《npj Breast Cancer》：Hypermethylation in CpG-rich cfDNA fragments enables accurate detection of circulating tumor DNA in BRCA1- and BRCA2-associated breast and ovarian cancer
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致病性BRCA1与BRCA2胚系变异携带者具有遗传性乳腺癌与卵巢癌（HBOC）的升高风险。在这一高危队列中，需要新型生物标志物以支持患者管理。尽管基于游离DNA（cfDNA）的常规CpG位点平均水平分析具有前景，但在循环肿瘤DNA（ctDNA）分数较低的样本中
致病性BRCA1与BRCA2胚系变异携带者具有遗传性乳腺癌与卵巢癌（HBOC）的升高风险。在这一高危队列中，需要新型生物标志物以支持患者管理。尽管基于游离DNA（cfDNA）的常规CpG位点平均水平分析具有前景，但在循环肿瘤DNA（ctDNA）分数较低的样本中，该策略会稀释肿瘤特异性信号。本研究开发了一种靶向超深度二代测序（NGS）检测方法，基于CpG富集cfDNA片段的片段级超甲基化来检测肿瘤来源的ctDNA。研究人员从癌症基因组图谱（TCGA）乳腺癌与基因表达综合数据库（GEO）卵巢癌的450k甲基化芯片数据集中筛选出360个癌症特异性CpG富集区域组成检测panel，并采用酶法甲基化测序对31例乳腺癌、16例卵巢癌患者及26例健康对照者的血浆样本进行检测。超甲基化ctDNA（hm-ctDNA）片段在癌症病例中显著富集，在100%特异度下可识别62.5%的卵巢癌与38.7%的乳腺癌。在不同肿瘤分期中均观察到hm-ctDNA升高，且BRCA1相关病例的负荷更高。该策略可在HBOC人群中实现高特异度的非侵入性超甲基化ctDNA检测。
研究背景方面，BRCA1与BRCA2为维持基因组完整性、参与DNA损伤修复的重要抑癌基因，其致病性胚系变异显著升高乳腺癌（BC）与卵巢癌（OC）的终生风险，二者合称遗传性乳腺癌与卵巢癌（HBOC）。至80岁时，BRCA1与BRCA2携带者的乳腺癌累积风险分别约为72%与69%，卵巢癌风险分别为44%与17%；携带者20年对侧乳腺癌累积风险仍较高（BRCA1为40%，BRCA2为26%）。现有影像学监测对早期病变的敏感度与特异度有限，卵巢癌缺乏有效筛查手段，多数病例确诊时已属晚期；高级别（III级）浸润性乳腺癌中小病灶（<15 mm）的检出敏感度仅约26%；晚期卵巢癌与乳腺癌卵巢转移的鉴别亦具临床挑战。基于cfDNA的液体活检具有非侵入性优势，但基于突变的ctDNA检测受血浆中丰度低所限；DNA甲基化异常发生于肿瘤发生早期且具组织特异性，是颇具吸引力的替代标志物。现有cfDNA甲基化方法多依赖CpG位点或区域水平的甲基化平均，在ctDNA分数低的样本中易稀释肿瘤信号；而片段级、联合考虑单片段内多个CpG的分析可提升肿瘤来源cfDNA的检出。甲基化与片段结构（片段长度、末端基序）之间的关系在BRCA1/BRCA2相关癌症中尚不明确，本研究据此展开。
研究内容与结论方面，研究人员建立了靶向超深度NGS检测，以片段级超甲基化识别肿瘤来源ctDNA，并将含≥6个CpG且≥75% CpG甲基化的片段定义为超甲基化ctDNA（hm-ctDNA），据此计算hm-ctDNA负荷。结果显示hm-ctDNA片段在癌症病例中显著富集，在100%特异度下检出62.5%的卵巢癌与38.7%的乳腺癌；hm-ctDNA在不同肿瘤分期中均升高，BRCA1相关病例负荷更高，且该信号并不局限于胚系BRCA1/BRCA2携带状态。