基于一维光子晶体表面波二维成像生物传感器的无标记原位定量表征：APTES涂层均匀性与蛋白质结合容量的功能评价

《Biosensors》：Homogeneity and Protein-Binding Capacity of APTES Coatings: Quantitative In Situ Characterization by a Label-Free Imaging Biosensor

功能涂层（厚度、密度、均匀性）的形貌决定无标记生物传感器分析的准确性与可重复性，然而涂层质量通常是在分析条件之外间接评估的。研究人员描述了一种利用生物传感器自身响应进行涂层功能评估的原位方法，该方法基于具有二维成像能力的一维光子晶体中的表面波。在戊二醛活化和蛋白质固定化的一个循环中，研究人员测定了吸附容量、通道间均匀性、流动稳定性和表面密度。在反应中心多重过量的条件下，饱和结合信号对功能基团的局域密度不敏感。在一系列3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）涂层上，吸附容量和均匀性 critically 依赖于溶剂组成，溶液前沿延迟图将涂层不均匀性与传质区分开来。对于在乙醇中40%乙酸溶液中形成的优化涂层——其中低含水量和酸性抑制了APTES的自缩合——牛血清白蛋白的表面浓度达到1.98 mg/m²，为致密的侧向单层，变异系数为1.2%。结果通过IgG固定化和链霉亲和素–生物素结合得到证实。该方法能够实现生物功能化的非侵入式控制。

研究背景方面，疾病诊断、药物研发和生物技术过程控制均需要快速灵敏的生物分子相互作用分析，光学无标记生物传感器可满足这一需求。此类传感器的响应由光子换能器和功能涂层两个要素构成：换能器设定场分布与灵敏度，而涂层形貌（厚度、密度、均匀性）决定结合事件如何转化为可测信号。配体在生物芯片表面的固定主要依赖功能涂层，分析的准确性、可重复性和可靠性正是在生物功能化阶段奠定的。然而多数工作中涂层质量仅被间接评估——只要检测到分析物信号即认为功能化已完成，完整的生物功能化表面表征在大多数研究中并未实施。传统表面分析方法直接应用于工作生物芯片存在局限：原子力显微镜仅测量局域微区粗糙度与厚度，无法判断宏观均匀性；绝对表面浓度测定需要校准或标记；X射线光电子能谱在超高真空下对干燥样品离位测量且仅探测有机膜外侧约10 nm；耗散型石英晶体微天平虽可原位流动测量但记录整个活性区域的积分质量变化，不能区分功能性活性配体与非特异性吸附物质，且因记录流体力学结合溶剂而系统性高估水化蛋白质层质量；荧光显微镜需要可能扰动被测相互作用的标记；接触角表征润湿性和修饰事实而非硅烷基团的排列与密度；经典椭偏术在毫米级光斑上平均膜厚，无法分辨更小的横向不均匀性。上述局限在具有二维信号成像的光学生物传感器中很大程度上不存在，此类传感器可在实时流动状态下测定活化与固定化阶段所形成层的厚度和表面密度，并控制涂层空间均匀性及其抗冲洗稳定性。广泛使用的表面等离子体共振成像生物传感器使用金膜，其修饰化学与氧化物表面化学根本不同；而基于光子晶体表面波的生物传感器外工作层为二氧化硅，允许应用标准硅烷化方案并在工作生物芯片上直接评估涂层。功能涂层分为平面型单层固定化与基于块体水凝胶基质的三维型两类，后者吸附容量可达平面表面的多倍，但代价是涂层厚度增至约百纳米量级，与114 nm的表面波场穿透深度相当，水凝胶溶胀本身对光信号产生显著寄生贡献，这决定了需要单层型薄涂层。该涂层类别中最广泛的官能化方法仍是用APTES硅烷化后经戊二醛等双功能交联剂偶联氨基，但氨基硅烷层性质强烈依赖沉积方法，甚至化学相似的层在均匀性和结合动力学上也可能明显不同。氨基硅烷涂层的主要缺陷与聚硅氧烷聚集体形成有关：除水解硅烷与表面羟基的共价结合外，硅醇基团彼此间的竞争缩合同时进行，偏离最优条件时表面形成仅靠弱相互作用维持的聚硅氧烷聚集体，聚集体内部氨基可能因位阻无法接近而降低吸附容量，弱结合部分被缓冲液流冲洗表现为基线负漂移，聚集体形成的随机性决定涂层空间不均匀性并严重妨碍可靠的多重分析。因此本研究提出并在一系列APTES涂层上检验一种利用生物传感器自身响应进行涂层功能评估的原位方法，变化参数包括溶剂组成、含水量和酸度以及额外的超声与热处理，评估在用于生物分析的生物芯片和流动池上、在包含戊二醛活化和牛血清白蛋白（BSA）固定化的一个循环内完成，目标是证明生物传感器自身二维配准响应在此循环内无需外部表面分析方法即可比较硅烷化方案并合理选择最优方案。

