羟基红花黄色素A通过Keap1候选互作减轻HT22细胞铁死亡相关损伤

《Antioxidants》：Hydroxysafflor Yellow A Protects HT22 Cells Against Ferroptosis-Associated Injury with Keap1 as a Candidate Interaction Partner

　　

羟基红花黄色素A（HSYA）是红花（Carthamus tinctorius L.）的生物活性成分，具有抗氧化和细胞保护特性。在RSL3攻击的海马来源细胞中，Keap1是否为HSYA的候选互作伙伴尚未明确。研究人员采用活力、线粒体、铁、氧化应激、脂质过氧化及蛋白检测方法，考察了暴露于RSL3的小鼠HT22细胞。HSYA预处理后继续与RSL3共孵育，可维持细胞活力与线粒体超微结构，并减轻不稳定Fe2+蓄积、活性氧（ROS）及脂质过氧化。上述变化伴随SLC7A11与GPX4丰度升高、ACSL4降低，以及RSL3诱导的HO-1升高被减弱。HSYA处理还与核内Nrf2增加及经GAPDH归一化的p-GSK-3β（Ser9）信号升高相关。分子对接、DARTS、基于裂解液的CETSA及低振幅SPR响应提供了互补的探索性证据，与HSYA–Keap1相互作用相符。上述发现支持HSYA对铁死亡相关损伤的保护作用，并提示Keap1为候选互作伙伴。将细胞保护作用与探索性互作证据相结合，推进了HSYA的药理学表征，并为进一步研究其神经保护潜力提供了可检验的分子假说。

研究背景方面，氧化应激、铁稳态失衡与脂质过氧化参与包括阿尔茨海默病（AD）在内的神经退行性疾病中的神经元损伤，这些过程与铁死亡（一种依赖铁、以磷脂过氧化过度为特征的调节性细胞死亡）密切相关。实验性破坏神经元抗氧化防御（如谷胱甘肽过氧化物酶4，GPX4）可导致脂质氧化损伤与神经退行性变，因此有必要研究针对铁死亡相关细胞损伤具有保护作用的化合物。核因子E2相关因子2（Nrf2）调控抗氧化反应及谷胱甘肽代谢、铁稳态相关过程，其稳定性受多重机制控制：基础条件下Kelch样ECH相关蛋白1（Keap1）作为含CUL3泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白促进Nrf2降解；糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）则可通过不依赖Keap1的机制经β-TrCP促进Nrf2降解，二者属不同调控途径，不应被理解为单一线性Keap1–GSK-3β–Nrf2通路。HSYA在脑缺血/再灌注模型中显示保护作用，既往研究也报道其在氧糖剥夺PC12细胞及缺血性卒中模型中减轻铁死亡相关损伤；但HSYA在明确的RSL3攻击下对海马来源HT22细胞的保护是否伴随Keap1可能与之互作的互补证据，以及如何在不预设单一因果通路的前提下解读Keap1、GSK-3β与Nrf2变化，仍不清楚。为此研究人员开展本研究，得出HSYA减轻HT22细胞铁死亡相关损伤、并提供Keap1为候选互作伙伴的探索性证据的结论；其意义在于将细胞保护表型与探索性互作证据结合，推进HSYA药理学表征，并提供可检验的分子假说，同时明确指出未确立Keap1依赖的保护作用或Nrf2调控通路的必要性。

技术方法上，主要包括：网络药理学与生物信息学分析（SwissTargetPrediction、TCMSP、GeneCards、FerrDb靶点检索，STRING蛋白互作网络构建，GO、KEGG与Reactome富集分析）；细胞活力（MTT）与形态学观察、透射电子显微镜（TEM）线粒体超微结构评价；细胞内活性氧（ROS）、不稳定Fe²⁺与脂质过氧化荧光检测及MDA、GSH/GSSG比值、SOD生化测定；免疫荧光与Western blot蛋白分析；分子对接；药物亲和响应靶点稳定性（DARTS）实验；基于裂解液的细胞热位移分析（CETSA）；表面等离子共振（SPR）。细胞为小鼠海马来源HT22细胞（iCell，上海），人体靶点注释仅用于提供背景，未作为实验验证证据。

