《International Journal of Molecular Sciences》：Intergenerational Effects of Early-Life Arsenic Exposure on Sperm Quality and Epididymal Transcriptome: Integrative Analysis of Large and Small RNAs
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无机砷（iAs）是一种广泛存在的环境毒物，与男性生殖功能障碍相关，但附睾对发育期暴露的分子响应及其潜在的代际后果仍知之甚少。本研究考察了直接暴露的雄性子代（F1）及其未暴露的儿子（F2）的精子质量和附睾大RNA与小RNA谱。妊娠C57BL/6J母鼠在整个妊娠期
无机砷（iAs）是一种广泛存在的环境毒物，与男性生殖功能障碍相关，但附睾对发育期暴露的分子响应及其潜在的代际后果仍知之甚少。本研究考察了直接暴露的雄性子代（F1）及其未暴露的儿子（F2）的精子质量和附睾大RNA与小RNA谱。妊娠C57BL/6J母鼠在整个妊娠期和哺乳期通过饮用水摄入1.15 ppm iAs。成年F1和F2雄性接受精子质量评估和附睾转录组谱分析，随后进行差异表达和通路富集分析。发育期iAs暴露显著降低了F1雄性的精子浓度、总精子数和活力，而未暴露的F2雄性也观察到精子浓度和总精子数降低。在F1附睾中，大RNA分析鉴定出上皮重塑、炎症和应激反应通路的富集，同时氧化磷酸化和代谢通路受到抑制。小RNA谱分析显示线粒体tRNA丰度呈下降趋势。相比之下，F2附睾表现为精子发生和细胞周期相关通路的抑制，以及56个小RNA的差异表达，包括剪接体小核RNA、小核仁RNA和微小RNA。与Occludin基因敲除（Ocln?/?）小鼠（一种附睾不育的遗传模型）进行的独立转录组比较显示，21条F1相关Hallmark通路中有18条具有一致的富集方向，为F1发现提供了额外的通路水平支持。在F2中未观察到相当的一致性。据研究人员所知，这是首个跨两代对发育期iAs暴露的附睾大RNA和小RNA响应进行的整合分析。这些发现鉴定了与持续性和跨代生殖异常相关的独特附睾分子特征，并突出附睾作为发育期环境响应的潜在重要部位。
**研究背景与科学问题**
无机砷（iAs）是全球范围内广泛存在的环境污染物，据估计全球108个国家超过2.3亿人通过饮用水慢性暴露于超过世界卫生组织推荐限值（10 ppb）的砷浓度。iAs是毒性最强且环境持久性最高的砷化学形态，可通过污染水源、食物和工业途径接触。慢性砷暴露与癌症、皮肤病变、心血管疾病、糖尿病及生殖功能障碍相关。健康与疾病的发育起源（DOHaD）假说提出，敏感发育窗口期的环境暴露可诱导持久性生物学改变并在生命后期显现。产前和出生后早期发育阶段，毒物可改变DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA表达，产生持久的分子印记。砷的毒性机制涉及氧化应激、DNA损伤、线粒体功能障碍、炎症及PI3K/Akt、NF-κB、MAPK和一氧化氮信号通路紊乱。近期研究进一步提示小非编码RNA介导环境iAs暴露的长期生物学后果。
男性生殖毒性是砷暴露的已知后果。实验研究表明砷可损害精子发生、干扰内分泌信号、诱导生殖细胞凋亡并改变涉及精子活力和运动性的基因。砷还可蓄积于男性生殖组织包括睾丸、前列腺、精囊和附睾。然而，大多数研究集中于睾丸效应，对附睾——在睾丸后精子成熟和功能中发挥关键作用的组织——关注相对较少。除经典的精子成熟功能外，附睾已被认为是精子分子组成的关键调控者。在附睾转运过程中，精子通过被称为附睾体（epididymosomes）的细胞外囊泡获得蛋白质、代谢物和多种小RNA。虽然PIWI相互作用RNA（piRNAs）在精子发生中占主导，但精子在附睾成熟过程中获得大量转运RNA片段（tRFs）、微小RNA（miRNAs）和核糖体来源小RNA（rsRNAs）。这些RNA与胚胎发育相关，可能参与父源环境暴露的生物学效应。因此，附睾RNA群体的改变可能为环境毒物与生殖功能障碍之间的机制联系提供重要见解。常规RNA测序流程主要针对大RNA转录本优化，由于RNA选择和文库制备偏倚，对短非编码RNA的represention可能有限。