纳米壳聚糖（NCH）处理三种炭疽菌（C. chrysophilum、C. siamense和C. fructicola）的转录组测序及分析

《Polysaccharides》：Transcriptome Sequencing and Analysis of Three Colletotrichum Species (C. chrysophilum, C. siamense, and C. fructicola) in Response to Nanochitosan

纳米壳聚糖（NCH）此前已被证明对从受感染的Mangifera indica叶片和果实中分离的炭疽菌属物种（C. chrysophilum、C. siamense和C. fructicola）具有抗真菌活性。然而，该植物病原真菌对NCH的分子响应仍不清楚。本研究的目的是利用RNA测序（RNA-seq）研究NCH处理/未处理炭疽菌属物种的基因表达谱，以深入了解其分子响应。用于RNA-seq的样品取自各炭疽菌属物种的菌丝体，分别设为未处理（对照）或用NCH（2 mg/mL）处理。通过MGISEQ-2000平台测序获得C. chrysophilum、C. siamense和C. fructicola的转录组。结果显示，从叶片中分离的基因中分别有1787个（C. chrysophilum）、362个（C. siamense）和3156个（C. fructicola）基因，以及从果实中分离的3976个（C. fructicola）基因存在差异表达。功能注释表明，与真菌侵染过程及NCH响应机制相关的差异表达基因（DEGs）主要参与细胞壁修饰和氧化应激响应。研究结果表明，NCH通过改变真菌细胞壁完整性和减轻氧化应激发挥作用。这些发现在三种炭疽菌属物种中相似，提示存在保守机制。尚需进一步研究以支持这一假设。

研究背景方面，芒果（Mangifera indica L.）是全球广泛消费的水果，具有突出的营养价值和风味，被视为全球五大经济重要果树之一，2025年墨西哥芒果产量达240万吨，位居全球第四大生产国和主要出口国。芒果属于呼吸跃变型（climacteric）物种，采后成熟加速、乙烯产生增强，有利于微生物尤其是植物病原真菌的增殖。炭疽菌属（Colletotrichum）是芒果果实中最常见的植物病原真菌属之一，可引起炭疽病（anthracnose），这是芒果最具破坏性的真菌病害，在全球所有芒果产区均可发生，采前和采后均可侵染叶片、枝条、花穗和果实，在湿润或多雨地区产量损失可达30%至100%。目前控制炭疽病需要将杀菌剂与采后处理（如热水处理）相结合，但合成杀菌剂的使用日益受到限制，因其导致果实化学残留积累、微生物耐药性及树木生理改变等问题，这凸显了对可持续采后管理替代方案的需求。壳聚糖（chitosan）是一种源自甲壳素的生物聚合物，由2-氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖和2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖单元通过β-(1→4)-糖苷键连接而成，已被证明对多种炭疽菌属物种引起生长抑制，且无毒、环境安全，可作为生物刺激剂和宿主防御机制的诱导剂。研究人员近期的研究表明，纳米壳聚糖（NCH，尺寸在200至1500 nm之间的壳聚糖纳米颗粒）相比微米颗粒形式的壳聚糖增强了对C. chrysophilum和C. musae的抗真菌活性，据报道NCH影响真菌细胞壁和质膜的完整性、降低氧化应激水平并影响孢子和菌丝，但炭疽菌属物种对壳聚糖响应的机制仍不清楚。因此，本研究旨在研究NCH处理的炭疽菌属物种（C. chrysophilum、C. siamense和C. fructicola）的基因表达谱，以深入了解其分子响应，研究结果将有助于通过整合抑制活性分析和分子响应分析，开发更安全、更有效的基于NCH的真菌病害控制处理方法，用于未来的农业食品应用。