研究结果：第一，网络药理学与生物信息学分析鉴定出铁死亡相关HSYA靶点。HSYA预测靶点、AD相关基因与铁死亡相关基因交集得到14个人源注释靶点，富集分析包括铁死亡与KEAP1–NFE2L2通路；KEAP1并非交集命中，系依据通路注释及其在Nrf2调控中的既定作用而检测，该计算分析属假说生成性质。第二，HSYA在RSL3处理的HT22细胞中维持细胞活力并减轻线粒体结构损伤。HSYA单独1–50 μM不影响活力；RSL3（0.5 μM，24 h）使活力降至对照约40%，10与30 μM HSYA预处理并持续共孵育使活力分别升至81.3%与92.7%，故选用30 μM；TEM显示RSL3致线粒体皱缩、电子密度增高及嵴减少或破坏，HSYA组改变较轻。第三，HSYA减少铁蓄积、氧化应激与脂质过氧化。RSL3升高细胞内不稳定Fe²⁺与ROS信号，C11-BODIPY图像定性显示氧化荧光增强；HSYA降低Fe²⁺与ROS荧光强度，降低MDA、提高GSH/GSSG比值并部分恢复SOD活性，减弱RSL3诱导的HO-1升高；FTH1/GAPDH均值在两组攻击组均高于对照，但RSL3+HSYA组显著低于RSL3组（Tukey校正p=0.0484）。第四，HSYA升高SLC7A11与GPX4蛋白丰度并降低ACSL4。免疫荧光与Western blot均显示HSYA使GPX4升高、ACSL4降低，SLC7A11与GPX4丰度较单用RSL3升高（p<0.001），ACSL4降低（p<0.01）。第五，HSYA增加核内Nrf2蓄积及经GAPDH归一化的p-GSK-3β（Ser9）信号。免疫荧光与Western blot均显示HSYA后核内Nrf2增加；全细胞总Nrf2在RSL3后降低、HSYA后较单用RSL3升高，组间效应显著（F(2, 9)=24.54，p<0.001），三组两两比较均显著；HSYA还使Keap1丰度及经GAPDH归一化的p-GSK-3β（Ser9）信号升高，因未以总GSK-3β归一化，该结果不量化磷酸化比例或激酶活性，上述观察不建立Keap1、GSK-3β与Nrf2间的因果关系。第六，互补实验为HSYA–Keap1互作提供探索性支持。分子对接预测HSYA在Keap1口袋内的可能结合构象，对接评分为?9.828 kcal/mol；DARTS显示HSYA浓度依赖性保护Keap1免受Pronase E消化；基于裂解液的CETSA显示HSYA（30 μM）使可溶性Keap1表观热位移约7.7 °C；SPR响应随HSYA浓度（0.025–1.56 μM）升高，对晚期结合期均值进行单点拟合得表观KD约0.4 μM，但低振幅响应与未验证的平衡平台限制该估计，不能视为已验证的结合亲和力。

讨论部分总结：HSYA减轻HT22细胞RSL3诱导的损伤表型，活力与线粒体形态得以保持，不稳定Fe²⁺、ROS、脂质氧化与MDA降低；SLC7A11与GPX4升高、ACSL4降低与较低脂质过氧化负荷相符，因蛋白分别参与胱氨酸供给、脂质过氧化物解毒及可氧化脂肪酸掺入磷脂。本研究未使用ferrostatin-1、liproxstatin-1或铁螯合救援，故表型宜描述为铁死亡相关损伤而非确定性铁死亡。蛋白与定位结果提示抗氧化反应改变但未界定单一上游途径：p-GSK-3β以GAPDH而非总GSK-3β归一化，不量化相对磷酸化或激酶活性；GSK-3β/β-TrCP与Keap1/CUL3为Nrf2周转的不同途径，故p-GSK-3β信号与Keap1丰度应作为与核内Nrf2相关的平行观察，而非线性Keap1–GSK-3β–Nrf2级联的证据；总Keap1丰度不反映其底物结合或泛素连接酶功能；HO-1变化伴随氧化应激负荷降低，其功能贡献与因果作用未确立；FTH1的功能贡献亦待确定。Keap1作为候选互作伙伴，对接为预测性、裂解液稳定性实验不能确立完整细胞内的功能必要性，未建立Keap1依赖的保护或Nrf2泛素化改变。解释受模型与缺失扰动限制：人源注释网络预测与小鼠来源HT22细胞的部分蛋白及互作读数相比较，种间同源性不保证表达或通路行为等同；RSL3模型不重现AD细胞环境；铁死亡抑制剂救援、Keap1或Nrf2功能缺失、Keap1–Nrf2结合与泛素化实验及更强正交亲和力测定有待开展；原始靶点预测查询与富集背景基因全集不可得，计算结果为假说生成性。研究结论翻译：总之，HSYA减轻HT22细胞铁死亡相关损伤，并有Keap1互作的探索性证据；核内Nrf2蓄积与经GAPDH归一化的p-GSK-3β（Ser9）信号为相关观察，后者不量化相对总GSK-3β的磷酸化或激酶活性；未证明Keap1结合或Nrf2调控途径为保护作用所必需。