其重要意义在于：该策略为HBOC人群提供了高特异度、非侵入性的超甲基化ctDNA检测手段，指标（hm-ctDNA分数、相对健康对照的倍数变化、P值）稳健且易于临床解读，靶向设计较全基因组方法降低测序需求并支持超深度测序，有望作为高危人群监测中的补充性"rule-in"（纳入确诊）工具，并为后续临床验证奠定基础。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究人员基于TCGA乳腺癌与GEO卵巢癌（含高级别浆液性卵巢癌及BRCA1/BRCA2突变携带者输卵管伞端组织）450k甲基化芯片数据，并结合健康人cfDNA甲基化谱（GSE122126）作为背景，经统一未甲基化、癌与正常组织差值≥0.1、正常组织最大甲基化<0.2、健康cfDNA甲基化>10%者剔除等标准过滤后，将CpG按最大间距180 bp聚类，从BC、OC、泛癌（PanCan）三类各选120个区域组成360区域panel，另含24个SNP用于样本身份与质控；对20 ng cfDNA行酶法甲基化测序（EM-seq）建库，采用含甲基化唯一分子标识（UMI）的接头、定制panel杂交捕获，在Illumina NovaSeq 6000与NovaSeq X Plus平台双端测序至>10,000×深度；经SeqPurge、fgbio、Bowtie2（GRCh38）、samtools、Bismark与MethylDackel完成比对、双端一致性序列生成与甲基化判读。样本来源为商业生物样本库的健康人血样与德国图宾根大学医院妇科院内生物样本库的BC与OC患者血样（伦理批号409/2022BO2）。统计分析采用pyComBat校正批次效应，以26例健康对照建立各区域基线，区域水平以Fisher精确检验比较hm-ctDNA与norm-cfDNA片段的2×2列联表（健康样本采用留一法），组间比较用Mann–Whitney U检验并以Benjamini–Hochberg法校正，敏感度与特异度以Clopper-Pearson法计算精确95%置信区间。
研究结果方面。队列临床特征：研究纳入73例个体，包括31例乳腺癌、16例卵巢癌与26例健康对照；健康人、BC与OC的平均cfDNA浓度分别为4.19 ng/mL（范围1.37–23.72）、6.04 ng/mL（1.09–14.45）与7.77 ng/mL（3.97–18.24）；BC中7例携带（可能）致病性BRCA1、6例携带BRCA2胚系变异，2例为BRCAness；OC中5例携带BRCA1、3例携带BRCA2胚系变异；与健康对照相比，OC及BRCA1阳性患者的cfDNA浓度显著升高。Panel设计与基因组注释：基于TCGA等公开BC与OC数据，识别出360个至少含一个超甲基化CpG的区域用于panel设计，OC与BC均显著者归为泛癌；这些区域多位于CpG岛、shore与shelf，相当部分重叠启动子/转录起始位点（TSS），其次为CTCF结合位点与增强子；多个区域含成簇超甲基化CpG热点，如HSPA1A（12个CpG）、ZIC1（6个）、CDKL2（8个）、UBB（5个）、ZNF69（6个）、CLDN10（5个）、SOX1/SOX1-OT与AC002472.1（6个）。hm-ctDNA的片段组学特征：全部ctDNA片段长度呈核小体周期性分布，峰值位于160 bp、320 bp与480 bp；hm-ctDNA片段主峰约165 bp，缺乏norm-cfDNA中约145 bp的短片段峰，提示超甲基化与核小体保护片段相关。片段级超甲基化在乳腺癌与卵巢癌来源cfDNA中富集：hm-ctDNA负荷在BC（P=4.68×10?7）与OC（P=1.05×10?3）中均较健康对照显著升高；BC的2级与3级肿瘤hm-ctDNA负荷均显著高于对照（P=5.45×10?5与P=6.49×10?6），各肿瘤分期及HER2亚型亦见升高。