《International Journal of Molecular Sciences》：Identification of Hypoxia- and Circadian Rhythm-Related Prognostic Genes in Hepatocellular Carcinoma Through Integrative Transcriptomic and Single-Cell Analysis
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缺氧会扰乱肝细胞癌中的昼夜节律基因表达，但与这两种过程均相关的预后基因仍未被充分表征。研究人员分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）中肝细胞癌（LIHC）队列及基因表达综合数据库（GEO）的数据。通过将差异表达基因（DEGs）与27个缺氧和昼夜节律相关基因取交集
缺氧会扰乱肝细胞癌中的昼夜节律基因表达，但与这两种过程均相关的预后基因仍未被充分表征。研究人员分析了来自癌症基因组图谱（TCGA）中肝细胞癌（LIHC）队列及基因表达综合数据库（GEO）的数据。通过将差异表达基因（DEGs）与27个缺氧和昼夜节律相关基因取交集来鉴定候选基因，并利用单因素Cox回归和最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归进一步精简；随后构建并验证了随机生存森林（RSF）风险模型。之后开展了独立预后与功能富集分析、免疫浸润谱分析、单细胞RNA测序（scRNA-seq）以及免疫组织化学（IHC）分析。通过整合计算分析鉴定出四个预后基因（ADM、PFKFB3、SERPINE1和RORA）。RSF模型将LIHC患者分为高危组（HRG）和低危组（LRG），两组生存结局存在显著差异，并将风险评分与肿瘤分期结合于列线图中。这四个基因共富集于四条通路；包括自然杀伤T（NKT）细胞在内的八种免疫细胞类型在风险组间存在差异。scRNA-seq鉴定出干性/缺氧恶性细胞，其分化轨迹显示出这四个基因不同的表达动态。IHC证实LIHC组织中ADM和PFKFB3蛋白表达显著升高，而SERPINE1和RORA的蛋白水平证据尚不确定。这些发现支持对LIHC进行进一步的预后评估，并探究缺氧、代谢重编程与干性之间的联系。
研究背景方面，肝细胞癌（LIHC）是全球最常见的原发性肝癌，也是癌症相关死亡的第三大原因，其发生是多步骤过程，逐步获得癌症干性。尽管监测策略和治疗手段有所进步，LIHC仍常于晚期确诊，晚期或复发患者从现有标准治疗中获得的生存获益有限，免疫治疗则受肝脏固有免疫耐受微环境的制约。缺氧和昼夜节律紊乱是LIHC微环境的两个突出特征，缺氧诱导因子（HIFs）协调支持代谢适应和肿瘤细胞存活的转录程序，昼夜节律紊乱通过影响细胞周期调控、代谢稳态和肿瘤免疫参与LIHC发病。缺氧信号与生物钟紧密互联而非独立，缺氧扰乱LIHC中昼夜节律基因表达，核心钟蛋白CRY1直接抑制HIF-1α，但两者如何共同塑造LIHC进展和患者预后仍不明确。单细胞RNA测序（scRNA-seq）可在单细胞分辨率剖析基因表达，揭示 Bulk 分析掩盖的细胞异质性和细胞状态，已揭示LIHC中干性相关的瘤内异质性。既往研究虽整合TCGA Bulk数据与GSE149614单细胞数据表征缺氧相关细胞状态并构建缺氧相关预后特征，但缺氧和昼夜节律相关基因的联合预后意义及其表达的细胞分布仍未充分表征。研究人员因此整合TCGA Bulk转录组数据与GEO单细胞数据，鉴定并表征LIHC中与缺氧和昼夜节律均相关的预后基因。
研究人员开展了以下研究：从TCGA的LIHC队列和GEO获取数据，将差异表达基因（DEGs）与27个缺氧和昼夜节律相关基因取交集获得候选基因，经单因素Cox回归和LASSO回归精简后构建并验证随机生存森林（RSF）风险模型，随后进行独立预后与功能富集分析、免疫浸润谱分析、scRNA-seq和免疫组织化学（IHC）分析。研究得出四个预后基因（ADM、PFKFB3、SERPINE1和RORA），RSF模型将患者分为高危组（HRG）和低危组（LRG）且生存结局显著不同，风险评分与肿瘤分期结合构建列线图，四个基因共富集于四条通路，八种免疫细胞类型在风险组间存在差异，scRNA-seq鉴定出干性/缺氧恶性细胞且其分化轨迹显示四个基因不同的表达动态，IHC证实ADM和PFKFB3蛋白在LIHC组织中显著升高。其重要意义在于支持对LIHC进行进一步预后评估，并探究缺氧、代谢重编程与干性之间的联系，提示PFKFB3相关糖酵解可作为未来研究的通路。
