肥胖削弱肾脏过氧化物酶体脂肪酸氧化基因的禁食诱导性上调：一项高脂饮食小鼠肾脏脂质代谢转录组研究

《International Journal of Molecular Sciences》：Epigenetic Adaptation as a Possible Component of Plant Breeding

肥胖期间肾脏脂质含量增加促进肥胖相关肾损伤，但肥胖状态下肾脏脂质蓄积的机制尚未被完全阐明。瘦小鼠在禁食期间同样会蓄积肾脏脂质，然而肥胖状态下肾脏脂质代谢如何响应禁食尚不清楚。喂饲正常饮食（ND）或高脂饮食（HFD）17周的小鼠分别接受自由进食（NDfd与HFDfd）或过夜16 h禁食（NDfa与HFDfa），随后测定肾脏脂质并通过RNA-seq进行肾脏转录组学分析。与NDfd小鼠相比，NDfa小鼠肾脏甘油三酯增加；与NDfd小鼠相比，HFDfd小鼠肾脏甘油三酯亦增加。然而，HFDfa小鼠的肾脏甘油三酯并不高于HFDfd小鼠。RNA-seq显示，与各自进食对照相比，NDfa与HFDfa小鼠脂肪酸代谢基因表达增加，但NDfa小鼠的增加显著大于HFDfa小鼠。与HFDfa小鼠相比，NDfa小鼠过氧化物酶体基因表达亦呈富集。过氧化物酶体脂肪酸氧化基因Acox1与Ehhadh的表达在NDfa小鼠较NDfd小鼠升高，而这些基因在HFDfa小鼠较HFDfd小鼠未见改变。上述结果表明，肥胖削弱了禁食诱导的过氧化物酶体脂肪酸氧化基因表达。

研究背景方面，慢性肾脏疾病（CKD）患病率在近数十年显著上升并造成医疗费用增加，肥胖是CKD发生与进展的重要独立危险因素，其作用超出高血压与糖尿病的影响；现有针对CKD的治疗主要集中于控制血压与高血糖，效果并不完全理想，因此需要更深入理解肥胖时肾脏发生的病理生理改变以开发新的管理策略。脂毒性已被认为是肥胖相关肾损伤的重要促成因素，即肾皮质内脂质异位沉积导致线粒体功能障碍、氧化应激、炎症并最终引起细胞死亡、纤维化与肾功能障碍，但肥胖时脂质蓄积如何发生、如何促进细胞功能障碍仍不完全清楚，循环脂质蓄积、肾脏脂肪酸氧化受损与肾脏脂肪生成增加均被牵涉。急性禁食是已知在非肥胖状态下发生生理性肾脏脂质蓄积的情形，但瘦个体禁食时肾脏脂质蓄积与肥胖时肾脏对禁食的响应有何差异，信息有限。已有研究提示肥胖小鼠肾脏的脂肪生成等过程对禁食的反应性降低，但关于总体脂质蓄积及脂肪酸氧化等其他脂质生化环节尚未被探讨。为此研究人员设计本研究，采用肾脏脂质直接定量与转录组学技术，考察饮食诱导肥胖背景下急性禁食时肾脏脂质代谢基因表达如何改变。

研究设计与结论方面，研究人员以雄性C57BL/6J小鼠为对象，15周龄起分别喂饲标准饲料（12%脂肪，ND）或高脂饲料（60%脂肪，HFD）共17周，各饮食组内随机分为自由进食或过夜禁食，形成NDfd、NDfa、HFDfd、HFDfa四组；第10周进行过夜代谢笼尿液收集以评估早期肾损伤标志物，第17周末进行16 h过夜禁食或自由进食后处死取材，测定血清与肾脏脂质、肾脏基因表达及蛋白表达。结论为：肥胖改变了肾脏脂质代谢基因表达对禁食的响应，尤其表现为肥胖削弱禁食诱导的过氧化物酶体脂肪酸氧化基因表达上调，提示需要更好地理解过氧化物酶体在肥胖相关肾损伤中的作用及其潜在治疗意义。