研究人员开展的研究及结论与意义：研究在一维光子晶体表面模式（PC SM）生物传感器EVA 3.0上进行，其分析信号为表面波共振条件的变化，在二维配准模式下对生物芯片众多局域区域独立测定共振波长，响应以共振波长漂移（nm）表示。研究得出，生物传感器自身基于光子晶体表面波并具二维成像的响应可在原位评估生物芯片功能涂层而无需外部表面分析；所提出的含参考水平的容量标尺——仪器极限（噪声0.9 pm，变异系数2.2%）、非特异性吸附（0.60 nm）和BSA单层堆积极限（0.81–1.31 nm）——使评估具有定量性和可重复性；在一系列APTES涂层上，该方法按层的流动稳定性、容量（0.09–1.14 nm）和均匀性（变异系数1.2–79%）区分方案，并揭示容量来源的迹象——中性水相方案中容量与信号衰减成比例关联而乙酸溶液中无此关联；二维图将涂层贡献与传质贡献分开（饱和时涂层不均匀性为1.2%，不完全填充时96%的信号方差落在沿流方向）；在乙醇中40%乙酸溶液形成的涂层提供致密BSA单层，整个工作区域反应中心储备不少于20倍，故饱和状态下多重格式的信号不依赖涂层密度的局域波动，无需对局域硅烷化密度进行精密控制。该方法针对一种连接化学（氨基的戊二醛活化）和模型蛋白质系统进行了检验，其应用于血清等复杂生物样品是后续工作；涂层自身不均匀性评估的准确性受仪器贡献（变异系数2.2%，以平方和方式扣除）限制，仍希望用正交方法独立核验；在此限制下该方法可迁移至其他具有空间成像和氧化物工作表面的倏逝平台，也可用于其制造过程中的生物功能化来料控制。

关键技术方法概括：研究采用基于一维光子晶体表面模式激发、具二维空间成像的无标记光学生物传感器EVA 3.0，以共振波长漂移作为分析信号并在各像素独立测定；生物芯片为玻璃板上的一维多层光子晶体，外工作层为二氧化硅，置于BK-7棱镜上并构成流动池底部，以蠕动泵输运溶液；表面经低压等离子体羟基化与清洗后按多种方案硅烷化（变化施用方式、溶剂、APTES浓度、超声与热处理），经戊二醛活化后固定化BSA，并以链霉亲和素–生物素-HRP及IgG体系验证；采用6×6矩阵区域的信号散度评估均匀性，以溶液前沿到达延迟图与双因素方差分解区分涂层不均匀性与流动池流体力学贡献，并通过薄层近似下的de Feijter关系将光谱漂移换算为表面浓度（BSA取M = 66.5 kDa、折射率增量0.1866 mL/g）。