关键技术方法方面（不超过250字）：研究基于公共队列数据，包括TCGA-LIHC队列（369例肿瘤和50例癌旁正常组织，302例有完整生存信息）、GEO的GSE43619（88例LIHC患者）、GSE14520（221例LIHC样本）以及scRNA-seq数据集GSE151530（6例LIHC和6例对照组织）；从已发表研究获取1280个昼夜节律相关基因和328个缺氧相关基因，交集得27个共享基因作为基因面板；采用DESeq2鉴定DEGs，clusterProfiler进行GO和KEGG富集，STRING构建蛋白互作网络，survival包进行Cox回归，glmnet进行LASSO回归，randomForestSRC构建RSF模型，Seurat分析scRNA-seq，CellChat进行细胞通讯分析，Monocle进行拟时序分析，ReactomeGSA和scMetabolism进行功能与代谢通路分析；IHC采用安徽医科大学第一附属医院120对肝癌与癌旁标本构建的组织芯片。
研究结果方面：2.1 15个候选基因的鉴定与功能分析——差异表达分析在LIHC中鉴定出8518个DEGs（5915个上调、2603个下调），与27个缺氧和昼夜节律相关基因取交集得15个候选基因；功能富集显示候选基因显著关联635个GO条目和22条KEGG通路，包括HIF-1信号通路、MAPK信号通路和昼夜节律通路，HIF-1信号与昼夜节律通路共富集提示两种转录程序的潜在协调；STRING蛋白互作网络在置信度0.7下含8个节点，SERPINE1与PLAUR和TGFB1呈高置信度预测关联。2.2 RSF风险模型的构建——15个候选基因中9个通过预设单因素Cox筛选与生存相关（HR和p < 0.2），比例风险（PH）假设均满足；LASSO回归在lambda.min（0.0512）下得四个预后基因（ADM、PFKFB3、SERPINE1和RORA）；RSF模型在TCGA-LIHC训练队列的袋外（OOB）C指数为0.559、OOB错误率为0.441，置换法变量重要性（VIMP）排序为ADM最高，其次PFKFB3、RORA和SERPINE1；以最优风险评分截断值42.253将TCGA-LIHC队列302例患者分为HRG（n = 171）和LRG（n = 131），GSE43619队列88例分为HRG（n = 53）和LRG（n = 35），两个队列中HRG死亡率更高、生存时间更短，Kaplan–Meier（K–M）分析显示HRG生存结局显著更差（p < 0.05），受试者工作特征（ROC）曲线显示TCGA-LIHC中1、3、5年曲线下面积（AUC）均超过0.800，GSE43619中分别为0.767、0.769和0.861；GSE14520队列221例按同一切断值分组后K–M分析显示HRG总生存显著更差（p = 0.025），但1、3、5年AUC分别为0.540、0.599和0.593，判别性能有限；TCGA-LIHC中四基因RSF模型C指数为0.789，仅AJCC分期模型为0.682，联合模型C指数为0.789，RSF模型1、3、5年Brier评分分别为0.137、0.153和0.152，联合模型为0.135、0.149和0.150，仅分期模型为0.158、0.227和0.243，似然比检验（LRT）显示将RSF风险评分加入AJCC分期模型改善模型拟合（χ2 = 86.15，df = 1，p < 0.001）；与已发表基因面板比较，四基因RSF模型1、3、5年AUC为0.815、0.846和0.872、C指数0.785，Tang等八基因缺氧面板RSF模型AUC为0.743、0.724和0.697、C指数0.679，Liang等五基因昼夜节律面板RSF模型AUC为0.755、0.680和0.642、C指数0.666。