卵巢癌样本呈现独特的片段级超甲基化模式：热图显示OC与健康对照清晰分离，对照hm-ctDNA负荷近于零；OC特异性区域负荷高于BC与PanCan来源区域，体现肿瘤类型特异性，部分I期肿瘤在部分区域的hm-ctDNA分数可达20%；样本水平上16例OC中9例（62.5%）相对对照有超过两个显著超甲基化区域；BRCA1阳性样本显著区域数更多（最多44个），BRCA2阳性者富集较弱，但BRCA1与BRCA2阴性病例亦见显著信号；跨全部区域的聚合分析识别8/16例OC（50%）显著区别于对照（P<0.05，Log2FC>1.5），在100%特异度（95% CI：86.8–100%）下敏感度为50%（95% CI：25.5–75.3%）；主成分分析（PCA）显示OC与对照部分分离，但未见按BRCA1/BRCA2携带状态聚类；末端基序分析显示OC中hm-ctDNA与norm-cfDNA差异较小，GGGA呈轻度显著富集，预设的60个基序集合在OC中呈明显耗竭（15.5%对预期23.5%），主要归因于10个基序（CGTG、AAAT、ATTG、ACGT、CATA、ATTT、GATT、ACTA、CGTA与TATG）的显著或高度显著耗竭。乳腺癌中的片段级超甲基化信号：31例BC中12例见hm-ctDNA富集，水平总体低于OC，富集样本各区域hm-ctDNA分数为5%–20%；BC与PanCan特异性区域富集强于OC特异性区域；健康对照无显著富集；样本水平上部分病例具多个显著超甲基化区域，包括2例BRCA1阳性样本与1例BRCAness病例信号尤高（最多37个区域）；聚合分析识别12/31例BC（38.7%）显著区别于对照，在100%特异度（95% CI：86.8–100%）下敏感度为38.7%（95% CI：21.9–57.8%），显著病例中以BRCA1阳性携带者与BRCAness患者居多；部分病例倍数变化升高但跨全部区域未达显著，提示panel对BC并非最优且含引入噪声的非特异区域；BC末端基序分析示CCGC轻度显著富集，与预期频率无差异（24%对23.4%）。影响hm-ctDNA负荷的临床与分子因素：BRCA1阳性样本的hm-ctDNA负荷倾向于高于BRCA2阳性及双阴性病例；BRCA1阳性伴淋巴结受累（N1）者超甲基化区域数增加，N0者富集甚微；BRCA2阳性样本hm-ctDNA水平总体较低，仅1例中度富集；1例BRCAness肿瘤负荷最高（50个显著区域），提示片段级超甲基化反映超出胚系BRCA1/BRCA2状态的肿瘤生物学特征；总体表明hm-ctDNA负荷受BRCA1状态、淋巴结受累与BRCAness等肿瘤生物学因素影响，但亚组内变异仍较大。
讨论部分总结：BC与OC仍是女性癌症相关发病与死亡的重要原因，主要受限于早期检测手段不足，OC尤为突出；携带致病性BRCA1/BRCA2变异者风险显著升高且具异质性。液体活检除早期检测外，在晚期疾病中亦有望用于监测肿瘤负荷、发现复发与刻画转移异质性。本研究在既往cfDNA甲基化诊断潜力与片段级超甲基化检测方法基础上，与既往方法的关键差异在于：采用源自既有肿瘤数据的靶向panel而非低覆盖全基因组策略；靶向设计支持超深度测序（>10k覆盖），结合UMI纠错使敏感度主要取决于独特分子的回收而非测序错误；聚焦CpG富集片段以实现稳健的片段级超甲基化检测；相较既往片段级超甲基化方法采用二分类策略（超甲基化与非超甲基化cfDNA片段）而非机器学习，便于采用稳健、易解释的统计方法并适用于小样本队列。尽管超甲基化常被认为与晚期相关，但启动子超甲基化与抑癌基因表观沉默是乳腺癌发生的早期事件，超深度测序有望检出早期低肿瘤负荷下的特征性改变。本研究中片段级超甲基化在BC与OC患者cfDNA中持续富集，可在100%特异度下与健康对照区分，且超甲基化区域大体呈肿瘤类型特异性。