因此，专门的小RNA测序可提供常规大RNA测序未捕获的互补信息，这对附睾尤为重要。尽管环境表观遗传学和父源效应日益受到关注，发育期砷暴露对附睾转录组的影响仍基本未被探索，尤其是附睾大RNA（≥200 nt）和小RNA（≤200 nt）群体的整合分析尚未见报道。评估两种RNA组分至关重要，因为附睾小RNA动态转移至成熟精子，作为关键父源表观遗传继承载体调控早期胚胎发育。因此，研究人员探究了妊娠和哺乳期低剂量iAs暴露是否改变直接暴露的成年雄性子代（F1）的精子质量和附睾大、小RNA谱，并进一步检查其未暴露的儿子（F2）是否也观察到生殖和附睾分子改变。
**关键技术方法**
研究人员建立了跨F1和F2两代的小鼠模型：F0母鼠在妊娠和哺乳期（E0至P21）通过饮用水暴露于1.15 ppm iAs（2 mg/L亚砷酸钠），F1雄性在断奶后移至无砷饮水，成年后（约105天）评估精子质量并与未暴露雌性交配产生F2。精子质量采用计算机辅助精子分析（CASA）系统评估。附睾组织RNA提取后按转录本大小分为大RNA（>200 nt）和小RNA（<200 nt）两个组分分别建库测序。大RNA采用STAR比对和featureCounts定量，小RNA采用Bowtie比对至自定义整合注释（GENCODE vM25合并tRNAscan-SE和piRNAdb数据库）。差异表达分析使用DESeq2（FDR<0.1，|log2FC|>0.58），通路分析采用基因集富集分析（GSEA）针对MSigDB Hallmark基因集。miRNA靶预测使用multiMiR包跨14个数据库查询。独立验证数据集为Occludin基因敲除（Ocln
?/?）小鼠附睾转录组（GSE166141，每组N=3）。
**研究结果**
**两代发育期iAs暴露模型的建立**：研究人员建立了涵盖F1和F2谱系的两代小鼠模型，F0母鼠在妊娠和哺乳期（E0-P21）暴露于1.15 ppm iAs，该六周暴露窗口特意选择以涵盖F1雄性生殖发育的关键阶段包括原始生殖细胞（PGC）特化、表观遗传擦除和早期性腺形态发生。F1雄性断奶后移至无砷饮水至性成熟，部分用于附睾组织和成熟精子采集，部分与未暴露C57BL/6J雌性交配产生F2。F2雄性从未直接暴露于iAs，代表真正的未暴露谱系。
**发育期iAs暴露引起F1精子多参数表型缺陷并与跨代精子生成减少相关**：在直接暴露的F1代，发育期iAs暴露导致精子质量和功能的多参数严重损害，暴露F1雄性精子浓度和总精子数显著降低（p<0.05），运动性谱广泛受损，总体活力、前向运动、中等前向运动和非前向运动队列均显著下降，前向运动评分和平均轨迹速度评分降低（p<0.05或p<0.01），完全不运动精子百分比显著升高（p<0.05）。在F2雄性中，前向运动和速度参数显示部分非显著恢复，但精子浓度和总精子数相比对照组仍显著降低（p<0.005），表明精子生成缺陷跨代持续存在。
**发育期iAs暴露诱导成年F1附睾大RNA组分的协调改变**：F1附睾高通量RNA测序后，差异基因表达（DGE）分析未检测到符合预定显著性标准的单个转录本（FDR<0.1，|log2FC|>0.58）。GSEA揭示F1附睾广泛的通路水平改变：上皮-间质转化（EMT）、顶端连接、缺氧、IL2-STAT5信号、IL6-JAK-STAT3信号和UV响应等上皮重塑和细胞应激相关基因集显著富集；反之，氧化磷酸化和其他代谢通路显著抑制，与线粒体功能受损一致。
**未暴露F2雄性表现独特的附睾大RNA转录组改变**：F2代GSEA鉴定出炎症和应激相关通路富集包括IL6/JAK/STAT3和TNF-α/NF-κB信号，同时细胞周期调控、精子发生和其他生殖过程相关通路受到抑制。差异基因表达分析鉴定出三个显著下调的转录本，均注释为预测的前体miRNA（pre-miRNAs；ENSMUSG00000076281.1、ENSMUSG00000088609.1和ENSMUSG00000076258.1），基于这些转录本的层次聚类清晰地将F2动物按父源暴露谱系分开。
**发育期iAs暴露与附睾小RNA的世代特异性失调相关**：全局sRNA生物型组成在各组间大致相似，rRNA占主导（约60-65%），其次为线粒体tRNA（Mt_tRNAs；约8-14%）、小核RNA（snRNAs；约6-9%）、小核仁RNA（snoRNAs；约6-9%）和miRNA（约3-4%）。