关键技术方法方面（不超过250字）：研究采用饮食诱导肥胖小鼠模型（雄性C57BL/6J，ND或60% HFD喂饲17周，来源为本机构自Jackson Laboratory引入小鼠繁育），设自由进食与16 h过夜禁食四种处理组合；用代谢笼收集尿液并以ELISA及比色法测定尿白蛋白/肌酐比、NGAL、Kim-1与H₂O₂；用有机萃取结合酶法测定血清与肾皮质甘油三酯、胆固醇及血清非酯化脂肪酸（NEFA）；用实时定量PCR（RT-PCR）检测氧化与脂肪生成相关基因；用RNA-seq及DESeq2、GSEA与fgsea进行差异表达与通路富集分析；用Western blot检测ACOX1与EHHADH蛋白；统计采用双因素方差分析（2-way ANOVA）与Student t检验。

研究结果方面，2.1 HFD增加小鼠体重及肥胖相关肾损伤的早期标志物：HFD小鼠终末体重显著高于ND对照，第10周尿液白蛋白/肌酐比、NGAL显著升高，Kim-1呈上升趋势，尿H₂O₂升高97%，表明HFD小鼠出现与早期肥胖相关肾损伤一致的标志物改变。2.2 肥胖削弱禁食诱导的肾脏甘油三酯蓄积且独立于循环NEFA：HFDfd小鼠血清NEFA较NDfd升高60%，禁食使两种饮食小鼠血清NEFA均显著升高；血清甘油三酯与胆固醇在HFDfd较NDfd显著升高，但禁食未使其升高；HFDfd小鼠双肾重量较NDfd增加25%，禁食对瘦小鼠肾重无影响而使HFDfa较HFDfd降低24%；肾脏甘油三酯在NDfa较NDfd升高、HFDfd较NDfd升高，但HFDfa与HFDfd无显著差异；肾脏胆固醇不受禁食或HFD影响。2.3 肥胖削弱禁食诱导的肾脏脂肪酸代谢通路上调：主成分分析（PCA）显示四组各自成簇；Hallmark通路分析显示ND与HFD小鼠禁食后脂肪酸代谢基因表达均较各自进食对照富集，但NDfa较HFDfa显著更富集；NDfa中富集最明显的脂肪酸代谢基因多为过氧化物酶体氧化基因，包括^Acox1与^Ehhadh，过氧化物酶体通路中^Acsl1、^Abcd3与^Pex11a在NDfa显著更高表达，而线粒体脂肪酸氧化限速酶^Cpt1a表达在两组间无显著差异。2.4 肥胖阻止禁食相关过氧化物酶体脂肪酸氧化基因表达升高：RT-PCR显示NDfa小鼠^Pdk4表达较NDfd升高8倍，HFDfa较HFDfd无统计学意义；^Acox1在NDfa较NDfd升高3倍以上，HFDfa较HFDfd及HFDfd较NDfd均无显著改变；^Ehhadh在NDfa较NDfd升高逾2倍，而肥胖小鼠禁食与进食间几乎无变化；脂肪生成相关基因^Srebf2、^Mogat1、^Hmgcr与^Fasn在禁食下呈下降趋势，但除NDfa较NDfd的^Hmgcr下降及HFDfa较HFDfd的^Fasn边缘性下降外多未达统计学显著；Western blot显示ACOX1在NDfa较NDfd呈非显著升高129%，EHHADH呈近显著升高85%，而HFDfa较HFDfd均未升高。