敏感度虽中等（BC 38.7%，OC 50%），但与若干已建立的液体活检方法相当或更优：CancerSEEK对BC敏感度为33%，全基因组片段化分析DELFI在98%特异度下敏感度为57%，Galleri甲基化检测在99.5%特异度下对BC敏感度为30.5%；提示该HBOC特异性panel对BC具竞争力并保持本队列中的完美特异度，而高特异度对BRCA1/BRCA2携带者等高危人群（验前概率升高）的筛查项目具有价值，可作为监测体系中的补充性"rule-in"检测，与影像筛查联合或改善早期检出。研究人员未检索到卵巢癌片段级超甲基化cfDNA检测的已发表结果，本研究在OC中信号更强：样本水平敏感度50%（跨全部panel区域），按每样本至少两个显著区域计为62.5%；区域富集热图便于通过视觉识别OC病例；富集集中于OC特异性区域有利于设计更小、更特异的OC筛查panel，值得在更大队列中重复验证。hm-ctDNA负荷与临床特征的关联支持其生物学相关性：BRCA1相关肿瘤、BRCAness特征及淋巴结受累者负荷更高，与肿瘤负荷增加及基因组不稳定一致；部分BRCA1与BRCA2阴性肿瘤亦见强信号，提示方法适用性更广。在生物学层面，hm-ctDNA片段富集于约165 bp且缺乏低甲基化区域常见的短片段峰，与低甲基化区域因核酸酶可及性增加而优先产生短片段的既往报道一致，并进一步提示超甲基化区域贡献较长、受核小体保护的cfDNA片段，强化了表观遗传状态与cfDNA结构的联系；末端基序方面OC中部分既往报道基序耗竭，若在独立队列验证可能具信息价值，但与片段级超甲基化相比判别力有限，提示小靶向panel来源的片段组学特征提供互补信息但不足以作为主要生物标志物，而全基因组片段组学表现更强，或可与甲基化方法联合提升敏感度。局限性包括：队列较小且晚期肿瘤富集，可能限制外推性且未充分反映早期情形，OC仅可获得3级肿瘤；对照队列规模有限，无法建立稳健的健康人甲基化范围，阈值在更大筛查队列中可能需调整；分析聚焦超甲基化区域，可能遗漏有信息的低甲基化信号；360个目标区域中相当部分无信号，提示进一步优化区域可提升性能；片段组学特征虽在肿瘤来源cfDNA中富集，但单独对分类贡献有限，需在更大队列验证；100%特异度基于零例对照判为阳性，但健康对照数有限致置信区间较宽（如OC的95% CI：86.8–100%），无法确定在数千人规模人群筛查中的特异度。半数受检患者未显示显著特征性甲基化谱，敏感度或可通过整合甲基化与片段组学标志及基于ctDNA的特征性致癌变异（如BRCA1/BRCA2胚系风险变异携带者的二次打击）检测而提升，但会显著增大panel规模，扩展的多特征cfDNA分析可弥补单一标志物策略的不足；本研究采用基于panel的EM-seq联合超深度NGS，未与其他方法敏感度直接比较，但酶法与亚硫酸氢盐转化结合NGS或ddPCR的深入比较此前已有报道。尽管存在上述局限，本研究提供了片段级超甲基化作为HBOC中ctDNA检测的具有生物学意义的生物标志物的有力证据；靶向设计较全基因组方法降低测序需求并支持超深度测序，使该策略可能更敏感、可扩展且具成本效益；未来应在纵向与前瞻性筛查场景中评估，尤其针对BRCA1与BRCA2突变携带者等高危人群。结论翻译：总之，研究人员提出了一种靶向超深度测序并检测CpG富集cfDNA片段超甲基化的方法，可在乳腺癌与卵巢癌患者中准确检测肿瘤来源cfDNA。通过在CpG富集cfDNA片段中以超深度NGS考察CpG甲基化比例，该方法捕获了常规CpG水平分析无法获得的协同表观遗传模式。尽管敏感度仍属中等，该方法的高特异度与临床可解释性凸显其作为非侵入性癌症检测补充工具的潜力，尤其在高危人群中。这些发现确立了血浆中肿瘤来源CpG富集cfDNA的超甲基化作为液体活检分析中颇具前景的新维度，并为未来临床验证研究奠定基础。
