《International Journal of Molecular Sciences》：Transcriptomic Response of Tomato Leaves to Root-Applied Phyto-Courier
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纳米技术在植物科学中的应用正在为改善农业系统中生物活性化合物的递送、稳定性和功效开辟新机遇。特别是，利用纳米载体提高植物次级代谢产物（如黄酮类化合物）生物利用度的研究日益受到关注，这是由于黄酮类化合物在植物生理和胁迫响应中具有已知的重要作用。本研究在前期开发的
纳米技术在植物科学中的应用正在为改善农业系统中生物活性化合物的递送、稳定性和功效开辟新机遇。特别是，利用纳米载体提高植物次级代谢产物（如黄酮类化合物）生物利用度的研究日益受到关注，这是由于黄酮类化合物在植物生理和胁迫响应中具有已知的重要作用。本研究在前期开发的硅基纳米颗粒递送平台（称为phyto-courier）基础上，开展了一项全面的转录组分析，以探究番茄叶片在根部施加负载芦丁的phyto-courier系统（GS3-R；由硅纳米颗粒、脂质、氨基酸和海藻糖组成）后所诱导的分子响应。初步的靶向qPCR分析比较了GS3-R与游离芦丁、未负载载体以及作为施用对照的空水解性聚乙烯醇（PVA）袋（B）在非胁迫和NaCl条件下的19个基因表达，揭示了处理依赖性的基因表达差异以及对盐度的额外响应。为进一步探究对GS3-R的更广泛转录响应，研究人员对非胁迫条件下GS3-R和B处理植株的叶片进行了RNA-Seq分析。差异表达基因（DEGs）通过两种分析方法进行鉴定，以评估结果的稳健性。第一种分析基于每千碱基每百万读数（RPKM），鉴定出862个DEGs；而基于计数的DESeq2再分析鉴定出1644个DEGs，其中670个为共有且显示一致的差异表达方向。功能富集分析在两种分析中均突出了广泛一致的模式，涉及苯丙烷和类黄酮生物合成、氧化还原稳态、膜运输、光合作用、植物激素相关途径和细胞壁组织。这些结果表明，根部施用GS3-R phyto-courier与地上部组织的分子响应相关，并提供了对完整制剂响应的生物学过程的全转录组概览。本研究鉴定了与植物对该制剂响应相关的候选分子途径，并为未来旨在阐明这些途径在胁迫条件下生理意义的研究建立了稳健的分子基础。
**研究背景与问题提出**
植物持续暴露于干旱、盐渍、极端温度和氧化胁迫等多种非生物胁迫之下，这些胁迫干扰植物的生理生化过程，最终影响代谢和产量。为应对不良环境，植物进化出了涉及形态、生理和分子调整的复杂防御机制，其中抗氧化系统的激活和次级代谢产物的积累在缓解胁迫诱导损伤中发挥核心作用。然而，气候变化相关环境胁迫的频率和强度不断增加，加剧了对可持续增强植物抗逆性创新策略的需求。植物 priming（预刺激）概念作为一种有前景的方法受到关注，指通过预先暴露于某种刺激诱导生理状态，使植物能更快速高效地响应后续胁迫。在天然化合物中，黄酮类化合物因其强抗氧化和信号传导特性而备受关注，芦丁和槲皮素等已被证明能增强植物对多种非生物和生物胁迫的抗性。然而，由于稳定性、溶解性和在植物组织内受控递送等挑战，黄酮类化合物在农业中的实际应用仍然有限。纳米技术通过增强稳定性、生物利用度和靶向递送，为提高生物活性化合物在植物系统中的效率开辟了新前景。硅纳米颗粒（SiNPs）因其对植物生长和胁迫耐受性的有益效应而受到广泛关注。研究人员前期开发了phyto-courier技术，利用可水解多孔SiNPs稳定化脂质组分递送黄酮类化合物。尽管生理和生化效应已开始被表征，但负载黄酮类化合物的phyto-courier所触发的全局转录响应仍很大程度上未被探索。因此，本研究旨在探究非胁迫条件下根部施用负载芦丁的SiNPs（GS3-R phyto-courier）后番茄叶片中发生的转录重编程，通过RNA-Seq靶向叶片转录组，鉴定与GS3-R施用相关的生物学过程和途径。
**关键技术方法**
研究使用番茄"Micro-Tom"品种，在受控生长箱中培养（23 °C、60%湿度、16/8 h光暗周期）。播种后10天，将装有GS3-R制剂的预称重可水解PVA袋埋入土壤中靠近根系处。盐处理于播种后15天开始，以200 mM NaCl替代常规浇水。播种后42天采集底部侧小叶用于RNA提取。差异表达分析采用两种方法：基于RPKM的CLC Genomics Workbench分析（含混合文库，FDR校正p < 0.05，RPKM > 0.5，|FC| > 2）和基于计数的DESeq2分析（仅含三个独立生物学重复，FDR校正p < 0.05，|FC| > 2）。功能富集分析通过iDEP v2.5.0完成。RNA-Seq数据 deposited at SRA（PRJNA1444710）。