2.3 基于独立预后因素的列线图建立——单因素和多因素Cox回归及PH假设检验确定风险评分和肿瘤分期均为LIHC独立预后因素，据此构建列线图，校准曲线、ROC曲线分析（AUC > 0.800）和决策曲线分析（DCA）支持其良好校准、判别及潜在临床效用。2.4 预后基因相关功能与通路探索——基因集富集分析（GSEA）显示ADM、PFKFB3、RORA和SERPINE1分别富集于60、89、65和84条通路，四个基因显著共富集于四条通路，包括黏着斑、JAK-STAT信号通路、TGF-β信号通路和凋亡。2.5 预后基因的染色体定位、免疫相关性与药物关联——染色体定位显示RORA、ADM、PFKFB3和SERPINE1分别位于15、11、10和7号染色体；28种免疫细胞浸润谱中八种免疫细胞类型在两组间浸润差异显著（p < 0.05），均在HRG中浸润评分更高，活化树突状细胞与自然杀伤T（NKT）细胞呈强正相关（cor = 0.71，p < 0.05），PFKFB3表达与全部八种差异浸润免疫细胞类型正相关（cor > 0.30，p < 0.05）；药物预测鉴定出与ADM、PFKFB3、RORA和SERPINE1相关的药物分别为122、50、34和120种，雌二醇与全部四个预后基因相关，但上述计算发现仅为假设生成性，不确立直接相互作用、疗效或临床效用。2.6 LIHC候选细胞群的选择——质控后保留39430个细胞和18667个基因，鉴定2000个高变基因（HVGs），主成分分析（PCA）选取前30个主成分，统一流形近似与投影（UMAP）降维将细胞分为14个簇（分辨率0.2），注释为十种主要细胞类型：炎性恶性细胞、代谢性恶性细胞、循环恶性细胞、干性/缺氧恶性细胞、T细胞、B细胞、浆细胞、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤内皮细胞（TECs）和癌相关成纤维细胞（CAFs）；ADM、PFKFB3和SERPINE1在包括干性/缺氧恶性细胞在内的多个群体中明显表达，该群体中四个基因在肿瘤组织的表达均显著高于正常组织，故被确定为后续研究的候选细胞类型。2.7 干性/缺氧恶性细胞的细胞互作、分化轨迹与功能富集特征——拟时序分析解析出从深蓝到浅蓝、涵盖7个发育状态的分化轨迹，沿轨迹PFKFB3表达先降后升再降，ADM和RORA持续下降，SERPINE1先升后降；功能富集显示该群体富集于"摄入的甲硒亚磺酸（MeSeO2H）代谢为甲基硒醇（MeSeH）"，代谢通路分析显示糖鞘脂生物合成—球系列和异球系列及甘油磷脂代谢活性高；LIHC和对照样本中均发现干性/缺氧恶性细胞、CAFs和T细胞间频繁互作，巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）–(CD74/CXCR4)轴是LIHC中突出的预测通讯轴之一。2.8 预后基因（ADM和PFKFB3）的免疫组织化学表达验证——定量IHC显示癌（ca）组ADM和PFKFB3染色值高于癌旁（cap）组（ADM：38.0449 ± 7.0571 vs. 30.5631 ± 6.597，p < 0.0001；PFKFB3：32.3472 ± 3.3617 vs. 28.8348 ± 5.6851，p = 0.0006），RORA癌组平均染色值亦较高（35.899 ± 11.6159 vs. 31.8719 ± 5.2221）但差异无统计学意义（p = 0.0534），SERPINE1因组织切片脱落无法可靠评估，故IHC为四个基因中两个提供了蛋白表达升高的实验证据。