双因素方差分析显示大多数主要生物型无显著处理效应，但Mt_tRNA占总小RNA reads的比例在iAs谱系动物中较低（处理主效应p=0.020）。按世代分别检验DESeq2归一化计数显示F1小鼠Mt-tRNA丰度呈下降趋势（p=0.074），而F2无差异（p=0.44）。差异表达分析显示直接暴露的F1代无统计学显著差异表达sRNA，而未暴露的F2后代鉴定出56个显著差异表达sRNA转录本（46个上调、10个下调），上调部分以小核RNA（snRNAs）为主，占46个上调转录本中的38个（82.6%），包括多个参与剪接体功能和RNA加工的RNA。对差异表达snRNA和snoRNA按类型分类鉴定出39个失调snRNA和snoRNA，绝大多数在iAs谱系中上调，其中97.4%（38/39）为剪接体组分snRNA。对F2 iAs谱系差异表达miRNA的预测靶基因功能富集分析显示靶基因富集于RNA调控通路包括mRNA代谢过程、mRNA分解代谢、RNA稳定性和mRNA稳定性调控，以及发育生长、神经发生、突触组织和活性、树突发育、小GTP酶介导信号和肌肉分化等类别。
**F1附睾特征与附睾不育独立遗传模型趋同**：与Ocln
?/?小鼠独立数据集比较，F1砷分析中显著的21条Hallmark通路中有18条在Ocln
?/?数据集中表现一致的富集方向，归一化富集评分正相关（Pearson r=0.75，p=7.9×10
?5；Spearman ρ=0.46，p=0.036），方向一致性显著（单侧二项检验p=7.4×10
?4）。相比之下，对F2代显著的17条通路进行相同分析仅得到与Ocln
?/?特征的弱而非显著相关（Pearson r=0.25；Spearman ρ=0.14）。三向重叠分析显示F1与Ocln
?/?独特共享11条通路，主要以上皮重塑（如EMT、顶端连接）和细胞信号（如TGF-β、KRAS）为特征；其余6条通路在三个模型间交叉，以共享炎症信号（IL6/JAK/STAT3、TNF-α）和氧化磷酸化抑制为突出特征。
**讨论与结论**
本研究提供了跨两代附睾大RNA和小RNA对发育期iAs暴露响应的整合评估。发育期暴露与直接暴露F1雄性精子浓度、总精子数和活力降低相关，未暴露F2雄性也观察到精子浓度和总精子数降低。这些生殖改变伴随世代特异性附睾分子改变。暴露仅限于妊娠和哺乳期而生殖异常持续至成年，符合DOHaD框架。F1附睾转录组中EMT、顶端连接、缺氧和炎症信号通路的富集提示附睾上皮组织和稳态的持久改变；氧化磷酸化抑制与上皮和炎症通路改变的汇聚提示附睾代谢和结构alterations。F2雄性尽管从未直接暴露于iAs，仍表现精子浓度和总精子数降低，且附睾显示比F1更广泛的转录组响应，包括精子发生、E2F靶点和G2/M检查点通路抑制以及IL6/JAK/STAT3和TNF-α/NF-κB信号富集。F2转录组响应幅度更大不一定表示生殖毒性更大，因为F2精子活力和速度未显著改变而F1显示更广泛的精子功能损害。小RNA发现提供了附睾响应的额外重要维度：F1附睾中观察到线粒体tRNA丰度下降趋势与氧化磷酸化抑制平行；F2附睾表现广泛小RNA失调，56个差异表达小RNA中约82.6%上调转录本为snRNAs，许多与剪接体RNA加工相关。与Ocln
?/?模型的比较为F1通路水平发现提供了独立支持，但F2未观察到相当的一致性。研究存在若干局限性：研究建立的是关联而非因果机制；转录组分析基于全附睾组织无法区分细胞类型特异性贡献；附睾体或成熟精子中的改变RNA未直接定量；改变RNA的功能意义尚待实验验证；观察到的精子质量变化幅度相对温和且不能解释为生育力降低的证据。结论：发育期iAs暴露与两代雄性持续性生殖损害和独特附睾RNA改变相关，F1响应主要以上皮、炎症和线粒体通路改变为特征，而F2雄性表现涉及精子发生、细胞周期调控和多类小调控RNA的更广泛改变。这些发现支持DOHaD框架下F1效应以及父源发育期暴露与F2生殖和附睾表型改变之间的跨代关联。未来整合附睾组织、附睾体和成熟精子以及细胞特异性和功能方法的研究对确定改变RNA群体是否直接贡献于精子功能障碍或跨代生殖效应至关重要。