**研究结果**
**Phyto-Courier的理化表征与初步基因表达分析**：GS3-R制剂显示负zeta电位（?30.55 ± 0.45 mV）、平均粒径832.1 ± 70.89 nm、多分散指数0.52， cargo回收率高（99.1%），残留溶剂低于3000 ppm，与此前研究的phyto-courier特征相当。通过qPCR分析19个基因，发现在非胁迫条件下，GS3-R处理植株叶片中ERFB1、FLA10和HSP30表达显著高于B，而其他基因无显著差异；多个基因的表达谱在GS3-R与R和/或P之间存在重叠，表明响应不能归因于制剂的单一组分。NaCl暴露显著改变了多个基因的表达模式，且响应NaCl的基因在GS3-R、R、P和B之间不完全相同，表明盐度以处理依赖的方式修饰转录响应。值得注意的是，虽然在非胁迫条件下GS3-R与B在ERFB1、FLA10和HSP30上存在显著差异，但在NaCl条件下GS3-R-NaCl与B-NaCl之间无基因显示显著差异。这些观察支持了RNA-Seq实验在非胁迫条件下比较GS3-R和B的设计。
**转录组分析**：测序每文库产生17.4–23.9百万原始读数，过滤后保留15.8–19.1百万，12.4–15.0百万映射到番茄参考基因组，映射率76.21–80.80%。基于RPKM的分析鉴定出862个DEGs（432个在GS3-R中上调，430个在B中上调），PCA显示两个明显分离的组。GOE分析显示GS3-R处理植株中与光合作用相关的生物学过程富集，而B处理植株中与内源刺激响应相关的过程富集。基于计数的DESeq2再分析鉴定出1644个DEGs（387个在B中高表达，1257个在GS3-R中高表达），与初始RPKM分析比较发现670个共有DEGs，均显示一致的差异表达方向（266个在B中高表达，404个在GS3-R中高表达）。GOE分析显示与RPKM分析广泛相似的功能模式。
**GS3-R Phyto-Courier下调基因的功能分析**：在B处理植株中高表达的基因涉及植物激素信号传导、细胞壁重塑、转录调控和信号转导。 expansin家族基因（FC B vs. GS3-R ≥ 6.2）和一个伸展蛋白/脯氨酸丰富蛋白基因（FC = 44.1）在phyto-courier处理植株中表达较低，这些基因在DESeq2分析中也显示相同变化方向。其他编码细胞壁重塑相关酶的基因，如果胶甲酯酶（PMEs）及其抑制剂（FC ≥ 4.7）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）异构体（FC ≥ 2.3）和β-1,3-葡聚糖酶（FC = 3.1）在B处理植株中表达较高。这些基因表达的降低表明GS3-R处理协调下调了与细胞壁松弛相关的基因。同时，多个与植物激素信号传导和运输相关的基因在B处理植株中高表达，包括生长素响应蛋白、生长素转运蛋白和生长素受体TIR1（FC = 3.2），以及油菜素内酯生物合成（FC = 7.2）和ABA信号传导（FC ≥ 2）相关基因。此外，多个编码转录和发育调控因子的基因在B处理植株中高表达，包括MYB家族（FC ≥ 2）、TCP转录因子（FC ≥ 2.1）、bHLH转录因子（FC ≥ 2）、HD-ZIP转录因子（FC ≥ 3）和AP2/ERF结构域蛋白（FC = 3.2）。涉及昼夜节律和光信号的基因也在B处理植株中高表达，包括TOC1/APRR1（FC = 25.6）、ELF4（FC ≥ 3.6）和PHYB（FC = 5.8）。
**GS3-R Phyto-Courier上调基因的功能分析**：在phyto-courier施用后高表达的基因主要与 specialised metabolism、氧化还原调控、运输过程和光合代谢相关。多个编码苯丙烷和类黄酮生物合成途径酶的DEGs被鉴定，包括查尔酮合酶（FC = 4.9）、二氢黄酮醇4-还原酶（FC = 6.7）、类黄酮3′-羟化酶（FC = 5.2）、柚皮素3-双加氧酶（FC = 8.4）和2-羟基异黄烷酮脱水酶（FC > 3），以及4-香豆酸-CoA连接酶（FC = 4.7）、咖啡酸O-甲基转移酶（FC = 3）和香豆酰莽草酸3′-单加氧酶（CYP98A3；FC = 3.8）。所有九个基因在DESeq2分析中也显示相同变化方向。多个编码糖基转移酶和酰基转移酶的基因也显示较高表达（FC 2.7–16.5）。与氧化还原调控和解毒相关的基因在GS3-R处理植株中高表达，包括谷胱甘肽S-转移酶（GSTs，FC ≥ 2）、硫氧还蛋白（FC ≥ 4）、谷氧还蛋白（FC = 5.1）和铁螯合还原酶（FC > 10）。叶片还显示ABA分解代谢（CYP707A，FC > 4）、细胞分裂素缀合（FC > 4）和甾醇/油菜素内酯代谢（FC > 4）相关基因的高表达。最后，多个与光合作用和质体代谢相关的基因在phyto-courier处理植株中高表达，包括捕光复合体蛋白LHCB1（FC > 2.2）、LHCB2（FC > 3.5）、LHCB3（FC > 2）以及叶绿素生物合成酶如叶绿素酸酯a加氧酶（FC > 3.5）和镁螯合酶（FC = 4.7），所有11个基因在DESeq2分析中也一致显示较高表达。
**讨论与结论**
本研究提供了证据表明，根部施用负载芦丁的GS3-R phyto-courier与地上部组织的转录变化相关。这一观察与先前在C. sativa中的发现一致，即根部施用的phyto-courier可转运至地上部组织并诱导分子响应。GS3-R处理与苯丙烷和类黄酮代谢、氧化还原调控、运输系统和光合作用相关过程基因的上调相关，表明对完整制剂的代谢途径协调转录重编程。由于本实验比较了完整GS3-R制剂与空PVA袋对照，单个制剂组分（包括SiNPs、磷脂酰胆碱、精氨酸/甘氨酸、海藻糖和芦丁）的贡献无法解析。因此，本文讨论的芦丁特异性机制代表基于先前文献的假设而非实验证明的因果机制，将需要专门的组分特异性比较。本研究鉴定了与植物对该制剂响应相关的候选分子途径，并为未来旨在阐明这些途径在胁迫条件下生理意义的研究建立了稳健的分子基础。
