究期间佩戴项圈的浣熊遥测数据确定当前休息地点以搜索粪便。浣熊经常使用公共排便地点也称为厕所（latrines）。在森林栖息地中，定期搜索适合厕所的结构，例如倒在地上的树木或根盘。此外，还调查了保护区外水道的岸线结构，如溪流或沟渠的路线，以及桥梁下方可进入的堤岸。所有采集的粪便样本置于装有乙醇的塑料容器中，标记后于-22 °C冷冻。qPCR粪便分析方面，粪便样本在Senckenberg保护遗传学组Gelnhausen Frankfurt进行分析。野外采集的粪便被分析以确定粪便样本是否含有以下物种的DNA，这些物种代表研究区域发现的稀有或常见鸟类和两栖动物物种，且为浣熊的潜在猎物：凤头麦鸡（Vanellus vanellus）、灰山鹑（Perdix perdix）、北琵嘴鸭（Spatula clypeata）、赤膀鸭（Anas strepera）、大冠蝾螈（Triturus cristatus）、欧洲绿蟾蜍（Bufotes viridis）、普通铲足蟾（Pelobates fuscus）和普通蟾蜍（Bufo bufo）。八种两栖动物和鸟类物种构成目标物种，使用qPCR方法分析粪便样本中的DNA。目标物种根据其在研究区域的出现和黑森州的丰度选择，此处以黑森州红色名录状态和丰度表示，两栖动物以栅格频率（rf）表示，鸟类以繁殖对数量（bp）表示。粪便样本DNA按照制造商方案使用QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Germany）和Qiacube机器人系统（Qiagen, Germany）提取。洗脱分两步进行，每步60 μl，每样本总容积120 μl。提取物在使用前于4 °C保存。所有Pre-PCR步骤均在专用于处理环境样本的实验室中进行。为防止可能的DNA交叉污染，所有使用的架子和台面均预先用氯漂白剂清洁，处理每个样本后更换橡胶手套。通过运行提取空白（无粪便材料输入）以及阴性PCR对照（无DNA水）在所有实验中监测可能的污染。为防止粪便误识别，所有采集的样本通过测序线粒体控制区的短片段进行浣熊来源的遗传分析。PCR反应包含5 μl SensiFAST SYBR No-ROX Kit（Biocat GmbH, Germany）、1.2 μl无DNA水、0.4 μl正向引物L15995（5′-3` CTCCACTATCAGCACCCAAAG）和反向引物H16498（5`-3` CCTGAAGTAAGAACCAGATG）以及3 μl DNA提取物。两步热循环条件如下：95 °C 3 min（初始聚合酶激活步骤），40个循环，变性95 °C 5 s，退火/延伸60 °C 30 s，随后60 °C 10 min最终延伸，10 °C保存直至进一步使用。扩增子在Sanger测序前用2 μl ExoSap-It（Affymetrix, USA）纯化，在3730 DNA分析仪（Applied Biosystems）上运行。序列使用sequence scanner software v1.0（Applied Biosystems）分析。所有明确序列使用NCBI GenBank默认设置进行BLAST以确定宿主物种。来自投喂实验的粪便样本和测试为浣熊DNA阳性的野外采集粪便样本随后使用现有和新开发的物种特异性灵敏qPCR检测体系分析目标物种的存在。对于两栖动物物种，使用来自Thomsen et al. (2012)的T. cristatus和P. fuscus的qPCR标记，来自Tanabe et al. (2007)的G. gallus dom.标记，以及来自Wittwer et al. (in prep.)的B. bufo和B. viridis标记。对于其他鸟类物种，开发了新的eDNA标记系统。为此，从NCBI Genbank和BOLD获取参考DNA序列（COI、cytb、NAD2）。这些物种的参考组织样本从Wuppertal动物园和Cologne动物园采集。参考标本按照制造商说明使用Blood and Tissue Kit（Qiagen GmbH, Germany）提取，并通过Sanger测序检查正确的物种分配和DNA提取物功能性。德国出现的目标/非目标鸟类物种的参考序列（COI比对：n = 91，cytb比对：n = 85，NAD2比对：n = 72）使用BioEdit v.7.1.3.0和MAFFT Version 7比对，并筛选两个物种的独特序列区域。使用Primer Express 3.0.1默认设置设计物种特异性引物和TaqMan小沟结合（MGB）探针，随后使用NCBI BLAST和OligoAnalyzer?（IDT DNA）进行引物验证，以及使用UNAFold（IDT DNA）和AmplifX 2（Version 2.0.7）进行扩增子验证和电子PCR。