研究结果方面：3.1 系统仪器特性与参考信号水平——在羟基化和清洗后的对照未修饰光子晶体表面上预先测定仪器特性为基线噪声0.9 pm、漂移+0.001 nm/min、对PBS体积响应的通道间变异系数2.2%；容量标尺下限由未修饰表面上BSA（1 mg/mL水溶液）的非特异性吸附设定为0.60 ± 0.18 nm（变异系数15.4%），上限按不同堆积的BSA单层计算：随机顺序吸附为0.81 nm，按4 × 14 nm包围尺寸矩形堆积的致密侧向堆积为1.14 nm，椭圆投影六方堆积为1.31 nm，由此确定信号低于0.60 nm无优于非特异性吸附、约0.81 nm对应随机 seating 单层、达到1.04 nm在误差内即为致密单层饱和。3.2 硅烷化条件变化下涂层质量的比较评估——对一系列表面修饰方案进行测试，在水和有机溶剂（包括冰乙酸）中形成的涂层容量处于非特异性吸附水平（不超过0.74 nm，变异系数10–79%），部分情况下因层在缓冲液流中快速降解而无法记录结合；最佳容量与均匀性在乙酸的水溶液和醇溶液中获得，吸附信号从0.28至1.14 nm变化，饱和组成在无负漂移时变异系数为1.2–5.4%；三种组成达到饱和水平，即乙醇中40%和20%乙酸（AcOH）中的1% APTES（1.14 ± 0.05和1.03 ± 0.23 nm）及60%乙酸水溶液（1.08 ± 0.10 nm），80%乙酸水溶液和醇溶液组成达到随机 seating 水平（0.82 ± 0.03和0.89 ± 0.18 nm），低于非特异性水平的信号（冰乙酸0.09 nm，6%醇相和40%水相组成0.28–0.29 nm）表明表面被可及功能基团过少的层钝化；容量、通道间变异系数和芯片间可重复性可独立表征和优化方案，容量接近的组成在均匀性上存在差异（60%水相和40%醇相组成变异系数分别为3.1%和1.2%，80%的为12.2%和5.7%）；三次重复下三种饱和组成间平均容量差异（1.03–1.14 nm）与个体散度（至±0.23 nm）相当，本身不足以排序，40%醇相组成因实验间散度最小（±0.05 nm对±0.23和±0.10 nm）和通道间变异系数最小（1.2%对5.4%和3.1%）而被选择；丙酮涂层容量在实验间变化达四倍（0.15–0.60 nm），变异系数至79%，可能归因于吸湿性溶剂从空气吸收水分。3.3 决定涂层质量的因素与最优修饰条件的选择——对所有水相硅烷化变体，容量增长伴随信号流动衰减成比例增加（衰减与容量比0.25–0.35），与弱结合聚硅氧烷聚集体被缓冲液冲走一致；乙酸组成则相反，饱和容量（至1.14 nm）在无负漂移下达到；与中性水不同，6%乙酸水溶液形成的层在100 °C退火时剧烈降解，无BSA结合记录且基底出现宏观缺陷，因此最终方案不采用热固化；乙酸水溶液与醇溶液间的差异符合涂层质量关键取决于水解与缩聚速率之比（由含水量和pH设定）的认识，冰乙酸中水与APTES摩尔比（1.3–6.4）与化学计量比（3:1）相当，在此范围低端水甚至不足以完全水解三个乙氧基，故层稳定但几乎无可及氨基；混合溶液中水始终过量（至少为化学计量三倍），但相同酸体积分数下乙醇混合物含水量比水相少25倍，使最优乙酸浓度从水中的60%移至乙醇中的20–40%；基线噪声作为硅烷层质量的独立指标，仅在提供表面饱和的组成上记录到不高于2.9 pm的噪声值（其他介质为3.1–8.0 pm），是薄致密膜的特征；容量、冲洗稳定性和空间均匀性的最优组合由乙醇中40% AcOH溶液形成的涂层显示，其在容量（1.14 ± 0.05 nm对0.74 ± 0.07 nm）和均匀性（变异系数1.2%对10%）上优于此前用于PC SM生物芯片并在此重现的水相方案，强烈解吸被几乎为零的基线漂移取代（+0.001 nm/min对?0.175 nm/min）；固定的共价性质由对照实验证实，无戊二醛活化时BSA容量（0.68 ± 0.05 nm）与物理吸附相符，而含1% Tween 20的IgG在活化涂层冲洗后约79%保留，未修饰表面约47%、未活化APTES约31%。3.4 分析信号的二维成像与空间不均匀性因素分析——对最终涂层构建了戊二醛活化（醛基分布）和BSA固定化（最终蛋白质密度）的信号图及相应溶液前沿到达延迟图；GA活化平均信号为0.085 nm（变异系数26%），随后BSA结合为1.143 nm（变异系数1.2%，扣除仪器贡献前为2.5%），活化基团的显著不均匀性未在蛋白质图中重现（36个区域相关系数低）；横截面行平均剖面显示，当活化基团密度在均值81–136%范围变化（个别区域38–146%）时，结合蛋白信号仅在96–102%内变化，最小密度区域（= 0.032 nm）BSA吸附响应达1.118 nm（均值98%），最大密度区域（= 0.124 nm）为均值96.7%，即醛基少四倍的区域结合蛋白多于最大密度区域，故蛋白质层完全饱和的阈值活化密度肯定低于芯片上最小局域密度；按化学计量估计，即使在GA信号最小区域，每个BSA分子面积上也约有40个结合GA分子，为结合中心20–40倍过量，而1–2个共价键足以可靠固定球蛋白；在低于饱和的降低BSA浓度下，填充为饱和单层的48%，平均信号增量0.548 nm、变异系数23%，比饱和时空间散度大一个数量级以上；沿流与跨流方向的方差分解揭示两种分布主要梯度的独立性——活化信号71%方差落在横向、仅5%在纵向，而低浓度固定化96%沿流分布、2%跨流，每种分布主要沿自身方向显现，故GA与BSA信号方差由独立物理机制形成，非饱和时结合图由流体力学设定，涂层不均匀性向信号的转化只能在饱和状态下检验；固定化剖面与流体力学前沿到达延迟图呈强负相关，区域相对流向的位置解释信号方差的90%，与GA活化图无相关；吸附幅度从流动池入口到出口单调下降（0.787至0.376 nm，因子2.1），幅度对数与溶液在芯片上方停留时间线性相关，即结合密度沿流指数衰减，入口处计算分子通量约为扩散极限的三分之一，结合在混合动力学–扩散区进行，故低浓度时空间分布由比色皿流体力学设定，涂层局域性质不显现；固定化的高空间均匀性和响应对功能基团局域密度的独立性在从磷酸盐缓冲盐水（PBS）固定化BSA时也得以保持；对模拟两阶段“受体–分析物”分析的链霉亲和素–生物素系统，链霉亲和素（0.1 mg/mL PBS）固定化平均信号为0.740 nm（变异系数13.1%），在几乎整个注射期间线性增长（1.15 pm/s）即未达饱和，87%通道间方差落在沿流梯度上，随后生物素-HRP偶联物（0.01 mg/mL）结合给出0.080 nm且散度近半（变异系数7.0%），两阶段间无空间相关，受体图解释分析物信号方差不足10%，无相关表明共价固定化时限制机制不同，可能是可及生物素结合位点的多重过量，偶联物容量由其尺寸而非受体密度设定。3.5 涂层的定量评估——最终涂层信号按单一程序换算为表面浓度，水中BSA饱和信号（1.143 nm）对应等效层厚4.02 nm、表面浓度1.98 mg/m²及每个分子占据约19 nm²（侧向取向球蛋白投影），该密度处于中子反射测定的氧化硅上致密白蛋白单层范围1.8–2.0 mg/m²内；GA活化信号（0.085 nm）对应约1.2 mg/m²和结合GA分子密度约7.2 nm^?2，即芯片平均每个BSA分子面积约100个结合分子、最小密度区域不少于39个，因1–2个键足以锚定球蛋白，固定化极限密度由蛋白质空间堆积而非反应中心数目设定；独立实验间GA信号从0.08至0.28 nm（1.7–6.0 mg/m²）变化，上界超过氨基硅烷单层的2.1–2.9 mg/m²，可能反映GA在水溶液中的寡聚化；其他体系支持同一图景，缓冲液中BSA的0.724 nm对应1.33 mg/m²（约致密堆积的63%），符合远离等电点时增强的静电排斥，链霉亲和素0.740 nm对应1.35 mg/m²（约为生物素化单层最大值的57%），与未饱和一致，生物素-HRP偶联物和IgG的结合在所有体系中均表明固定化密度不受活化基团数目限制（每个蛋白质面积100–300个结合GA分子）。