讨论部分总结：LIHC进展与微环境应激信号密切相关，缺氧扰乱LIHC中昼夜节律基因表达，表明二者相互关联而非独立特征，但其共同影响预后的方式仍知之甚少。与既往缺氧或昼夜节律相关预后模型相比，本研究的区别在于RSF框架、缺氧与昼夜节律相关基因的联合建模以及将四个预后基因映射到LIHC单细胞图谱，并额外在临床样本中验证了ADM和PFKFB3的蛋白水平。ADM编码肾上腺髓质素，为缺氧诱导肽，在肿瘤血管生成中起作用，缺氧诱导的肾上腺髓质素加速LIHC细胞生长，本研究中ADM在转录组分析中上调且IHC显示癌组织蛋白表达更高。PFKFB3位于缺氧信号与昼夜节律代谢控制的交汇点，在LIHC中过表达且与较大肿瘤和较差生存相关，阻断PFKFB3可抑制LIHC生长，本研究中PFKFB3表达与全部八种差异浸润免疫细胞类型正相关。SERPINE1编码纤溶酶原激活物抑制剂-1（PAI-1），是细胞外基质重塑的核心调控因子，uPA/uPAR/PAI-1系统长期与LIHC侵袭转移相关，本研究中SERPINE1在干性/缺氧恶性细胞中高表达。RORA是昼夜节律核受体，被视为LIHC良好预后标志物并具肿瘤抑制功能，可重编程癌细胞葡萄糖和谷氨酰胺代谢，尽管IHC差异不显著，其多基因风险模型贡献可能反映背景依赖的钟网络活性。通路层面四个基因共富集于TGF-β信号、黏着斑、JAK-STAT信号和凋亡通路，GSEA不能指示凋亡活性增减，也不确立因果调控。整合证据提出可检验模型：缺氧与昼夜节律紊乱可能汇聚于四基因特征相关生物程序，ADM为HIF-1直接靶基因，PFKFB3亦由HIF-1α诱导且二者存在正反馈环，SERPINE1经MPS1介导的Smad2/3磷酸化在缺氧LIHC细胞中上调并与HIF-1α形成另一正反馈环，RORA作为HIF-1靶基因经启动子功能性缺氧反应元件被缺氧转录上调，同时缺氧诱导的外泌体miR-10a下调RORA并诱导免疫抑制，故提出RORA作为该网络中的负调控臂，但四个基因间直接调控或物理互作未在本研究中验证。免疫组成方面HRG中包括NKT细胞在内的八种免疫细胞浸润评分更高，但应解释为推断的富集信号，不确立NKT细胞丰度增加、抗肿瘤功能保留或因果作用。单细胞分辨率下鉴定干性/缺氧恶性细胞为候选群体，假时序分析解析四个基因不同表达动态，PFKFB3在中间阶段达峰的降-升-降模式与缺氧龛中细胞状态转换的代谢适应一致，但拟时序模式本身不确立PFKFB3为因果代谢开关。糖鞘脂生物合成和甘油磷脂代谢活性增加提示该群体脂质代谢改变，MeSeO2H至MeSeH代谢富集仅提示硒化合物代谢相关基因在该群体中有代表，通路富集不证明摄取、产生或通量改变。细胞通讯分析显示干性/缺氧恶性细胞、CAFs和T细胞间频繁预测互作，但本身不确立肿瘤特异性通讯增强，配体-受体分析基于计算推断，不能确立实际配体释放、受体激活或下游功能效应。临床上整合风险评分与肿瘤分期的列线图显示良好预测准确性，雌二醇与四个基因的计算预测关联仅为探索性和假设生成性，不支持治疗或药物重定位主张。研究优势包括风险模型在独立队列外验证、列线图获校准和决策曲线分析支持、四个基因映射到单细胞图谱且ADM和PFKFB3经IHC验证。局限性包括：公共队列回顾性设计可能引入选择偏倚和混杂偏倚；GSE43619样本量有限可能限制统计效能；IHC仅ADM和PFKFB3显示显著蛋白上调，RORA组间无显著差异且SERPINE1因切片脱落无法可靠评估，四个计算鉴定基因中仅两个有实验支持；基因水平转录组分析未捕捉异构体特异性表达或可变剪接；RSF模型未与LASSO-Cox或弹性网等替代生存模型基准比较；27基因面板虽源自缺氧和昼夜节律相关基因集交集，但缺氧相关过程富集（FDR = 1 × 10
?9）强于昼夜节律调控，"昼夜节律正调控"富集为临界（FDR = 0.046）且被血管发生和细胞迁移等过程超越，昼夜节律相关发现应谨慎解释为探索性，不确立昼夜节律紊乱在LIHC中的突出或因果作用；干性/缺氧恶性群体由预后基因表达计算定义并在同一单细胞数据集中表征，仍属探索性。
研究结论部分翻译：总之，研究人员通过计算鉴定出四个缺氧和昼夜节律相关预后基因（ADM、PFKFB3、SERPINE1和RORA），构建并验证了RSF风险模型和列线图，表征了免疫景观和干性/缺氧恶性细胞群体，并通过IHC实验验证了其中两个基因（ADM和PFKFB3）蛋白表达升高，而SERPINE1和RORA的蛋白水平证据仍不确定。这些发现可能有助于LIHC的预后评估，并突出PFKFB3相关糖酵解作为未来研究的关注通路。未来研究应在前瞻性队列中验证风险模型，并通过实验检验所提出的缺氧、代谢重编程与干性之间的关系，以阐明其在LIHC中的预后和治疗相关性。