随后使用目标物种的组织来源DNA提取物（10 ng/μl）进行交叉扩增测试，当无组织样本可用时，使用目标物种的合成gBlock构建体以及可能生活在同一环境的非目标物种。实时qPCR分析在Quantstudio3 Real-Time-PCR系统（Applied Biosystems）上进行。Ct值使用QuantstudioTM Design and Analysis software（version 1.5.1; Applied Biosystems）计算。当Ct值低于物种特异性截断阈值时，样本被视为阳性。这些阈值基于检测体系灵敏度确定，对应每个目标物种的检测限（LoD）。物种特异性LoD和LoQ值列于表中。10 μl qPCR反应包含5 μl 2xTaqMan Environmental Master Mix 2.0（Thermo Fisher Scientific）、0.5 μM每种引物、0.2 μM探针、2 μl DNA模板和1.8 μl分子级水。qPCR方案包括95 °C 10 min初始Taq聚合酶热激活，45个循环的95 °C 15 s变性和62 °C 30 s退火/延伸步骤。除重复分析样本外，qPCR板还包括阳性对照（10 ng/μl参考标本样本和合成gBlocks，后者用于标准曲线构建和LOD/LOQ确定）以及阴性对照（PCR水、提取空白对照、人类DNA）。所有显示阳性扩增的样本随后进行测序以确认PCR产物的身份。
研究结果方面，投喂实验中共从两只浣熊收集了13份粪便样本。野生动物园每天搜索粪便一次，但仅在13天发现粪便。两份粪便样本无法确定为浣熊来源，被排除在进一步分析之外。因此，剩余11份粪便样本用于qPCR测试（浣熊A三份，浣熊B八份）。由于连续投喂一日龄雏鸡，预期在粪便样本中连续检测到G. gallus dom.的DNA。使用qPCR方法成功在每份粪便样本中检测到G. gallus dom.的DNA。由于投喂实验后半段投喂P. ridibundus，预期在相应粪便中检测到P. ridibundus的DNA。在圈养浣熊A的第二和第三份粪便样本（A2、A3）以及圈养浣熊B的第四和第五份粪便样本（B4、B5）中检测到P. ridibundus的DNA。换言之，在开始投喂P. ridibundus后1至6天，粪便中两栖动物DNA的检测存在"延迟"。G. gallus dom.和P. ridibundus的Ct值通常低于LOD且相当稳健。在将P. ridibundus替换为G. gallus dom.的鸡蛋后，相应粪便的Ct值预期会发生变化。G. gallus dom.的Ct值在每次投喂实验开始时非常高，即DNA浓度非常低。在投喂实验过程中，G. gallus dom.的Ct值波动，无明显升高或降低。两只浣熊最后检测到P. ridibundus DNA的粪便样本中P. ridibundus的Ct值较高。野外粪便采集方面，野外共采集224份粪便。在95份样本中，由于DNA污染无法确定来源物种。57份样本检测为浣熊DNA阳性，其中5份因序列质量不足无法进一步使用。除浣熊外，赤狐（Vulpes vulpes, n = 36）、海狸鼠（Myocastor coypus, n = 10）和石貂（Martes foina, n = 7）被确定为采集粪便样本的来源物种。大多数检测为浣熊DNA阳性的粪便样本发现于自然保护区附近的森林区域。许多样本采集于被佩戴项圈的浣熊用作休息地点的树下，或倒在地上的树干或根盘上。在森林区域外，缺乏用于针对性搜索厕所的合适结构。因此，仅在水道沿线、桥梁下方堤岸或定居点内发现孤立粪便。qPCR粪便分析方面，通过qPCR在52份浣熊粪便样本中的5份成功检测到目标物种DNA：一份样本含有赤膀鸭（Anas strepera）DNA，另一份样本含有大冠蝾螈（Triturus cristatus）DNA，三份浣熊粪便含有普通蟾蜍（Bufo bufo）DNA。所有五份粪便样本中确定的Ct值低于LOD且稳健。所有五份含有目标物种DNA的粪便样本均在自然保护区附近发现。四份粪便采集于2022年和2023年春季，一份粪便采集于2021年秋季研究期间之外。在五份检测为目标物种DNA阳性的粪便样本中，相应扩增子的测序确认了四份样本中目标物种的身份，而一份样本（样本ID 25–21）无法通过测序确认。