讨论与结论部分总结：研究提出的含参考水平的容量标尺使涂层评估具有定量性和可重复性，方法可按流动稳定性、容量和均匀性区分APTES方案，并揭示中性水相方案中容量与信号衰减成比例关联而乙酸溶液中无此关联，表明容量来源的差异；二维图将涂层贡献与传质贡献分开，饱和时涂层不均匀性为1.2%，不完全填充时96%信号方差沿流分布；乙醇中40%乙酸溶液形成的涂层提供致密BSA单层（1.98 mg/m²），整个工作区域反应中心储备不少于20倍，故多重格式下饱和信号不依赖涂层密度局域波动，无需精密控制局域硅烷化密度；该方法针对一种连接化学和模型蛋白质系统检验，应用于血清等复杂样品是后续工作，涂层自身不均匀性评估准确性受仪器贡献（变异系数2.2%，平方和扣除）限制，仍希望正交方法独立核验，在此限制下方法可迁移至其他具空间成像和氧化物工作表面的倏逝平台并用于制造中的来料控制。研究结论译文：基于具有二维成像的光子晶体表面波的生物传感器自身响应，可在原位评估生物芯片的功能涂层而无需外部表面分析方法；所提出的含参考水平的标尺——仪器极限（噪声0.9 pm，变异系数2.2%）、非特异性吸附（0.60 nm）和BSA单层堆积极限（0.81–1.31 nm）——使评估具有定量性和可重复性；在一系列APTES涂层上，该方法按层的流动稳定性、容量（0.09–1.14 nm）和均匀性（变异系数1.2–79%）区分方案，并揭示容量来源的迹象——中性水相方案中容量与信号衰减成比例关联而乙酸溶液中无此关联；二维图将涂层贡献与传质贡献分开（饱和时涂层不均匀性为1.2%，不完全填充时96%的信号方差落在沿流方向）；在乙醇中40%乙酸溶液形成的涂层提供致密BSA单层（1.98 mg/m²），整个工作区域反应中心储备不少于20倍，故饱和状态下多重格式的信号不依赖涂层密度的局域波动，无需对局域硅烷化密度进行精密控制；该方法针对一种连接化学（氨基的戊二醛活化）和模型蛋白质系统进行了检验，其应用于血清等复杂生物样品是后续工作；涂层自身不均匀性评估的准确性受仪器贡献（变异系数2.2%，以平方和方式扣除）限制，仍希望用正交方法独立核验，在此限制下该方法可迁移至其他具有空间成像和氧化物工作表面的倏逝平台，也可用于其制造过程中的生物功能化来料控制。