在研究方法上，研究人员用到的主要关键技术方法包括：商业购买的NCH通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线荧光光谱（XRF）、动态光散射（DLS）等进行理化表征；供试菌株C. chrysophilum（PV091690.1）和C. siamense（PV091692.1）来自表现炭疽病症状的芒果叶片，C. fructicola（PV091696.1、PV091694.1、PV091691.1）来自受感染的叶片和果实，菌株由Valenzuela-Ortiz等（2022）先前从墨西哥格雷罗州Cuanajilipan地区2019年生长季采集的样品中分离鉴定，序列存于NCBI数据库；菌株在含或不含NCH（2 mg/mL，pH 5.6）条件下于25 °C培养10天，菌丝体收集后液氮速冻并保存于?80 °C；总RNA提取后构建cDNA文库，在MGISEQ-2000平台以双端模式（2 × 150 bp）测序；原始读数经Trimmomatic-0.36质控后用HISAT2比对到参考基因组，采用DESeq2 v1.50.2进行差异表达分析（log2倍数变化（FC）≥ 1且Q值 < 0.05），并通过PANTHER进行基因本体（GO）功能注释、KEGG自动注释服务器（KAAS）进行KEGG通路富集分析。

研究结果方面，3.1 NCH表征：FT-IR光谱显示3356 cm?1处–OH基团伸缩振动、2870 cm?1处–CH基团伸缩振动，1652 cm?1（酰胺I的C=O）、1583 cm?1（酰胺II的–NH?）和1370 cm?1（酰胺III的C–N）信号确认了壳聚糖的存在，并观察到碳水化合物指纹区（800–1200 cm?1）特征吸收带；根据1320 cm?1和1420 cm?1谱带比值估算脱乙酰度（DD）为80.51%，特性黏度[η]为760 mL/g，分子量（Mw）为183.5 kDa；XRF元素分析显示NCH主要由CaO、SiO?、Cl?和MgO组成，其次是较小比例的Na?O、Al?O?和Fe?O?，未检测到Ag、Cd、Pb、Hg、Cr、Co和As等有毒金属，灰分含量为0.2%；DLS显示流体力学尺寸呈单峰分布，平均直径为214.6 ± 33.8 nm，多分散指数（PDI）为0.6，zeta电位为+20.71 mV。这些结果表明所购商业NCH金属污染物负荷低，观察到的生物学效应主要归因于壳聚糖的固有特性及其纳米尺寸。3.2 RNA测序：共获得342,638,539条读数（R1）和335,312,504条读数（R2），Q30值分别为88.5%和85.2%；炭疽菌属物种的clean reads比例为81.32%至88.76%，超过91.54%的clean reads可比对到各自参考基因组，其中超过92.03%为唯一比对，超过97.81%比对到基因外显子，可用于后续定量表达和注释分析。3.3差异表达基因：对18个转录组文库分析显示，以未处理vs处理比较，C. chrysophilum叶片有1787个基因差异表达（995个上调，log2FC范围1.04至10.69；792个下调，log2FC范围?8.23至?1.11），C. siamense叶片有362个（232个上调，log2FC范围1.55至6.90；130个下调，log2FC范围?10.01至?1.59），C. fructicola叶片有3156个（2003个上调，log2FC范围1.00至10.90；1153个下调，log2FC范围?9.14至?1.00），C. fructicola果实有3976个（2206个上调，log2FC范围1.00至11.13；1770个下调，log2FC范围?11.80至?1.00）；从芒果果实和叶片分离的C. fructicola对NCH处理呈现最多的DEGs，其次为C. chrysophilum和C. siamense。3.4 DEGs功能注释：转录组功能注释分别预测了C. chrysophilum叶片1974个基因、C. siamense叶片335个基因、C. fructicola叶片4661个和果实6107个基因的功能；GO分类显示分子功能（MF）类别以催化活性（GO:0003824）为代表，生物学过程（BP）类别以细胞过程（GO:0009987）和代谢过程（GO:0008152）为代表，细胞组分（CC）类别以细胞解剖实体（GO:0110165）为代表。