讨论部分总结如下：研究结果表明，qPCR是一种合适且灵敏的方法，用于检测浣熊粪便中的脊椎动物猎物物种，包括受保护关注的稀有分类群。在野外样本中检测到A. strepera、T. cristatus和B. bufo，加上投喂实验中G. gallus dom.的一致检测和P. ridibundus的部分检测，支持了研究假设。这些发现确认，即使在猎物DNA在粪便样本中通常降解且浓度低的挑战性条件下，猎物DNA的物种水平鉴定也是可能的。这对于浣熊等入侵性泛化捕食者尤为重要，其对本士生物多样性的影响通常难以直接量化。与宏条形码方法相比，当解决特定假设时，qPCR提供了若干方法学优势。粪便样本通常含有高度碎片化的猎物DNA以及大量宿主DNA和来自多种饮食成分的DNA。在这些条件下，靶向qPCR检测体系由于其高灵敏度和特异性，在检测单个分类群方面具有优势。相比之下，宏条形码可能受到扩增偏差、引物竞争和低模板浓度下随机效应的影响，可能导致假阴性。此外，序列读取计数与初始猎物DNA量不成正比，使存在-缺失模式的解释复杂化。虽然宏条形码能够同时检测多个分类群，但其工作流程仍然技术复杂，严重依赖生物信息学处理和参考数据库，可能限制可重复性。一旦开发，qPCR检测体系提供了一种更标准化和透明的方法，分析复杂度相对较低，特别适用于靶向监测和监管应用。尽管有这些优势，研究结果也突出了重要局限性。与常规PCR相比，定量PCR有潜力估计消耗的猎物物种数量。然而，qPCR结果无法可靠量化猎物消耗。在投喂实验期间增加G. gallus dom.的量（通过添加鸡蛋）未导致Ct值可检测的变化，表明摄入生物量与可检测DNA之间的关系并非简单直接。因此，研究结果只能定性解释为存在/缺失数据。猎物消耗的量化、消耗个体数量或区分生命阶段（如卵、幼体、成体）均不可能。先前研究表明，在猎物多样性有限的受控条件下量化可能是可行的，但在野外情况下变得越来越具有挑战性。消化率、捕食者活动、猎物类型和DNA降解的差异进一步使解释复杂化，特别是对于具有许多不同食物来源的泛化捕食者。因此，未来工作应集中在受控投喂实验上，例如类似Bowles et al. (2011)使用的设计，使用多只圈养浣熊、同一动物的多次重复以及变化的猎物组成，以更好地理解猎物摄入与可检测DNA信号之间的关系。投喂实验中P. ridibundus的不一致检测进一步表明可检测性可能存在分类群特异性差异。这种模式可能反映选择性消耗、猎物生物量差异、消化效率差异或检测体系灵敏度差异。两栖动物DNA在粪便材料中可能降解更快或丰度更低，这可能导致两栖动物捕食的低估。然而，在野外样本中成功检测到两栖动物DNA，包括稀有的T. cristatus，表明qPCR通常能够在自然条件下检测两栖动物猎物。尽管如此，在解释饮食数据时应考虑分类群之间检测概率的差异。在稀有猎物物种的繁殖和产卵期检测到它们，为浣熊捕食在局部尺度上的生态影响提供了重要见解。在研究区域，大多数粪便采集于一个小自然保护区附近，猎物物种在繁殖期间在空间和时间上集中。鉴于浣熊密度相对较高且保护区面积有限，对脆弱生命阶段如卵和幼体的捕食概率可能很高。例如，研究期间仅记录到0–3对A. strepera繁殖对，且未观察到繁殖成功。在已知繁殖地附近检测到A. strepera DNA强烈表明发生了局部捕食事件，很可能涉及卵或雏鸟。在如此小的种群中，即使单次捕食事件也可能对繁殖成功和局部种群持续性产生不成比例的影响。同样，在产卵季节检测到B. bufo表明对两栖动物的捕食，尽管数据未表明与另一项研究相比特别高的捕食压力。有趣的是，更稀有的T. cristatus以相当的频率被检测到，提出了猎物组成在多大程度上反映遭遇概率与物种特异性行为或生态特征的问题。这些发现强调，在评估入侵性捕食者的影响时，不仅需要考虑猎物可用性，还需要考虑脆弱性。粪便样本采集于自然保护区边界之外，强调了该方法的非侵入性特征。鉴于浣熊的家域通常延伸至保护区之外，沉积在相邻栖息地的粪便仍可反映对保护区内出现的稀有兩栖动物和鸟类的捕食。这突出表明，可以在不直接接触动物或不干扰脆弱栖息地的情况下获得有关敏感或受保护分类群的捕食者-猎物相互作用的可靠数据。这种方法在优先减少人类侵入的保护背景下尤其有价值。总体而言，研究表明基于qPCR的饮食分析可以为涉及入侵物种的捕食者-猎物相互作用提供有价值的见解，特别是当关注受保护关注的物种时。尽管该方法目前限于定性解释，但检测稀有物种捕食的能力代表了入侵生态学和保护管理的重要优势。当与独立的生态数据（如种群大小、繁殖活动或栖息地利用）相结合时，qPCR数据可以作为一种非侵入性方法，有助于更全面地评估局部捕食影响。结论部分翻译如下：qPCR是一种灵敏、可靠且非侵入性的方法，用于检测浣熊粪便中的脊椎动物猎物物种，包括稀有分类群。其优势在于靶向、假设驱动的应用，特别是在保护背景下，检测对脆弱物种的捕食是首要关注的问题。然而，重要局限性仍然存在，特别是关于猎物消耗的量化和潜在分类群特异性检测偏差。需要通过受控投喂实验进一步验证以解决这些挑战。尽管有这些限制，qPCR代表了研究入侵性捕食者生态影响的有价值工具，可以支持旨在减缓生物多样性丧失的循证管理策略。