讨论与结论方面，讨论指出肥胖时肾脏异位脂质蓄积导致脂毒性并促成肥胖相关肾损伤，本研究显示肾脏脂质代谢基因表达对禁食的响应在肥胖与瘦条件下不同，肥胖削弱禁食诱导的过氧化物酶体脂肪酸氧化基因表达上调并对肾脏脂质蓄积具有意义。对于瘦小鼠禁食增加肾脏甘油三酯而肥胖小鼠无此变化，讨论提出若干可能解释：肥胖小鼠肾脏可能已相对脂质饱和而无法进一步增加；肾脏脂质摄取可能不完全依赖循环NEFA，近端小管对白蛋白结合脂肪酸的重吸收可能参与，尿脂肪酸排泄可能有助于减弱肥胖小鼠禁食时的肾脏脂质蓄积；脂肪生成方面，禁食下调多种肾脏脂肪生成酶的作用在肥胖与瘦小鼠均较温和，难以解释仅肥胖小鼠的变化。肾脏胆固醇与甘油三酯模式不同，提示HFD或禁食下肾脏胆固醇浓度较少受循环胆固醇影响。关于脂肪酸氧化，近端小管上皮细胞主要依赖脂肪酸氧化供能，抑制脂肪酸氧化与肥胖相关肾损伤相关，刺激肾脏脂肪酸氧化可减轻肾损伤；转录组与定量PCR显示禁食虽在两种饮食下均提高总体肾脏脂肪酸代谢基因表达，但瘦小鼠的激活显著更强，^Pdk4的禁食诱导升高在肥胖小鼠被削弱。研究进一步显示肥胖特别削弱禁食相关的肾脏过氧化物酶体脂肪酸氧化基因上调，^Cpt1a在HFDfa与NDfa间无显著差异，而^Acox1、^Ehhadh及负责极长链与支链脂肪酸转运至过氧化物酶体的^Acsl1、^Abcd3在NDfa较HFDfa富集；肾近端小管除肝细胞外过氧化物酶体密度最高，过氧化物酶体独特负责极长链脂肪酸氧化，其受损被认为导致肾脏毒性脂质蓄积，增加过氧化物酶体数量及上调过氧化物酶体脂肪酸氧化在缺血再灌注或顺铂毒性等其他肾损伤形式中具保护作用。讨论亦指出增加过氧化物酶体脂肪酸氧化在肥胖相关肾损伤中是否具保护作用尚不清楚，肝脏特异性^Acox1敲除的 paradoxical 结果依赖循环极长链脂肪酸改变且肾脏并非循环脂质的重要来源，而肾脏特异性线粒体脂肪酸氧化受损小鼠的研究提示过氧化物酶体脂肪酸氧化可能提供代偿机制；由于本研究未直接测定过氧化物酶体功能，仍需机制研究确定其保护作用。讨论还提出肥胖小鼠肾脏代谢基因表达灵活性的丧失能否通过反复禁食恢复的问题，热量限制可减重并改善肥胖患者肾脏结局但难以持续，间歇性禁食与限时进食受到关注，限时进食可减轻肥胖相关肾损伤、间歇性禁食可减轻缺血相关肾损伤且这些效应 largely 独立于体重变化，其机制是否涉及脂肪酸氧化尚不清楚。研究局限包括：本研究主要为观察性生理学研究，无法确定基因表达与脂质蓄积变化的机制意义及因果关系，也难以完全区分肥胖与高脂饮食本身的作用；脂质分析仅检测胆固醇、甘油三酯、NEFA等主要脂质类别的总体变化，未涉及神经酰胺、鞘脂与氧化磷脂等特定脂质种类；研究仅测定基因与蛋白表达的总体变化，需功能研究确定是否导致脂肪酸氧化差异，且肾皮质含多种细胞类型，单细胞分析有助于明确细胞来源；研究仅纳入雄性动物，雌性对禁食的响应仍需研究。

研究结论（译文）：总之，肥胖改变了肾脏脂质代谢基因表达对禁食的响应，涉及脂肪酸代谢基因，尤其与过氧化物酶体脂肪酸氧化基因相关。这一点具有重要意义，因为迄今为止对肥胖中肾脏脂肪酸氧化的大部分关注集中于线粒体的作用。因此，这些结果凸显出需要更好地理解过氧化物酶体在肥胖相关肾损伤中的作用，以及该通路对这一常见疾病过程是否具有潜在治疗意义。