在C. chrysophilum叶片中，DEGs涉及抗性机制（氨基酸通透酶、ZEB2调控的ABC转运蛋白）、几丁质生物合成和细胞壁重塑（葡糖胺-6-磷酸异构酶，GO:0004342）、氧化应激响应（过氧化氢酶-过氧化物酶，GO:0006979）、真菌聚酮合酶（PKS，I型PKS）相关的DHN-黑色素生物合成（GO:0006633、GO:0044550）、碳水化合物代谢酶（多聚半乳糖醛酸酶和CENP-B样蛋白Cbh2，GO:0005975）以及细胞壁降解酶（糖苷水解酶GO:0004553、纤维素结合GO:0030248、果胶裂解酶GO:0042545、木葡聚糖特异性糖基水解酶GO:0010411）。在C. siamense中，DEGs包括内切几丁质酶（GO:0008061）和几丁质脱乙酰酶（GO:0016810）、纤维素结合域（GO:0030248）和果胶裂解酶（GO:0045490）、糖转运蛋白（GO:0022857）、氧化还原酶（GO:0016491、GO:0016705）、葡聚糖分解代谢过程（GO:0009251，如内切-β-1,4-葡聚糖酶D IPR005103和β-葡聚糖酶样N端结构域IPR000757）、β-木糖苷酶（IPR041542）、钙离子跨膜转运（GO:0070588）。在C. fructicola叶片中，DEGs涉及碳水化合物结合域（IPR002889）、细胞壁完整性蛋白scw1、葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶活性（GO:0004343）、氧化还原酶活性（GO:0016491）、内切几丁质酶（GO:0006032）、多聚半乳糖醛酸酶活性（GO:0004650）、漆酶（GO:0005507）、角质酶活性（GO:0050525）、木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶（IPR023296）、几丁质生物合成（GO:0006031）、几丁质脱乙酰酶（GO:0008061）、β-葡聚糖酶样（IPR000757）、UDP-糖基转移酶活性（GO:0008194）、次级代谢过程（GO:0019748）、脂肪酸代谢过程（GO:0006631）、水解酶活性（GO:0016787）、岩藻糖代谢过程（GO:0006004）、果胶分解代谢（GO:0045490）、激酶活性（GO:0016301）、磷脂转运（GO:0015914）、CoA连接酶活性（GO:0016405）、金属肽酶活性（GO:0008237）、氨基酸跨膜转运（GO:0003333）、钙离子跨膜转运（GO:0070588）、次级代谢物生物合成（GO:0044550）和氧化应激响应（GO:0006979）。在C. fructicola果实中，DEGs涉及糖酵解过程（GO:0006096）、碳水化合物代谢过程（GO:0005975）、水解酶活性（GO:0016787）、果胶分解代谢（GO:0045490）、细胞壁修饰（GO:0042545）、碳水化合物转运（GO:0008643）、乙醛酸还原酶（NADPH）活性（GO:0030267）、硝基烷烃单加氧酶活性（GO:0018580）、甲基转移酶活性（GO:0008168）、催化活性（GO:0003824）、1,3-β-葡聚糖合成（形态发生相关蛋白IPR037508）、跨膜转运（GO:0055085）和氧化还原酶活性（GO:0016491）。总体而言，三种炭疽菌属物种对NCH响应的DEGs基因功能相似，检测到的基因与真菌细胞壁改变和氧化应激响应相关，此外还鉴定到与植物细胞壁降解、细胞黏附、赖氨酸降解、致病性等过程相关的基因；在NCH下调的基因中，鉴定到与产孢、pH调节和稳态相关的基因。3.5 KEGG分析：KEGG分析显示炭疽菌属物种中的DEGs与碳水化合物和氨基酸代谢相关。

讨论部分总结：炭疽菌属物种是包括芒果在内的广泛寄主的炭疽病病原，其广泛寄主范围可能归因于真菌采用不同侵染策略的能力，如角质层下或壁内定殖，分生孢子黏附、萌发、产生芽管，进而产生黑色素化附着胞直接穿透角质层。研究人员所在课题组先前报道NCH可破坏真菌细胞壁和质膜完整性、降低氧化应激水平并减少孢子萌发。壳聚糖基系统的纳米级尺寸增加表面积与体积比，可能增强与真菌细胞组分的相互作用。本研究基于Q值显示测序质量优良（≥Q30碱基百分比大于70–80%），GC含量范围为51%至54%，与文献报道的炭疽菌属物种平均GC含量46%至54%（多数物种约51%）一致。DEGs分析显示上调基因中若干与炭疽菌属物种侵染过程相关，另一些与真菌对NCH的响应相关；下调基因与产孢和pH调节相关。与侵染过程相关的基因涉及黑色素生物合成，真菌黑色素是沉积于真菌细胞壁的深色聚合物，被视为毒力因子，在炭疽菌属中1,8-二羟基萘黑色素（DHN-黑色素）生物合成是由聚酮合酶（PKS）驱动的过程，需要两个推定锌指转录因子的协同功能，该PKS-黑色素高度集中于真菌特化侵染结构附着胞中，产生 rupture 寄主植物坚韧角质层所需的机械膨压，对完全毒力至关重要。其他上调基因与细胞黏附相关，编码特化结构/黏附蛋白（adhesins）和使真菌孢子牢固附着于植物表面以便萌发和侵染的酶。还检测到与植物细胞壁降解相关的基因，特别是漆酶和角质酶，真菌漆酶参与木质素降解，角质酶为瓦解寄主植物角质层所需。这些结果提示炭疽菌属物种转录组具有与侵染过程相关的基因，主要依赖局部酶促降解，研究人员提出炭疽菌孢子通过adhesins附着于寄主，随后附着胞和真菌穿透开始，其中涉及黑色素、角质酶和漆酶。关于NCH响应，结果表明上调基因中编码几丁质脱乙酰酶、几丁质酶、内切几丁质酶和β-葡聚糖酶的基因与该响应相关，提示炭疽菌属物种对NCH的响应由参与细胞壁组分（几丁质和β-葡聚糖）的关键基因调控介导，这与Hernández-López等报道的NCH影响真菌细胞壁完整性的结果一致。因此结果提示炭疽菌属物种对NCH的转录组响应以细胞壁降解酶（如几丁质酶和β-葡聚糖酶）相关转录本为主，支持NCH抗炭疽菌属物种机制涉及真菌细胞壁损伤。还检测到与氧化应激响应相关的DEGs，其中过氧化氢酶是将过氧化氢（H?O?）转化为氧气（O?）和水（H?O）的关键抗氧化酶；据此研究人员提出暴露于NCH诱导炭疽菌属物种分泌自身几丁质酶和β-葡聚糖酶试图自溶（细胞降解/重塑）以应对胁迫，从而削弱自身真菌细胞壁结构，此外壳聚糖可破坏真菌氧化还原平衡引起氧化应激，炭疽菌属物种利用过氧化氢酶等抗氧化酶中和活性氧（ROS）以防御壳聚糖毒性；为确认所提出机制中基因的表达水平，可采用实时定量PCR（qRT-PCR）。此外，与产孢相关的基因在炭疽菌属中被发现下调，提示NCH产生对产孢的抑制，NCH对产孢的抑制可归因于酶活性抑制、营养可利用性和真菌细胞壁破坏。研究结论部分翻译如下：RNA-seq分析鉴定了2 mg/mL NCH对研究的炭疽菌属物种（C. chrysophilum、C. siamense和C. fructicola）的影响。通过MGISEQ-2000平台获得的全局转录组测序及真菌对NCH响应的分析揭示，从接种C. chrysophilum的芒果叶片中分离的差异调控基因共1787个，C. siamense 362个，C. fructicola 3156个，以及从接种C. fructicola的果实中分离的3976个。功能分析鉴定出注释与真菌致病性、植物细胞壁降解、细胞壁重塑和氧化应激响应相关的差异表达基因。另一个被鉴定为上调的基因与真菌对壳聚糖的响应相关，参与细胞壁修饰和氧化应激响应。这些发现在所研究的三种炭疽菌属物种中相似，提示对NCH的响应在物种间保守。在该机制中，NCH上调与细胞壁破坏相关的基因（几丁质酶和β-葡聚糖酶）和抗氧化酶（过氧化氢酶）以保护细胞免受氧化损伤，同时下调产孢基因，从而抑制炭疽菌属生长。研究人员的转录组发现阐明了与先前报道的NCH对C. chrysophilum、C. siamense和C. fructicola抗真菌活性相关的分子应激响应，支持细胞壁重塑和氧化应激防御是主要涉及机制，提示芒果炭疽菌侵染主要依赖局部酶促降解。这为阐明NCH作用模式提供了科学线索，具有未来农业食品应用价值，特别是通过整合抑制活性和分子响应分析来开发更安全、更有效的炭疽菌属控制处理。进一步验证目标基因表达水平和酶活性的研究也有助于更好地理解NCH抗炭疽菌属物种作用的潜在调控机制。